本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，，更具體的說，涉及到一種乳腺癌特異性CTLs的制備方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌是全世界女性最常見的癌病之一，占新發(fā)癌癥的第三位，占因癌癥導(dǎo)致死亡的第五位，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7％～10％，占全部女性惡性腫瘤總數(shù)21％。乳腺癌每年約有7.9萬新病例，上升趨勢(shì)明顯，已經(jīng)成為當(dāng)前嚴(yán)重威脅女性健康和生命的一類疾病。研究乳腺癌的防治對(duì)策是擺在全世界科學(xué)工作者面前的重要任務(wù)。

目前，乳腺癌治療主要有手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療三種方法。手術(shù)治療，對(duì)于較早期的乳腺癌來說，是一種根治的方法，對(duì)較晚期的乳腺癌則常作為一種姑息性的治療手段，且術(shù)后患者多伴有一定的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量。化療，由于目前常用的藥物選擇性和特異性差，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)會(huì)殺傷正常的組織細(xì)胞，毒副作用強(qiáng)，尤其是消化功能受損和骨髓造血功能受抑制等反應(yīng)最為明顯，往往使乳腺癌患者因反應(yīng)嚴(yán)重而難以接受化療或不能堅(jiān)持完成整個(gè)療程。放療也存在著明顯的毒副反應(yīng)，且僅對(duì)年青且局部復(fù)發(fā)相對(duì)高危者的療效較好，而對(duì)老年患者和任何年齡局部復(fù)發(fā)的高危人群作用差。由于傳統(tǒng)治療方式的局限性、風(fēng)險(xiǎn)大、耗資高、藥物的選擇性差、毒副作用強(qiáng)、增加病人痛苦等缺點(diǎn)，研究者致力于尋找更加高效、低毒、特異性強(qiáng)的治療方法。

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)及臨床研究均提示機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有特異性清除腫瘤的作用。免疫療法成為腫瘤治療重要手段之一。其最大優(yōu)點(diǎn)是針對(duì)腫瘤細(xì)胞，最具有特異性，不損害正常細(xì)胞，治療效果為全身性，適用于治療早期和晚期的患者。免疫治療通過調(diào)節(jié)機(jī)體抗腫瘤各環(huán)節(jié)(免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、癌基因與抑癌基因、血管生成、精神因素等)的平衡，達(dá)到控制腫瘤或減輕治療相關(guān)副作用的目的。因此，乳腺癌治療正從傳統(tǒng)的治療方式向針對(duì)機(jī)制的多環(huán)節(jié)作用的高效、低毒、特異性強(qiáng)新型治療模式發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：提供一種乳腺癌特異性CTLs的制備方法，解決現(xiàn)有免疫療法治療乳腺癌的過程中，無法快速、大量的獲得殺傷作用強(qiáng)、體內(nèi)存活時(shí)間長(zhǎng)的免疫治療效應(yīng)細(xì)胞的問題。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案為：提供一種乳腺癌特異性CTLs的制備方法，包括如下步驟：

S100、融合細(xì)胞的制備：從乳腺癌患者自體癌組織分離出乳腺癌干細(xì)胞，使用乳腺癌患者自體的外周血體外培養(yǎng)獲得成熟DC細(xì)胞，將所述DC細(xì)胞與所述乳腺癌干細(xì)胞融合得到融合細(xì)胞；

S200、培養(yǎng)乳腺癌特異性CTLs：使用乳腺癌患者自體的外周血體外培養(yǎng)獲得T細(xì)胞，將所述T細(xì)胞與所述融合細(xì)胞按照10-20∶1的比例進(jìn)行混合，共同培養(yǎng)獲得乳腺癌特異性CTLs。

在本發(fā)明提供的乳腺癌特異性CTLs的制備方法中，所述步驟S100中還包括：

S101、乳腺癌干細(xì)胞的分離：將乳腺癌患者自體癌組織剪碎，經(jīng)過膠原酶消化、過濾、懸浮、混合血清、離心獲得乳腺癌干細(xì)胞；

S102、DC細(xì)胞的體外培養(yǎng)：從乳腺癌患者自體的外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞在含5-10％滅活的正常人AB血清的1640培養(yǎng)基里培養(yǎng)30-90min，吸去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用含800-2000U/ml GM/CSF、500-1000U/ml IL-4和5％正常人AB血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，獲得有樹突形狀的成熟DC細(xì)胞；

S103、細(xì)胞融合：將所述DC細(xì)胞與所述乳腺癌干細(xì)胞按照5-20∶1的比例進(jìn)行混合，離心去掉上清液，加入在37℃預(yù)溫的50％聚乙二醇1ml作用2-3分鐘，使腫瘤細(xì)胞與DC融合，用不含血清1640培養(yǎng)液輕輕混勻，離心去掉含有聚乙二醇上清液，獲得融合細(xì)胞。

在本發(fā)明提供的乳腺癌特異性CTLs的制備方法中，所述步驟S103之后還包括：

S104、融合細(xì)胞培養(yǎng)：所述融合細(xì)胞置于含有500-2000U/ml GM-CSF和含有10％自體血清的AIM-V培養(yǎng)液中，培養(yǎng)5-6天，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的狀況，進(jìn)行半量換液；

S105、細(xì)胞收集：收集培養(yǎng)獲得的融合細(xì)胞，經(jīng)200Gy輻照后備用。

在本發(fā)明提供的乳腺癌特異性CTLs的制備方法中，所述步驟S200中還包括：

S201、T細(xì)胞的體外培養(yǎng)：從乳腺癌患者自體的外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中用纖粘連蛋白來源的短肽包被過夜，補(bǔ)加100-1000IU/ml IFN-γ，置于37℃、5％CO₂濃度、飽和水蒸氣環(huán)境中培養(yǎng)；24小時(shí)后補(bǔ)加1000IU/ml IL-2、100-250ng/ml CD3 mAb、5-10ug/ml CD28 mAb；每2-3天補(bǔ)加含5％自體血漿、100-200IU/ml慶大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb的AIM-V完全培養(yǎng)液；

S202、乳腺癌特異性CTL的獲得：所述T細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，將所述T細(xì)胞與所述融合細(xì)胞按10-20∶1的比例進(jìn)行混合，共同培養(yǎng)，每2-3天補(bǔ)加含5％自體血漿、100-200IU/ml慶大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28mAb、500-2000IU/ml GM-CSF的AIM-V完全培養(yǎng)液，第12-14天收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

實(shí)施本發(fā)明，具有如下有益效果：使用兼具乳腺癌干細(xì)胞特性、DC細(xì)胞抗原傳遞性的融合細(xì)胞刺激T細(xì)胞，產(chǎn)生可以特異殺傷乳腺癌干細(xì)胞的CTLs，獲得的CTLs對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凋亡有明顯的促進(jìn)作用。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明乳腺癌特異性CTLs的制備方法較佳實(shí)施例的流程圖；

圖2為本發(fā)明乳腺癌特異性CTLs的制備方法的操作流程圖；

圖3為乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行具體描述。

殺傷性T細(xì)胞(CTLs：Cytotoxic T-cell lymphocytes)為一種特異T細(xì)胞，專門分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用。對(duì)某些病毒、腫瘤細(xì)胞等抗原物質(zhì)具有殺傷作用，與自然殺傷細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。使用CTLs特異性清除腫瘤的免疫療法在治療過程中最關(guān)鍵的是要獲得大量殺傷作用強(qiáng)、體內(nèi)存活時(shí)間長(zhǎng)的免疫治療效應(yīng)細(xì)胞。

本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于：通過乳腺癌患者自體癌組織分離出乳腺癌干細(xì)胞，然后利用細(xì)胞融合技術(shù)，將患者自體的樹突細(xì)胞(DC細(xì)胞:Dendritic Cell)與患者自體乳腺癌干細(xì)胞融合，獲得兼具乳腺癌干細(xì)胞特性、DC細(xì)胞抗原傳遞性的融合細(xì)胞，再刺激產(chǎn)生大量可以特異殺傷乳腺癌干細(xì)胞的殺傷性T細(xì)胞CTLs。將獲得的特異殺傷乳腺癌干細(xì)胞的CTLs回輸患者體內(nèi)，可以達(dá)到殺傷乳腺癌干細(xì)胞，防止復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的效果。

圖1為本發(fā)明乳腺癌特異性CTLs的制備方法較佳實(shí)施例的流程圖，如圖1所示，制備方法包括如下步驟：

S100、融合細(xì)胞的制備：從乳腺癌患者自體癌組織分離出乳腺癌干細(xì)胞，使用乳腺癌患者自體的外周血體外培養(yǎng)獲得成熟DC細(xì)胞，將所述DC細(xì)胞與所述乳腺癌干細(xì)胞融合得到融合細(xì)胞；

S200、培養(yǎng)乳腺癌特異性CTLs：使用乳腺癌患者自體的外周血體外培養(yǎng)獲得T細(xì)胞，將所述T細(xì)胞與所述融合細(xì)胞按照10-20∶1的比例進(jìn)行混合，共同培養(yǎng)獲得乳腺癌特異性CTLs。

圖2為本發(fā)明乳腺癌特異性CTLs的制備方法的操作流程圖，如圖2所示，所述步驟S100中還包括：

S101、乳腺癌干細(xì)胞的分離：將乳腺癌患者自體癌組織剪碎，經(jīng)過膠原酶消化、過濾、懸浮、混合血清、離心獲得乳腺癌干細(xì)胞；

S102、DC細(xì)胞的體外培養(yǎng)：從乳腺癌患者自體的外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞在含5-10％滅活的正常人AB血清的1640培養(yǎng)基里培養(yǎng)30-90min，吸去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用含800-2000U/ml GM/CSF、500-1000U/ml IL-4和5％正常人AB血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，獲得有樹突形狀的成熟DC細(xì)胞；

S103、細(xì)胞融合：將所述DC細(xì)胞與所述乳腺癌干細(xì)胞按照5-20∶1的比例進(jìn)行混合，離心去掉上清液，加入在37℃預(yù)溫的50％(體積分?jǐn)?shù))聚乙二醇1ml作用2-3分鐘，使腫瘤細(xì)胞與DC融合，用不含血清1640培養(yǎng)液輕輕混勻，離心去掉含有聚乙二醇上清液，獲得融合細(xì)胞；

S104、融合細(xì)胞培養(yǎng)：所述融合細(xì)胞置于含有500-2000U/ml GM-CSF和含有10％自體血清的AIM-V培養(yǎng)液中，培養(yǎng)5-6天，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的狀況，進(jìn)行半量換液；

S105、細(xì)胞收集：收集培養(yǎng)獲得的融合細(xì)胞，經(jīng)200Gy輻照后備用。

所述步驟S200中還包括：

S201、T細(xì)胞的體外培養(yǎng)：從乳腺癌患者自體的外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中用纖粘連蛋白來源的短肽包被過夜，補(bǔ)加100-1000IU/ml IFN-γ，置于37℃、5％CO₂濃度、飽和水蒸氣環(huán)境中培養(yǎng)；24小時(shí)后補(bǔ)加1000IU/ml IL-2、100-250ng/ml CD3 mAb、5-10ug/ml CD28 mAb；每2-3天補(bǔ)加含5％(體積分?jǐn)?shù))自體血漿、100-200IU/ml慶大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb的AIM-V完全培養(yǎng)液；

S202、乳腺癌特異性CTL的獲得：所述T細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，將所述T細(xì)胞與所述融合細(xì)胞按10-20∶1的比例進(jìn)行混合，共同培養(yǎng)，每2-3天補(bǔ)加含5％(體積分?jǐn)?shù))自體血漿、100-200IU/ml慶大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb、500-2000IU/ml GM-CSF的AIM-V完全培養(yǎng)液，第12-14天收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

現(xiàn)分別說明本發(fā)明實(shí)施例中個(gè)各具體步驟如下：

一、乳腺癌干細(xì)胞的分離純化及富集

在無菌條件下，將獲取的0.5-10平方厘米大小的乳腺癌組織標(biāo)本放入無菌離心管中密封保存，并放入冰盒中盡快送回實(shí)驗(yàn)室；

將標(biāo)本放置于超凈臺(tái)上，在培養(yǎng)皿中以青霉素鏈霉素混合液(1:1)沖洗2次，再用PBS緩沖液沖洗2-3次，以組織剪修剪去除腫瘤組織表面的脂肪組織、壞死組織和血塊，然后再以PBS緩沖液沖洗修剪好的組織塊2次；

將修剪好的組織放在培養(yǎng)皿中，以10％(體積分?jǐn)?shù))標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡，并用無菌眼科剪將組織塊剪碎，以200目濾網(wǎng)濾過，收集浸泡液，將濾過液收集入一50ml離心管中，靜置；

將濾網(wǎng)表面的組織放入另一50ml離心管中，加入0.1-0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膠原酶I/IV的消化液(膠原酶I/IV＝1：1)。在37℃振蕩消化1-2小時(shí)；消化后又以200目濾網(wǎng)過濾，將消化剩余組織再次重復(fù)上述消化過程，重復(fù)3-5次直至最后一次濾過后濾網(wǎng)上不見微小組織塊而只剩下粘稠的膠原為止；

將收集到的所有液體合并放入50ml離心管中，以800rpm離心10分鐘。去上清液，收獲底部的細(xì)胞加入0.1-0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膠原酶I/IV的消化液(膠原酶I/IV＝1：1)在37℃振蕩消化1-2小時(shí)；消化后又以200目濾網(wǎng)過濾，1500rpm離心10分鐘得到腫瘤細(xì)胞。

將腫瘤細(xì)胞用PBS(1-5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的BSA，0.01-0/03％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaN₃，pH7.4)洗3次，40-70μm尼龍網(wǎng)過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊和碎片后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1-10×10⁷/ml。

加入CD44抗體，一般1×10⁷個(gè)細(xì)胞中加入0.1-20μg抗體，室溫反應(yīng)30min。

1000rpm離心5min，棄上清中未結(jié)合的抗體。加入1ml磁珠分選緩沖液重懸細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，洗2次(2×1ml)。

1ml磁珠分選緩沖液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞與1-200μl免疫磁珠混合，室溫反應(yīng)30min，間隔10min輕輕晃動(dòng)反應(yīng)管。

將反應(yīng)管置入磁分離器中，靜置15min，將未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基(賽默飛世爾11320 Gibco^TM)重懸，接種入75ml培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)。

結(jié)合了靶細(xì)胞的免疫磁珠用1ml磁珠分選緩沖液洗5次(5×1ml)后，加入CD24抗體。重復(fù)前面的分選操作。

將與磁珠結(jié)合的細(xì)胞和未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞分別用無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12，EGF，bFGF，B27，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等)重懸，接種入75ml培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)。

3-5天后收集懸浮的細(xì)胞球，用胰酶消化后重新接種入75ml培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)。

5-7天后收集懸浮的細(xì)胞球備用，這些細(xì)胞就是富集的乳腺癌干細(xì)胞。

二、DC細(xì)胞的體外培養(yǎng)

用肝素抗凝管采集患者自體的外周血40-50ml，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，PBMC在含5-10％滅活的正常人AB血清的l640培養(yǎng)基里培養(yǎng)30-90min，吸去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用含800-2000U/ml GM/CSF、500-1000U/ml IL-4、5％正常人AB血清的1640培養(yǎng)基中在6孔培養(yǎng)扳中培養(yǎng)5-7天?？梢姂腋〉挠袠渫恍螤畹某墒霥C細(xì)胞。

三、DC細(xì)胞與乳腺癌干細(xì)胞的融合

如何將抗原引入DC細(xì)胞成為關(guān)鍵，常用的引入方法有：(1)人工合成肽為抗原；(2)腫瘤細(xì)胞裂解物或抽提物為抗原；(3)凋亡、死亡腫瘤細(xì)胞為抗原；(4)腫瘤提取出的mRNA為抗原；(5)基因轉(zhuǎn)染法；(6)全細(xì)胞融合法。

由于目前對(duì)腫瘤細(xì)胞的特征還未完全了解，選擇某種抗原作為腫瘤的標(biāo)志是有缺陷的，所以我們選擇將自體DC與乳腺癌干細(xì)胞融合，制備出特異性自體DC細(xì)胞/乳腺癌干細(xì)胞的融合細(xì)胞，兼具乳腺癌干細(xì)胞全部特性、DC細(xì)胞抗原傳遞性，可以在體外或者患者體內(nèi)直接激活初始T細(xì)胞形成CTLs。

細(xì)胞融合工藝：

收獲培養(yǎng)的原代腫瘤細(xì)胞，收集成熟的自體DC細(xì)胞，使DC與腫瘤細(xì)胞充分混勻(DC與腫瘤細(xì)胞的比例為5-20：1)；

離心去掉上清液，加入在37℃預(yù)溫的50％(體積分?jǐn)?shù))聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG-1450)1ml作用2-3分鐘，使腫瘤細(xì)胞與DC融合；

用不含血清1640培養(yǎng)液輕輕混勻，洗兩次，離心去掉含有聚乙二醇上清液，置于含有500-2000U/ml GM-CSF和含有10％自體血清的AIM-V培養(yǎng)液中在24孔板中培養(yǎng)5-6天；

根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的狀況，進(jìn)行半量換液。最后將目的細(xì)胞收集，經(jīng)200Gy輻照后備用。

四、體外制備特異性殺傷乳腺癌干細(xì)胞的TCLs

(1)獲得T細(xì)胞

用肝素抗凝管采集患者自體的外周血40-50ml，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC懸液置于新的T175瓶中(用纖粘連蛋白來源的短肽包被過夜)，補(bǔ)加100-1000IU/ml IFN-γ，置于37℃，5％CO₂濃度，飽和水蒸氣環(huán)境中培養(yǎng)。24小時(shí)后補(bǔ)加1000IU/ml IL-2，100-250ng/ml CD3 mAb，5-10ug/ml CD28 mAb。

每2-3天補(bǔ)液，使用AIM-V完全培養(yǎng)液，含5％(體積分?jǐn)?shù))自體血漿、100-200IU/ml慶大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb，并補(bǔ)加800-2000U/ml GM/CSF、500-1000U/ml IL-4、100-1000IU/ml IFN-γ。

(2)腫瘤特異性CTLs的獲得

培養(yǎng)至第7天時(shí)，將T淋巴細(xì)胞與DC/乳腺癌干細(xì)胞融合細(xì)胞按20：1比例進(jìn)行混合，共同培養(yǎng)，使之成為腫瘤特異性CTLs。每2-3天補(bǔ)液，AIM-V完全培養(yǎng)液中含5％(體積分?jǐn)?shù))自體血漿、100-200IU/ml慶大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb、500-2000IU/ml GM-CSF，第12-14天收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

五、乳腺癌特異性CTLs的檢測(cè)

檢測(cè)組(Exp-CTLs)：上述步驟四中所獲得的CTLs細(xì)胞。

對(duì)照組1(Control 1)：和未經(jīng)過抗原刺激的DC細(xì)胞融合的CTLs細(xì)胞。

對(duì)照組2(Control 2)：CTLs細(xì)胞。

將乳腺癌MCF7接種于六孔板中并與上述檢測(cè)組和對(duì)照組培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，利用Annexin V-FITC早期凋亡試劑盒(BD)，檢測(cè)凋亡的細(xì)胞百分率。測(cè)得結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，與檢測(cè)組共培育的MCF7的細(xì)胞凋亡比率要明顯高于對(duì)照組共培養(yǎng)的細(xì)胞。且彼此之間均達(dá)到了顯著水平。*P小于0.5，**P<0.05，***P<0.01。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明。特異性針對(duì)乳腺癌的CTLs對(duì)MCF 7細(xì)胞的凋亡有明顯的促進(jìn)作用。

上面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方式，上述的具體實(shí)施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。