本發(fā)明涉及一種生物制備方法，尤其涉及一種家畜腔前卵泡體外培養(yǎng)液及其制備方法。

背景技術(shù)：

細胞培養(yǎng)技術(shù)是生物學研究的最基本技術(shù)，它的成功，為研究細胞體外增殖與分化、細胞存活與凋亡、基因表達與調(diào)控等提供了絕好的研究模型，然而，目前的細胞體外培養(yǎng)與研究，多集中于單一細胞種類，對研究單一細胞功能與作用機制有不可替代的好處。但在體外培養(yǎng)由多種類型細胞組成的有機體組織，以及體外培養(yǎng)時，不同細胞之間的相互作用機制研究，還沒有取得理想的進展。卵巢卵泡是由卵泡膜細胞、顆粒細胞和卵母細胞共同組成，卵泡的生長發(fā)育是三種細胞相互作用與協(xié)調(diào)的結(jié)果，卵泡的體外培養(yǎng)對研究雄激素、雌激素與孕酮等類固醇激素的合成與分泌、卵泡生長機制與卵泡腔的形成原理，卵母細胞成熟與黃體化等方面都是一個很好的模型。

卵巢卵泡的發(fā)育與成熟是一個高度復雜的過程，涉及到動物下丘腦、垂體與卵巢的相互協(xié)調(diào)和卵泡各細胞間的多向交流，盡管研究已經(jīng)表明許多因素都可以調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育，但是，這些因子調(diào)控卵泡成熟的具體作用機制還不清楚。另外，在體外受精過程中，由于科學家直接從卵巢上獲取的健康優(yōu)質(zhì)卵子的數(shù)量有限，因此，如何培養(yǎng)卵泡從而獲取高質(zhì)量的卵母細胞是擺在科學家面前的首要問題。卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)的成功，無論是在基礎研究還是在獸醫(yī)臨床方面都有廣闊的應用前景。通過體外培養(yǎng)家畜的卵泡，可以為高產(chǎn)動物提供繁殖保障、對建立母源基因的“卵子庫”、研究卵泡發(fā)生與凋亡的生理病理過程和保種與商業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。

α-亞麻酸是多不飽和脂肪酸(n-3)的一種，也是動物必須的營養(yǎng)元素之一。多不飽和脂肪酸作為一種調(diào)節(jié)劑，可能是作為類固醇激素和前列腺素的前體，在動物繁殖活動的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。通過在日糧中添加α-亞麻酸可以促進牛、羊卵巢上小型和中型卵泡的數(shù)量增加，同時，飼喂不同的不飽和脂肪酸對增加體外培養(yǎng)的牛卵母細胞質(zhì)量，提高其受精率，早期胚胎的卵裂率和胚胎質(zhì)量有明顯的促進作用。然而，α-亞麻酸對體外培養(yǎng)的卵泡存活與發(fā)育情況還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種家畜腔前卵泡體外培養(yǎng)液及其制備方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明一種家畜腔前卵泡體外培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液為α-亞麻酸，α-亞麻酸在每1mL常規(guī)培養(yǎng)液中的添加量為100～200μg，所述常規(guī)培養(yǎng)液由100mLα-MEM溶液、1.5mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，150μL胰島素，100μL維生素C，0.5mL亞硒酸鈉，500μg牛血清白蛋白，100ng海藻酸鈉，500IU FSH，0.06g青霉素鈉、0.1g硫酸鏈霉素組成。

一種家畜腔前卵泡體外培養(yǎng)液的制備方法，包括以下步驟：

1)取1.5mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，150μL胰島素，100μL維生素C，0.5mL亞硒酸鈉，0.06g青霉素鈉、0.1g硫酸鏈霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基礎培養(yǎng)液；

2)取500μg牛血清白蛋白溶于基礎培養(yǎng)液中，緩慢混勻，避免泡沫產(chǎn)生，配制成Ⅰ液；

3)取10mg海藻酸鈉溶于10ml DMSO中，緩慢混勻，吸取100μL混勻后的溶液，加入Ⅰ液中，緩慢混勻，配制成Ⅱ液；

4)取10～20mgα-亞麻酸緩慢溶于10ml DMSO中，緩慢混勻，吸取100μL混勻后的溶液，加入Ⅱ液中，緩慢混勻，配制成工作液；

5)調(diào)節(jié)工作液pH值＝7.0～7.1，過濾滅菌，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

6)取500IU FSH加入100mL備用的工作液中，進行卵泡體外培養(yǎng)。

一種家畜腔前卵泡體外培方法，包括以下步驟：

(A)從屠宰場獲取牛卵巢，在滅菌的生理鹽水(溫度30～35℃)中，盡快送到實驗室，70％的酒精消毒滅菌后用30～35℃的生理鹽水將卵巢上殘留的酒精沖洗干凈；

(B)取出4℃冰箱中保存的卵泡培養(yǎng)工作液，在37℃水浴鍋中預熱，備用；

(C)將步驟(A)中的卵巢用手術(shù)刀片切成1cm×0.5cm×0.2cm的薄片，然后用滅菌的生理鹽水沖洗1～2次，放入表面皿中；

(D)在立體顯微鏡下，用25G針頭挑出家畜腔前卵泡，選擇直徑在160～220μm的腔前卵泡備用；

(E)將選擇的腔前卵泡放入24孔培養(yǎng)盤中，按照1ml/孔加入預熱的培養(yǎng)液進行單卵泡培養(yǎng)；

(F)間隔24小時更換70％培養(yǎng)液；

(G)利用帶刻度的顯微鏡每天檢測卵泡直徑，觀察卵泡腔的變化。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種家畜腔前卵泡體外培養(yǎng)液及其制備方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次將α-亞麻酸家畜卵巢腔前卵泡的體外培養(yǎng)，效果可靠，易于推廣，適用于家畜腔前卵泡的體外培養(yǎng)，可顯著提高體外培養(yǎng)家畜腔前卵泡的體外存活率。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的體外培養(yǎng)的牛腔前卵泡。

圖中：A：培養(yǎng)第1天；B：培養(yǎng)第5天；C：培養(yǎng)第12天；D培養(yǎng)第18天。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：

本發(fā)明一種家畜腔前卵泡體外培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液為α-亞麻酸，α-亞麻酸在每1mL常規(guī)培養(yǎng)液中的添加量為100～200μg，所述常規(guī)培養(yǎng)液由100mLα-MEM溶液、1.5mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，150μL胰島素，100μL維生素C，0.5mL亞硒酸鈉，500μg牛血清白蛋白，100ng海藻酸鈉，500IU FSH，0.06g青霉素鈉、0.1g硫酸鏈霉素組成。

一種家畜腔前卵泡體外培養(yǎng)液的制備方法，包括以下步驟：

1)取1.5mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，150μL胰島素，100μL維生素C，0.5mL亞硒酸鈉，0.06g青霉素鈉、0.1g硫酸鏈霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基礎培養(yǎng)液；

2)取500μg牛血清白蛋白溶于基礎培養(yǎng)液中，緩慢混勻，避免泡沫產(chǎn)生，配制成Ⅰ液；

3)取10mg海藻酸鈉溶于10ml DMSO中，緩慢混勻，吸取100μL混勻后的溶液，加入Ⅰ液中，緩慢混勻，配制成Ⅱ液；

4)取10～20mgα-亞麻酸緩慢溶于10ml DMSO中，緩慢混勻，吸取100μL混勻后的溶液，加入Ⅱ液中，緩慢混勻，配制成工作液；

5)調(diào)節(jié)工作液pH值＝7.0～7.1，過濾滅菌，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

6)取500IU FSH加入100mL備用的工作液中，進行卵泡體外培養(yǎng)。

一種家畜腔前卵泡體外培方法，包括以下步驟：

(A)從屠宰場獲取牛卵巢，在滅菌的生理鹽水(溫度30～35℃)中，盡快送到實驗室，70％的酒精消毒滅菌后用30～35℃的生理鹽水將卵巢上殘留的酒精沖洗干凈；

(B)取出4℃冰箱中保存的卵泡培養(yǎng)工作液，在37℃水浴鍋中預熱，備用；

(C)將步驟(A)中的卵巢用手術(shù)刀片切成1cm×0.5cm×0.2cm的薄片，然后用滅菌的生理鹽水沖洗1～2次，放入表面皿中；

(D)在立體顯微鏡下，用25G針頭挑出家畜腔前卵泡，選擇直徑在160～220μm的腔前卵泡備用；

(E)將選擇的腔前卵泡放入24孔培養(yǎng)盤中，按照1ml/孔加入預熱的培養(yǎng)液進行單卵泡培養(yǎng)；

(F)間隔24小時更換70％培養(yǎng)液；

(G)利用帶刻度的顯微鏡每天檢測卵泡直徑，觀察卵泡腔的變化。

實施例1

準確稱量取1.5mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，150μL胰島素，100μL維生素C，0.5mL亞硒酸鈉，0.06g青霉素鈉、0.1g硫酸鏈霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基礎培養(yǎng)液；取500μg牛血清白蛋白溶于基礎培養(yǎng)液中，緩慢混勻，避免泡沫產(chǎn)生，配制成Ⅰ液；量取1mg/ml的海藻酸鈉溶液100μL，加入Ⅰ液中，緩慢混勻，配制成Ⅱ液；取1mg/mlα-亞麻酸120μL，加入Ⅱ液中，緩慢混勻，配制成工作液；調(diào)節(jié)工作液pH值＝7.0～7.1，過濾滅菌，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；?00IU FSH加入100mL備用的工作液中，用于羊卵泡體外培養(yǎng)。

實施例2

準確稱量取1.5mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，150μL胰島素，100μL維生素C，0.5mL亞硒酸鈉，0.06g青霉素鈉、0.1g硫酸鏈霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基礎培養(yǎng)液；取500μg牛血清白蛋白溶于基礎培養(yǎng)液中，緩慢混勻，避免泡沫產(chǎn)生，配制成Ⅰ液；量取1mg/ml的海藻酸鈉溶液100μL，加入Ⅰ液中，緩慢混勻，配制成Ⅱ液；取1mg/mlα-亞麻酸180μL，加入Ⅱ液中，緩慢混勻，配制成工作液；調(diào)節(jié)工作液pH值＝7.0～7.1，過濾滅菌，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；?00IU FSH加入100mL備用的工作液中，用于牛卵泡體外培養(yǎng)。

對照例

準確稱量取1.5mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，150μL胰島素，100μL維生素C，0.5mL亞硒酸鈉，0.06g青霉素鈉、0.1g硫酸鏈霉素，溶于100mLα-MEM溶液，配制成基礎培養(yǎng)液；取500μg牛血清白蛋白溶于基礎培養(yǎng)液中，緩慢混勻，避免泡沫產(chǎn)生，配制成Ⅰ液；量取1mg/ml的海藻酸鈉溶液100μL，加入Ⅰ液中，緩慢混勻，配制成Ⅱ液；調(diào)節(jié)Ⅱ液pH值＝7.0～7.1，過濾滅菌，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；?00IU FSH加入100mL備用的工作液中，用于牛卵泡體外培養(yǎng)。

試驗例結(jié)果如圖1，表1所示：

表1不同濃度α-亞麻酸對卵巢腔前卵泡體外培養(yǎng)12天后的存活率影響

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。