本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是進(jìn)行vdr基因rs2228570位點多態(tài)性的分型檢測方法。

背景技術(shù)：

維生素d是脂溶性的類固醇類激素，是人體不可或缺的一種維生素，人體內(nèi)的維生素d可通過有限的食物或皮膚在陽光照射下合成獲得。維生素d的典型生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷代謝，它與鈣、磷共同作用，可調(diào)節(jié)發(fā)育，強(qiáng)化骨骼和牙齒，有效的預(yù)防佝僂病和骨質(zhì)疏松的發(fā)生。此外維生素d還具有調(diào)節(jié)生殖、免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)等功能。

維生素d生物功能的發(fā)揮，需要通過vdr蛋白的介導(dǎo)。vdr蛋白與維生素d結(jié)合，可激活人體重要的鈣調(diào)節(jié)激素骨化三醇的活性，促進(jìn)腸道對鈣的吸收并調(diào)節(jié)骨的無機(jī)鹽代謝。研究發(fā)現(xiàn)rs2228570位點位于vdr蛋白翻譯的起始位點，位點變異將導(dǎo)致合成vdr蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因而影響其生物學(xué)功能的正常發(fā)揮。若體內(nèi)vdr蛋白結(jié)構(gòu)異常，將會影響維生素d與vdr的結(jié)合，因而影響維生素d生物學(xué)功能的正常發(fā)揮，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫狀態(tài)失常，骨骼健康受損。研究表明，vdr基因的多態(tài)性與骨密度之間存在相關(guān)性，影響青少年骨量的形成，此外vdr基因變異與骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)疏松性骨折、前列腺癌、乳腺癌、甲狀旁腺激素分泌異常，糖尿病和冠心病等也有相關(guān)性。因此，建立簡單、快捷的鈣代謝關(guān)鍵基因vdr多態(tài)性位點的檢測方法，能檢測出鈣及維生素d疾病發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出相關(guān)高危人群，有針對性的進(jìn)行指導(dǎo)，對于疾病的預(yù)防、特別是保障青少年和婦女群體的安全健康具有重要的意義。目前，基因多態(tài)性檢測的方法主要有最常用的基因多態(tài)性檢測方法為測序法，該方法優(yōu)勢是可以同時進(jìn)行高通量多位點的檢測，但其操作復(fù)雜耗時長且靈敏度低，容易出現(xiàn)樣本間交叉污染且不能實現(xiàn)樣本的快速檢測；高分辨率溶解曲線法快速、簡便、經(jīng)濟(jì)實用，但是它對儀器要求高，需要具有安裝高分辨率軟件、溫度比較敏感的機(jī)器才能使用，臨床推廣存在困難。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種重復(fù)性好、靈敏度高的進(jìn)行vdr基因rs2228570位點多態(tài)性的分型檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

進(jìn)行vdr基因rs2228570位點多態(tài)性的分型檢測方法，采用vdr基因特異性的引物seq1和seq2擴(kuò)增vdr基因片段，同時在vdr基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計vdr基因特異性taqman探針seq3-fam-a和seq4-vic-g；若位點為a，則vdr基因特異性taqman探針seq3-fam-a釋放fam熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認(rèn)位點為a；若位點為g，則vdr基因特異性taqman探針seq4-vic-g釋放vic熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認(rèn)位點為g，最終通過fam/vic信號的比值來判斷位點基因型；

所述vdr基因特異性的引物seq1的核苷酸序列號如下：

5′-cctgcttgctgttcttac-3′；

所述vdr基因特異性的引物seq2的核苷酸序列號如下：

5′-caaagtctccagggtcag-3′；

所述vdr基因特異性taqman探針seq3-fam-a的核苷酸序列號如下：

fam-5′-ccgccattgcctccatc-3′；

所述vdr基因特異性taqman探針seq4-vic-g的核苷酸序列號如下：

vic-5′-cgccattgcctccgtc-3′。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明是基于基因特異性pcr結(jié)合taqman探針判斷基因snp位點分型的方法，本發(fā)明采用vdr特異性的基因擴(kuò)增和taqman探針，基于taqman探針定量pcr方法進(jìn)行目的基因分型檢測具有簡便快捷，重復(fù)性高，靈敏度高，特異性好的特點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中人vdr-rs2228570位點aa基因型特異性片段擴(kuò)增曲線示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例中人vdr-rs2228570位點ag基因型特異性片段擴(kuò)增曲線示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例中人vdr-rs2228570位點gg基因型特異性片段擴(kuò)增曲線示意圖。

圖4為本發(fā)明實施例中人vdr-rs2228570位點的檢測結(jié)果分布示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

請參閱圖1-4，進(jìn)行vdr基因rs2228570位點多態(tài)性的分型檢測方法，采用vdr基因特異性的引物seq1和seq2擴(kuò)增vdr基因片段，同時在vdr基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計vdr基因特異性taqman探針seq3-fam-a和seq4-vic-g；若位點為a，則vdr基因特異性taqman探針seq3-fam-a釋放fam熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認(rèn)位點為a；若位點為g，則vdr基因特異性taqman探針seq4-vic-g釋放vic熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認(rèn)位點為g，最終通過fam/vic信號的比值來判斷位點基因型；

所述vdr基因特異性的引物seq1的核苷酸序列號如下：

5′-cctgcttgctgttcttac-3′；

所述vdr基因特異性的引物seq2的核苷酸序列號如下：

5′-caaagtctccagggtcag-3′；

所述vdr基因特異性taqman探針seq3-fam-a的核苷酸序列號如下：

fam-5′-ccgccattgcctccatc-3′；

所述vdr基因特異性taqman探針seq4-vic-g的核苷酸序列號如下：

vic-5′-cgccattgcctccgtc-3′。

實施例：

（1）測試用正常人基因組dna制備：

采取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提制備，正常人基因組dna濃度稀釋到10ng/μl。

（2）pcr特異性引物和探針設(shè)計合成

根據(jù)人vdr基因序列設(shè)計合成基因特異性引物seq1、seq2和vdr特異性taqman基因探針標(biāo)記seq3-fam-a和seq4-vi-g。

（3）vdr定量pcr檢測

1）引物探針混合物配置：

2）反應(yīng)體系：引物探針混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，標(biāo)準(zhǔn)模板1.5μl，ddh2o9.5μl。

3）定量pcr儀：abi7500。

4）反應(yīng)條件：95℃、2min；95℃、15s——60℃、32s，42循環(huán)。

（4）基因驗證結(jié)果讀取：

參見圖1，圖1中橫坐標(biāo)是以0-42的偶數(shù)標(biāo)示的循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)是相應(yīng)的熒光信號，檢測到vic、fam信號確定為擴(kuò)增成功。根據(jù)樣本fam/vic比值確定具體樣本的基因型。

本發(fā)明是基于基因特異性pcr結(jié)合taqman探針判斷基因snp位點分型的方法，本發(fā)明采用vdr特異性的基因擴(kuò)增和taqman探針，基于taqman探針定量pcr方法進(jìn)行目的基因分型檢測具有簡便快捷，重復(fù)性高，靈敏度高，特異性好的特點。

上面對本專利的較佳實施方式作了詳細(xì)說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。