本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻抗瘟病基因pigm的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由子囊菌[magnaporthegrisea(hebert)barr]引起的稻瘟病是世界范圍內(nèi)水稻生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，病害可以發(fā)生在水稻的各個生長時期，嚴(yán)重時減產(chǎn)40％-50％，甚至顆粒無收，是全球糧食安全的限制因子之一。大量施用化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境造成污染，控制這個病害最經(jīng)濟有效的方法是發(fā)掘和利用新的廣譜持久抗病資源進行選育廣譜抗病新品種。

稻瘟病抗性是典型的數(shù)量性狀，受多基因控制，且易受環(huán)境影響。常規(guī)抗病育種中，抗病性鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確導(dǎo)致育種效率偏低。分子標(biāo)記輔助選擇是一種利用與抗性基因緊密連鎖標(biāo)記或者基因內(nèi)功能標(biāo)記，在后代中結(jié)合基因型和表型鑒定對目標(biāo)性狀進行選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該方法不僅可大大縮短育種年限，提高育種效率，而且還節(jié)約了大量的人力、物力成本。pigm是一個廣譜抗稻瘟病基因，比公認(rèn)的廣譜抗性基因pi1,pi2,pi3的抗譜更廣；pigm來源于四川地方品種谷梅4號，對收集自不同地區(qū)和國家的30個強致病菌株中的29個表現(xiàn)高抗或免疫，于2017年被成功克隆(dengetal.,2017)，從機制上解釋了pigm介導(dǎo)的抗病具有持久性，利用pigm改良選育的品種既有廣譜持久抗病性又不影響最終的產(chǎn)量，在抗稻瘟病育種方面有很大的應(yīng)用價值，開發(fā)pigm基因的功能性標(biāo)記對充分利用該基因，進一步改良水稻稻瘟病抗性有著重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提出一種水稻抗稻瘟病基因pigm的分子標(biāo)記、其的正反引物及其應(yīng)用。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的技術(shù)方案是：一種水稻抗瘟病基因pigm的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記編號為gm-4，所述分子標(biāo)記gm-4的正反引物序列為：

gm-4f：5’-cttgtctctctcgccctctca-3’

gm-4r：5’-aggagtcaggacttagggtttct-3’。

本發(fā)明提供了分子標(biāo)記gm-4的用途：所述分子標(biāo)記gm-4用于水稻抗瘟病基因pigm的鑒定和/或抗瘟病水稻的輔助選擇育種。

進一步的，所述用于水稻抗瘟病基因pigm的鑒定包括以下實驗步驟：

i、提取供試水稻樣品基因組；

ii、利用所述分子標(biāo)記gm-4的正反引物組合對步驟i中所提取基因組進行pcr擴增，獲得擴增產(chǎn)物；

iii、通過2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測所述擴增產(chǎn)物，如果有515bp的單條帶，則表示所述樣品為pigm基因純合。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過利用核苷酸序列差異設(shè)計pigm基因的功能分子標(biāo)記，不存在遺傳交換，準(zhǔn)確性高；直接用于瓊脂糖凝膠電泳檢測，更為簡便，利用該標(biāo)記進行抗稻瘟病水稻輔助選擇能縮短育種周期，提高效率。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的一種水稻抗瘟病基因pigm的分子標(biāo)記及其應(yīng)用作進一步說明。

圖1是本發(fā)明中分子gm-4標(biāo)記對23個水稻品種的電泳檢測圖。

注：1-23分別表示水稻品種1：旱恢3號，2：bl6，3：滬旱1b，4：b5，5：sagc4，6：日本晴，7：黃華占，8：603b，9：0412，10：389b，11：r9，12：華15b，13：r15，14：滬旱9b，15：r37，16：滬旱11b，17：n632s，18：秀水123，19：r49，20：湘晴，21：滬旱7b、22：75-1-127，23：谷梅4號。m表示d2000marker。

具體實施方式

實施例1：pigm基因分子標(biāo)記的開發(fā)

(1)、供試材料。

抗病水稻品種：谷梅4號。

感病水稻品種：1：旱恢3號，2：bl6，3：滬旱1b，4：b5，5：sagc4，6：日本晴，7：黃華占，8：603b，9：0412，10：389b，11：r9，12：華15b，13：r15，14：滬旱9b，15：r37，16：滬旱11b，17：n632s，18：秀水123，19：r49，20：湘晴，21：滬旱7b、22：75-1-127。

(2)、水稻基因組dna提取方法參考樓巧君(2006)中所述方法。(樓巧君,陳亮,羅利軍.三種水稻基因組dna快速提取方法的比較[j].分子植物育種,2006,3(5):749-752)

(3)、基因分子標(biāo)記gm-4的開發(fā)：pigm是一個已克隆的廣譜抗稻瘟病基因，位于第6染色體，與pi-9,pi-z,pi2等互為等位的關(guān)系，pigm的全基因組序列來自genbank數(shù)據(jù)庫，收錄號為ku904633.2，比對發(fā)現(xiàn)，谷梅4號中pigm基因從第92245到93120個堿基的876bp片段在相應(yīng)的參考基因組日本晴感病等位基因(dq454158.1)中是缺失的(見表1)且此片段還可以與第12染色體(21574111bp-21573243bp)匹配，因此單獨擴增此片段無法準(zhǔn)確判斷是否含有pigm基因，因此在此片段前面設(shè)計一條正向引物，片段中間設(shè)計一條反向引物，在含有pigm基因的抗病品種中能正反引物能配對擴增，而在不含pigm基因的感病品種中無法匹配不能擴增。

表1：日本晴與谷梅4號的部分堿基比較

說明：*號標(biāo)注出相同堿基，-號表示缺失堿基。

(4)、根據(jù)核苷酸序列差異，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計引物gm-4，其正反引物序列為：

gm-4f：5’-cttgtctctctcgccctctca-3’

gm-4r：5’-aggagtcaggacttagggtttct-3’。

實施例2：pigm基因分子標(biāo)記的親本多態(tài)性檢測

(1)、提取供試水稻品種基因組，提取方法為常規(guī)ctab法。供試水稻品種分別為：1：旱恢3號，2：bl6，3：滬旱1b，4：b5，5：sagc4，6：日本晴，7：黃華占，8：603b，9：0412，10：389b，11：r9，12：華15b，13：r15，14：滬旱9b，15：r37，16：滬旱11b，17：n632s，18：秀水123，19：r49，20：湘晴，21：滬旱7b、22：75-1-127、23：谷梅4號滬旱1b、秀水123、滬旱7b、黃華占、中組14、滬旱11b、日本晴和75-1-127。

(2)、利用功能標(biāo)記gm-4對供試水稻品種進行pcr擴增，pcr擴增體系為：20ng水稻基因組dna模板，10ultaqpcrmastermix(天根生化科技(北京)有限公司)，10um的前后引物各1ul，補充ddh2o至20ul。pcr反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min，然后按95℃30s，58℃下30s，72℃下1min進行30個循環(huán)，最后72℃下延伸5min。

(3)、取pcr產(chǎn)物8ul上樣于2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖1所示，抗病水稻親本谷梅4號擴增出516bp的單條帶，在其他感病水稻品種中均無法擴增得到516bp的條帶，電泳條帶清晰，差異明顯。

實施例3：pigm基因分子標(biāo)記的驗證與應(yīng)用

以攜帶pigm基因的抗病親本谷梅4號為供體，節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3號為受體，改良旱恢3號的稻瘟病抗性。旱恢3號/谷梅4號//旱恢3號的bc1f2代群體共384個單株種植于井岡山稻瘟病自然鑒定基地，首先利用pigm基因功能標(biāo)記gm-4對384個單株的基因組dna進行pcr擴增，產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠進行電泳分型，檢測到280個單株有516bp的條帶，表示這些單株含有pigm基因，剩余的104個單株沒有擴增出516bp條帶，符合統(tǒng)計學(xué)上的3：1的比例。稻瘟病抗性鑒定結(jié)果顯示，含pigm基因的280個單株均表現(xiàn)出抗病水平，不含pigm基因的單株表現(xiàn)出感病表型。

因此表明可以利用該標(biāo)記進行水稻抗瘟病基因pigm的鑒定和/或抗瘟病水稻的輔助選擇育種。

本發(fā)明的不局限于上述實施例，本發(fā)明的上述各個實施例的技術(shù)方案彼此可以交叉組合形成新的技術(shù)方案，另外凡采用等同替換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍內(nèi)。