本發(fā)明屬于醫(yī)藥化學領(lǐng)域，具體涉及化合物3,3’-(1,3-丁二炔-1,4-基)-N,N’-二((4-(4-甲基哌啶甲基))-3-三氟甲基苯基)二(4-甲基苯甲酰胺)，其合成方法以及其作為參考標記的用途。

背景技術(shù)：

WO2014082578報道了下式A的化合物對多種癌細胞具有良好的抑制活性，可用于治療和/或預防腫瘤，其化學名稱為3-((1H-吡咯并[2,3-b]吡嗪-5-基)乙炔基)-4-甲基-N-[4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-三氟甲基苯基]苯甲酰胺，

本發(fā)明的發(fā)明人在制備式A化合物的過程中發(fā)現(xiàn)，制備得到的式A化合物中會產(chǎn)生一種副產(chǎn)物，性質(zhì)與式A化合物相似，難以分離，對式A化合物的質(zhì)量造成很大影響，對式A化合物成藥性、安全性和有效性帶來嚴重隱患。因此，研究該副產(chǎn)物的性質(zhì)，對其進行檢測控制具有重大的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供式C所示的化合物或其鹽，化學名稱為3,3’-(1,3-丁二炔-1,4-基)-N,N’-二((4-(4-甲基哌啶甲基))-3-三氟甲基苯基)二(4-甲基苯甲酰胺)，

本發(fā)明的發(fā)明人研究式A化合物的副產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)，大部分副產(chǎn)物可以通過重結(jié)晶分離純化手段有效的除去，使其含量在0.1％以下，但有一個特定副產(chǎn)物C，難以通過重結(jié)晶分離純化手段有效的去除，對副產(chǎn)物C進行鑒定、合成，確定其去除控制方法，對控制式A化合物的質(zhì)量意義重大。

式C化合物的鹽可以是本發(fā)明的式C化合物與酸形成的任何鹽，尤其是那些藥學上可接受的鹽，所述的酸包括但不限于鹽酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、氫溴酸、檸檬酸、馬來酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富馬酸、醋酸、乳酸、硝酸等等。

本發(fā)明的第二個目的是提供作為副產(chǎn)物的式C的化合物或其鹽的制備方法。所述方法包括如下路線和步驟：

路線I

a)式1的化合物在有機溶劑中，在催化劑催化下經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)制得式B的化合物；和

b)式B的化合物在堿性溶劑中水解后，與式4的化合物縮合，得到式C的副產(chǎn)物。

在一些具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中步驟a)中所述的有機溶劑選自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷、氯仿、二甲基亞砜、環(huán)丁砜、1,4-二氧六環(huán)、甲苯和二甲苯中的一種或幾種。在一些優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中步驟a)中所述的有機溶劑選自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷和氯仿中的一種或幾種。

在一些具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中步驟a)中所述的催化劑選自氯化亞銅、碘化亞銅、溴化亞銅、氰化亞銅、氯化銅、氧化銅、硫酸銅、元素銅、Pd(Ph₃P)₂Cl₂、Pd、PdCl₂、TiCl₄、Ni-CuI、Pd(Ph₃P)₂Cl₂-CuI、Pd-CuI、PdCl₂-CuI、CuI-CuCl和Cu(OAc)₂-CuCl₂。在一些優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中步驟a)中所述的催化劑選自氯化亞銅和碘化亞銅。在一些更優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中步驟a)中所述的催化劑為碘化亞銅。

在一些具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中步驟b)中所述的堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸鋰。在一些優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中步驟b)中所述的堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化鋰。

在一些具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中步驟b)中所述的縮合劑選自二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺。在另一些具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法，其中在步驟b)中加入吡啶活化反應(yīng)。

在一些具體的實施方案中，本發(fā)明的式C化合物或其鹽的制備方法包括以下步驟：

a)式1的化合物在選自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷和氯仿中的一種或幾種有機溶劑中，在氯化亞銅或碘化亞銅催化劑催化下經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)制得式B的化合物；和

b)式B的化合物在選自氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化鋰的堿性溶劑中水解后，在選自二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺的縮合劑下并在吡啶活化下，與式4的化合物縮合，得到式C的副產(chǎn)物。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種定位、定量式A化合物或其鹽中作為副產(chǎn)物的式C化合物或其鹽的HPLC方法。作為副產(chǎn)物的式C化合物或其鹽可以作為對照雜質(zhì)，應(yīng)用于HPLC法分析式A化合物或其鹽中雜質(zhì)的歸屬和定位，可以用于式A化合物或其鹽中作為副產(chǎn)物的式C化合物或其鹽的定量分析以及用于式A化合物或其鹽的質(zhì)量分析。本發(fā)明的所述利用式C化合物或其鹽分析式A化合物或其鹽的HPLC方法包括以下步驟：

1)制備含有式C化合物或其鹽和式A化合物或其鹽的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液；

2)制備含有式A化合物或其鹽的供試品溶液；和

3)使用步驟1)制得的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液和步驟2)制得的供試品溶液通過高效液相色譜法分離式A化合物或其鹽和式C或其鹽化合物，并確定式A化合物或其鹽和式C化合物或其鹽的位置和含量。

在一些具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的利用式C化合物或其鹽分析式A化合物或其鹽的HPLC方法，其中步驟1)的所述的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的制備方法包括：

I)精密稱定式C化合物或其鹽和式A化合物或其鹽，分別用二甲基亞砜溶解，獲得兩份溶液；和

II)精密稱定式A化合物或其鹽，用醇溶解溶解，再加入步驟I)制得的兩份溶液，之后再用醇溶液稀釋，得到系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，優(yōu)選地，所述醇溶液選自甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇溶液，更優(yōu)選地，所述醇溶液為甲醇溶液。

在一些具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的利用式C化合物或其鹽分析式A化合物或其鹽的HPLC方法，其中步驟2)的供試品溶液通過將式A化合物或其鹽加入醇溶液中溶解而制得，優(yōu)選地，所述醇溶液選自甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇溶液，更優(yōu)選地，所述醇溶液為甲醇溶液。

在一些具體的實施方案中，所述的利用式C化合物或其鹽分析式A化合物或其鹽的HPLC方法包括以下步驟：

M1)精密稱定式C化合物或其鹽和式A化合物或其鹽各10mg置20ml量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度；

M2)精密稱定式A化合物或其鹽50mg置于50ml容量瓶中，先加少量甲醇溶解，再加入步驟M1)制得的兩份溶液各1mL，甲醇稀釋至刻度得到系統(tǒng)適應(yīng)性溶液；

M3)稱取20mg式A化合物或其鹽的待測樣品置20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度得到供試品溶液；

M4)將步驟M2)制得的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液和步驟M3)制得的供試品溶液分別注入4.6×150mm，3.5μm的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，以0.020mol/L醋酸銨緩沖液(用氨水調(diào)pH值7.0)為流動相A；以甲醇為流動相B，依據(jù)表1梯度洗 脫樣品；

表1

M5)使用紫外檢測器在235nm波長處確定位置和含量。

本發(fā)明的第四個目的是提供本發(fā)明的式C化合物或其鹽在式A化合物或其鹽在質(zhì)量分析中的用途。式A化合物的鹽可以是式A化合物與酸形成的任何鹽，尤其是那些藥學上可接受的鹽，所述的酸包括但不限于鹽酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、氫溴酸、檸檬酸、馬來酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富馬酸、醋酸、乳酸、硝酸等等。

附圖說明

圖1是式A化合物與副產(chǎn)物式C化合物及其它雜質(zhì)混合進樣的HPLC圖譜，其中26.482min為式A化合物，47.301min為副產(chǎn)物式C化合物。

具體實施方式

實施例13,3’-(1,3-丁二炔-1,4-基)-二(4-甲基苯甲酰胺)

稱取3-乙炔基-4-甲基苯甲酸甲酯5.22g于反應(yīng)瓶中，加入30mL二氯甲烷溶解，分別加入CuI 0.76，哌啶1.28g，室溫下反應(yīng)72h后停止反應(yīng)，將反應(yīng)液降溫至零度，過濾，濾餅用乙酸乙酯溶解后快速柱層析得標題化合物。

實施例23,3’-(1,3-丁二炔-1,4-基)-N,N’-二((4-(4-甲基哌啶甲基))-3-三氟甲基苯基)二(4-甲基苯甲酰胺)

稱取實施例1所得物1.73g于反應(yīng)瓶中，加入20mL甲醇溶解，加入NaOH1.6g和水10mL，回流反應(yīng)2h，停止反應(yīng)，加入20ml水，將反應(yīng)液降溫至0℃，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1-2，過濾，烘干得3,3’-(1,3-丁二炔-1,4-基)-二(4-甲基苯甲酸)。

稱取制得的3,3’-(1,3-丁二炔-1,4-基)-二(4-甲基苯甲酸)1.27g于反應(yīng)瓶中，加入10mL吡啶溶解，分別加入3-三氟甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)苯胺2.18g，EDCI 1.69g，室溫反應(yīng)12h，停止反應(yīng)，蒸除吡啶后向殘留物中加入DMF6mL溶解，滴加至20ml飽和碳酸鉀水溶液中，過濾，烘干，得標題化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δppm:10.53(s,2H),8.25(d,2H),8.20(d,2H),8.05(d,2H),7.98(d,2H),7.70(d,2H),7.52(d,2H),3.56(s,4H),2.53(s,6H),2.20-2.45(m,16H),2.16(s,6H)。

LC-MS m/z:[M/2+H]⁺＝415.2。

實施例33,3’-(1,3-丁二炔-1,4-基)-N,N’-二((4-(4-甲基哌啶甲基))-3-三氟甲基苯基)二(4-甲基苯甲酰胺)的定位定量分析

精密稱定副產(chǎn)物C和式A化合物各10mg置20ml量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度。精密稱定式A化合物50mg置于50ml容量瓶中，先加少量甲醇溶解，并加入上述兩份溶液各1mL，甲醇稀釋至刻度得到系統(tǒng)適應(yīng)性溶液；

稱取20mg式A化合物的待測樣品置20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度得到供試品溶液；

將系統(tǒng)適應(yīng)性溶液和供試品溶液分別注入4.6×150mm，3.5μm的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，以0.020mol/L醋酸銨緩沖液(用氨水調(diào)pH值7.0)為流動相A；以甲醇為流動相B，依據(jù)表1梯度洗脫樣品；

表1

使用紫外檢測器在235nm波長處確定位置和含量。