本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒的引物組、探針組及其試劑盒。

背景技術(shù)：

流感是一種病毒性感染，主要影響鼻、喉、支氣管，并偶爾影響肺部。感染通常持續(xù)約一周，特征是突發(fā)高熱、肌肉酸痛、頭痛和嚴(yán)重不適、干咳、喉痛和鼻炎。通過染病者咳嗽或打噴嚏時(shí)產(chǎn)生的飛沫和微粒，病毒很容易在人與人之間傳播。在季節(jié)性流行期間，流感往往迅速傳播。多數(shù)染病者在一至二周內(nèi)康復(fù)，無需進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療。但是，對(duì)幼兒、老年人和患有其它嚴(yán)重病癥者，感染可根據(jù)內(nèi)在情況導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥、肺炎和死亡。季節(jié)性流感病毒以甲型流感病毒感染最多，其次為乙型流感病毒。其中甲型流感病毒中又以h1亞型和h3亞型病毒株為流行株或交替流行。目前，在臨床和實(shí)驗(yàn)室，免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)流感病毒最為常用。較常見的為elisa檢測(cè)試劑、熒光免疫檢測(cè)試劑以及實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)試劑。其中以實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)試劑為代表的核酸檢測(cè)產(chǎn)品一般是以咽拭子為樣本，先進(jìn)行樣本核酸提取處理操作，再進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增操作，兩個(gè)步驟缺一不可。直接擴(kuò)增法是一種在擴(kuò)增反應(yīng)體系和核心原材料進(jìn)行優(yōu)化改造的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了病毒裂解、核酸釋放、rna逆轉(zhuǎn)錄、pcr擴(kuò)增步驟同管進(jìn)行的技術(shù)方法，現(xiàn)有技術(shù)缺乏檢測(cè)多種流感病毒的一管反應(yīng)的試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒的引物組、探針組。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供含有所述引物組的試劑盒。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒的引物組、探針組，所述引物組的序列如seqidno：1～8所示，探針組的序列如seqidno：9～12所示；所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒、季節(jié)性流感病毒h1亞型及h3亞型。

本發(fā)明還提供一種同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒的試劑盒，所述試劑盒含有所述的引物組和探針組；所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒、季節(jié)性流感病毒h1亞型及h3亞型。

通過配制rt-pcr所需的各個(gè)試劑，將核酸提取和rt-pcr結(jié)合進(jìn)行一步反應(yīng)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種試劑盒，所述試劑盒由直接rt-pcr反應(yīng)液a、直接rt-pcr反應(yīng)液b、樣本稀釋液、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品組成。

其中，引物組和探針組在直接rt-pcr反應(yīng)液a中，優(yōu)選地，所述直接rt-pcr反應(yīng)液a還含有tris-hcl、mgcl2、np-40、tween20、kcl。

更優(yōu)選地，所述直接rt-pcr反應(yīng)液a的組成為：0.2～0.5μmseqidno：1～8所示引物、0.1～0.3μmseqidno：9～12所示探針、10～60mmtris-hcl、2～6mmmgcl2、5～12mmnp-40、2～6mmtween20、20～38mmkcl。

優(yōu)選地，所述直接rt-pcr反應(yīng)液b含有逆轉(zhuǎn)錄酶、taqdna聚合酶、dntps和rna酶抑制劑。

更優(yōu)選地，直接rt-pcr反應(yīng)液b的組成為：2.5u/反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶、5u/反應(yīng)的taqdna聚合酶、0.6mm/反應(yīng)的dntps、20u/反應(yīng)的rna酶抑制劑。

優(yōu)選地，所述樣本稀釋液含有tris-hcl、edta；tris-hcl的濃度為80～100mm，edta的濃度為0.2～6mm；所述陽性質(zhì)控品為甲型流感病毒、乙型流感病毒、季節(jié)性流感病毒h1亞型及h3亞型的擴(kuò)增片段，含量為1.0e5copies/ml。

所述陰性質(zhì)控品為生理鹽水。

作為一種具體的實(shí)施方式，本發(fā)明所述直接rt-pcr反應(yīng)液a的組成為：上述引物組和探針組、10mmtris-hcl（ph7.5）、2mmmgcl2、0.2%（v/v）np-40，0.01%（v/v）tween20，30mmkcl，其余為depc水。其中探針5’端分別任意標(biāo)記fam、hex、texasred以及cy5中的任一種，3’端標(biāo)記bhq1。

所述樣本稀釋液的組成為：80mmtris-hcl（ph8.5）、0.2mmedta溶液。

所述陰性質(zhì)控品成分組成為：生理鹽水。

本發(fā)明還提供利用所述試劑盒檢測(cè)多種病毒的方法，包括以下步驟：

（1）取200μl樣本稀釋液加入咽拭子樣本中渦旋震蕩10s以充分浸潤和洗脫病毒顆粒得浸洗液；

（2）取rt-pcr反應(yīng)液a28μl，rt-pcr反應(yīng)液b2μl混合，作為1個(gè)rt-pcr反應(yīng)液加到pcr反應(yīng)管中；

（3）從步驟（1）中取20μl浸洗液加入上述pcr反應(yīng)管中；

（4）將pcr反應(yīng)管置于實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)條件為60℃10min，95℃，10min，1個(gè)循環(huán)；95℃，15s，60℃，30s（收集熒光信號(hào)），45個(gè)循環(huán)。熒光檢測(cè)器選擇fam、vic、texasred、cy5；

（5）結(jié)果判定：在擴(kuò)增界面查看fam、vic、texasred、cy5四個(gè)通道對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線，若有擴(kuò)增曲線，則判定對(duì)應(yīng)熒光通道相應(yīng)的檢測(cè)目標(biāo)為陽性，fam通道對(duì)應(yīng)甲型流感病毒，vic通道對(duì)應(yīng)乙型流感病毒，texasred通道對(duì)應(yīng)季節(jié)性流感病毒h1亞型，cy5對(duì)應(yīng)季節(jié)性流感病毒h3亞型。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首先提供了一種同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒的引物組、探針組，所述引物組的序列如seqidno：1～8所示，探針組的序列如seqidno：9～12所示；所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒、季節(jié)性流感病毒h1亞型及h3亞型；在此基礎(chǔ)上，提供一種同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒的試劑盒，本發(fā)明將直接擴(kuò)增以及多重pcr結(jié)合在一起，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)疑似流感病例或流行病學(xué)調(diào)查咽拭子樣本的直接rt-pcr，比傳統(tǒng)方法省去核酸提取步驟，利于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化一體化檢測(cè)，提高效率。在直接擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，又實(shí)現(xiàn)了一管多檢的鑒別目的，在快速鑒別檢測(cè)流感病毒感染者應(yīng)用方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)成本相對(duì)較低。如果搭配便攜式熒光檢測(cè)儀可應(yīng)用于應(yīng)對(duì)疫情現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有廣泛和實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為質(zhì)控品擴(kuò)增曲線圖。

圖2為甲型流感病毒h1亞型樣本的擴(kuò)增曲線圖。

圖3為甲型流感病毒h3亞型樣本的擴(kuò)增曲線圖。

圖4為乙型流感病毒樣本的擴(kuò)增曲線圖。

圖5為甲型流感病毒h1亞型樣本的擴(kuò)增曲線圖。

圖6為甲型流感病毒h3亞型樣本的擴(kuò)增曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的意義相同。

實(shí)施例1

針對(duì)流感病毒iva，ivb，h1和h3，分別設(shè)計(jì)特異性引物，其引物序列如下：

iva-f：5’-cttctaagcgaggtcgaacc-3’

iva-r：5’-gtcttagccattcgatgagt-3’

ivb-f：5’-cgacatccaaagccaattcg-3’

ivb-r：5’-cggtgctcttgaccaaattgc-3’

h1-f：5’-cctcagggagctataaacaga-3’

h1-r：5’-tgacctactttggacactctcc-3’

h3-f：5’-caactgcaattctgaatgcatc-3’

h3-r：5’-gatcctgtttacattttggaatg-3’

針對(duì)每組引物，設(shè)計(jì)其特異性探針，序列如下：

ivap：5’-caggccccctcaaagccg-3’（5’fam；3’bhq1）

ivbp：5’-agactcccaccgcagtttcagc-3’（5’hex；3’bhq1）

h1p：5’-cctttccagaatgtacacccagtc-3’（5’texasred；3’bhq1）

h3p：5’-ccaaatggaagcattcccaatgac-3’（5’cy5；3’bhq1）

rt-pcr反應(yīng)體系為：rt-pcr反應(yīng)液a28μl，rt-pcr反應(yīng)液b2μl，樣本洗脫液20μl。

rt-pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃10min，95℃，10min，1個(gè)循環(huán)；95℃，15s，60℃，30s（收集熒光信號(hào)），45個(gè)循環(huán)。熒光檢測(cè)器選擇fam、vic、texasred、cy5。

結(jié)果表明：樣本檢測(cè)為vic通道有擴(kuò)增曲線，判定為乙型流感病毒陽性。

對(duì)比例1

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1，唯一不同的是，所用的引物組和探針組序列如下：

iva-f’：cggaggacttgaatggaatgata

iva-r’：tgttttggagtaagtggaggtcc

ivb-f’：tggagctgcctatgaagacc

ivb-r’：ttgctggaacatggaaacc

h1-f’：gctcctgggaaatccagagt

h1-r’：tgggtaacacgtcccattgt

h3-f’：gattccgatatcaaaactcgg

h3-r’：aattttccattgatctggtcg

針對(duì)每組引物，設(shè)計(jì)其特異性探針，序列如下：

ivap’：tactgcttctccaagcgaatctctg

ivbp’：ctgatctaggcttgaattctgtgcc

h1p’：tcttcacagcaagctcatggtccta

h3p’：cctctttagatctgcagcttgtcc

結(jié)果表明：利用該對(duì)比例的引物組和探針組無法有效地全部檢測(cè)出這四種病毒。

對(duì)比例2

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1，唯一不同的是，所用的引物組和探針組序列如下：

iva-f’：atgagaatgggggacctcca

iva-r’：tcacttcttcaatcagccatcttat

ivb-f’：gatggcttcagtggactaaatcac

ivb-r’：attaatgaagggtcaagtccaactc

h1-f’：cccgtctattcaatctagaggc

h1-r’：gtgataaccgtaccatccatcta

h3-f’：tctaaagagcactcaagcagc

h3-r’：cccttctacttctgagaattcc

針對(duì)每組引物，設(shè)計(jì)其特異性探針，序列如下：

ivap’：agctgttctcgccattttccgtttc

ivbp’：atcattcatctgtgaatgcccaatc

h1p’：ccatcccccctcaataaagccg

h3p’：ttctcattggtcctttcaatcactc

結(jié)果表明：利用該對(duì)比例的引物組和探針組無法有效地全部檢測(cè)出這四種病毒。

實(shí)施例2試劑盒的組成和配制

一種同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒的試劑盒，含有：直接rt-pcr反應(yīng)液a、直接rt-pcr反應(yīng)液b、樣本稀釋液、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。

其中rt-pcr反應(yīng)液a組成為：實(shí)施例1所述四種流感病毒特異性的引物和探針序列（引物均為15pmol，探針均為10pmol）、10mmtris-hcl（ph7.5）、2mmmgcl2、0.2%（v/v）np-40，0.01%（v/v）tween20，30mmkcl，其余為depc水。

其中rt-pcr反應(yīng)液b組成為：逆轉(zhuǎn)錄酶（2.5u/反應(yīng)）、taqdna聚合酶（5u/反應(yīng)）、dntps（0.6mm/反應(yīng)）、rna酶抑制劑（20u/反應(yīng)）。

其中樣本稀釋液組成為：10mmtris-hcl（ph8.5）、0.2mmedta溶液。

其中陽性質(zhì)控品組成為：由含有四種流感病毒擴(kuò)增片段的質(zhì)粒（如seqidno：13）組成，含量為1.0e5copies/ml。

其中陰性質(zhì)控品成分組成為：生理鹽水。

利用該試劑盒檢測(cè)流感病毒的方法，樣本包括1個(gè)h1亞型咽拭子陽性樣本、1個(gè)h3亞型咽拭子陽性樣本、1個(gè)乙型流感病毒咽拭子陽性樣本、一個(gè)呼吸道合胞病毒咽拭子陽性樣本。包括以下步驟：

（1）取200μl樣本稀釋液加入咽拭子樣本中渦旋震蕩10s以充分浸潤和洗脫病毒顆粒；

（2）取rt-pcr反應(yīng)液a28μl，rt-pcr反應(yīng)液b2μl混合，作為1個(gè)rt-pcr反應(yīng)液加到pcr反應(yīng)管中；

（3）取20μl浸洗液加入上述pcr反應(yīng)管中；

（4）將pcr反應(yīng)管置于實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)條件為60℃10min，95℃，10min，1個(gè)循環(huán)；95℃，15s，60℃，30s（收集熒光信號(hào)），45個(gè)循環(huán)。熒光檢測(cè)器選擇fam、vic、texasred、cy5；

（5）結(jié)果判定：在擴(kuò)增界面查看fam、vic、texasred、cy5四個(gè)通道對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線，若有擴(kuò)增曲線，則判定對(duì)應(yīng)熒光通道相應(yīng)的檢測(cè)目標(biāo)為陽性，fam通道對(duì)應(yīng)甲型流感病毒，vic通道對(duì)應(yīng)乙型流感病毒，texasred通道對(duì)應(yīng)季節(jié)性流感病毒h1亞型，cy5對(duì)應(yīng)季節(jié)性流感病毒h3亞型。

以上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)的甲、乙型流感病毒核酸聯(lián)合測(cè)定試劑盒（熒光pcr法）、甲型流感病毒h1亞型及h3亞型核酸聯(lián)合測(cè)定試劑盒（熒光pcr法）兩種試劑作為樣本核酸提取后再擴(kuò)增的對(duì)照試劑盒檢測(cè)。

結(jié)果表明：市面上常用流感病毒分型鑒別檢測(cè)試劑至少需要兩個(gè)試劑盒共同完成；且核酸提取和擴(kuò)增兩個(gè)步驟共計(jì)需要時(shí)間為180min左右，而本發(fā)明所有操作共計(jì)需要105min；且擴(kuò)增檢測(cè)效果與對(duì)照試劑盒的檢測(cè)效果相當(dāng)。

sequencelisting

<110>南方醫(yī)科大學(xué)

<120>一種同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒的引物組、探針組及其試劑盒

<130>2017

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<213>4種流感病毒質(zhì)粒

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