一種鄰苯基查爾酮類化合物在熒光探針中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及英光探針領(lǐng)域，更具體地，涉及一種鄰苯基查爾麗類化合物在英光探 針中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 微管作為細(xì)胞骨架的主要組成成分，在維持細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞分裂，信號(hào)傳導(dǎo)W及物 質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中起著重要的作用。細(xì)胞內(nèi)微管一直處于高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，不斷的解聚成微 管蛋白和聚合成不同長(zhǎng)度的微管，使得微管和游離的微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)維持著動(dòng)態(tài)平衡的 狀態(tài)，而且送種平衡狀態(tài)會(huì)應(yīng)細(xì)胞所需向微管或者微管蛋白方向移動(dòng)，從而引起細(xì)胞在不 同應(yīng)激狀態(tài)下所含微管和微管蛋白的比例有所不同。有效檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)微管與微管蛋白，對(duì) 研究特定條件下，微管蛋白及微管的功能與行為規(guī)律，W及臨床診斷等方面，均具有重要的 意義。
[0003]目前已有用于監(jiān)測(cè)微管的英光分子的報(bào)道。比如紫杉醇類化合物只能結(jié)合在微管 上，由紫杉醇衍生而出的英光分子（如BODIPYFLpaclitaxel,OregonGreen? 488Taxol) 可W用于對(duì)微管的定位和定量；而長(zhǎng)春新堿類化合物也只能結(jié)合在微管陽(yáng)極端點(diǎn)處，由長(zhǎng) 春新堿衍生出的英光分子（B0DIPYFLVinblastine)也被報(bào)道可W用于對(duì)微管的定位和定 量；另外，微管蛋白特異抗體也常被用于免疫英光法對(duì)微管蛋白及微管進(jìn)行顯影分析。送些 英光分子的發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)微管的檢測(cè)提供了有利的工具。但是，由于送些探針?lè)肿蛹纯勺?用于微管蛋白，也可作用于微管蛋白所形成的微管，因此無(wú)法對(duì)二者進(jìn)行有效的區(qū)分。雖然 文獻(xiàn)曾報(bào)道秋水仙堿可W特異性的結(jié)合于游離的微管蛋白，但該分子具有英光強(qiáng)度比較弱 的缺點(diǎn)；后來(lái)也發(fā)現(xiàn)了氣標(biāo)記的秋水仙堿用于微管蛋白的定位和定量，但是送些分子的合 成比較繁瑣而且放射元素標(biāo)記具有危險(xiǎn)性，使得其應(yīng)用受到了限制。因此發(fā)現(xiàn)新的特異性 結(jié)合游離微管蛋白的英光分子具有迫切的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一類英光探針，我們發(fā)現(xiàn)的送類英光分子既可W實(shí)現(xiàn)對(duì)游離微管蛋白 的識(shí)別和定量，同時(shí)也具有合成簡(jiǎn)單，英光性強(qiáng)，染色過(guò)程簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn)。此外送類分子可W 用于其他與微管蛋白結(jié)合有關(guān)的實(shí)驗(yàn)，如篩選微管蛋白聚集抑制劑，同時(shí)可W用于研究細(xì) 胞內(nèi)微管蛋白的分布與含量的變化，如用于不同腫瘤細(xì)胞和耐藥細(xì)胞W及細(xì)胞EMT發(fā)生前 后微管蛋白分布和量的變化檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明首先提供一種鄰苯基查爾麗類化合物在英光探針中的應(yīng)用，所述的苯基查 爾麗類化合物的結(jié)構(gòu)式為
Ri為OH或H，Rz為-0邸3 或N(CH3)2,Ra為H或F，Ra為H或F。
[0006] 所述的英光探針為對(duì)微管蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的探針。
[0007] 所述的應(yīng)用為鄰苯基查爾麗類化合物在制備腫瘤中的微管蛋白的英光探針中的 應(yīng)用。如用于不同腫瘤細(xì)胞和耐藥細(xì)胞W及細(xì)胞EMT發(fā)生前后微管蛋白分布和量的變化檢 測(cè)。
[0008] 所述的應(yīng)用為鄰苯基查爾麗類化合物對(duì)游離微管蛋白的識(shí)別和定量檢測(cè)。
[0009] 所述的英光探針用于細(xì)胞體外和/或細(xì)胞體內(nèi)的微管蛋白的檢測(cè)。
[0010] 所述的英光探針用于篩選可與微管蛋白結(jié)合的分子。
[0011] 所述的英光探針用于制備微管蛋白檢測(cè)試劑。
[0012] 本發(fā)明的英光探針本身只具有微弱的英光，但當(dāng)與微管蛋白結(jié)合后，產(chǎn)生強(qiáng)英光 發(fā)射，并具對(duì)微管蛋白具有濃度依賴性；同時(shí)，本發(fā)明提供的分子，與細(xì)胞內(nèi)其它小分子，生 物大分子W及由微管蛋白所形成的微管，不發(fā)生明顯的英光增強(qiáng)現(xiàn)象，具有優(yōu)良的選擇性。 可用于生物體系中微管蛋白的特異性檢測(cè)，顯像，W及與之相關(guān)的臨床診斷。
[0013] 本發(fā)明具有W下用處： 1. 用于體外模型中微管蛋白的特異性檢測(cè)、顯像與變化規(guī)律研究； 2. 用于細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的特異性檢測(cè)、顯像與變化規(guī)律研究； 3. 用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的特異性檢測(cè)、顯像與變化規(guī)律研究； 4. 用于涉及到細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的特異性檢測(cè)、顯像與變化規(guī)律研究的臨床診斷。
[0014] 本發(fā)明涉及的英光探針具有W下優(yōu)點(diǎn)： (1) 合成路線簡(jiǎn)單，容易獲得，該類英光分子制備方法已公布在申請(qǐng)的專利中（【申請(qǐng)?zhí)枴?201410032845. 9)； (2) 具有長(zhǎng)的英光發(fā)射波長(zhǎng)（〉500nm)能夠有效避免來(lái)自生物大分子背景英光的干擾； (3) 該探針?lè)肿颖旧頍o(wú)英光，只有與微管蛋白結(jié)合后才具有很強(qiáng)的英光，因此檢測(cè)信噪 比高，靈敏度高； (4) 具有優(yōu)秀的選擇性，能夠排除細(xì)胞內(nèi)其他蛋白的干擾，并且對(duì)聚合的微管親和性比 較弱，因此可W特異性檢測(cè)游離微管蛋白，從而具有檢測(cè)EMT等不同生理過(guò)程的潛力； (5) 具有良好的生物膜通透性，因而不僅能用于固定的細(xì)胞還可W用于活細(xì)胞中微管 蛋白的檢測(cè)； (6)穩(wěn)定性高，不受生理環(huán)境中抑值的影響，在抑=2-10之間，英光探針和微管蛋白結(jié) 合后，英光強(qiáng)度不受明顯影響。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為英光分子探針與微管蛋白結(jié)合引起的英光發(fā)射。
[0016] 圖2為英光分子探針與微管蛋白結(jié)合的特異性和穩(wěn)定性。
[0017]圖3為英光分子探針用于檢測(cè)與微管蛋白秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。
[0018] 圖4為英光分子探針用于對(duì)腫瘤細(xì)胞及其耐藥株中微管蛋白的定位，W及與微管 蛋白抗體免疫英光結(jié)果的比較。
[0019] 圖5為英光分子探針用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞及其耐藥株中微管蛋白的分布和量的變 化。
[0020] 圖6為英光分子探針用于檢測(cè)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT)前后微管蛋白H維結(jié)構(gòu) 上的分布和量的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用 的試劑、設(shè)備和方法為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購(gòu)的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。
[0022] 英光探針1;Ri為0H，Rz為0邸3,Rs為H，Ra為F。
[002引英光探針2;Ri為0H，Rz為0邸3,Rs為F，Ra為H。
[0024]英光探針3 ;Ri為H，Rz為N(CHs) 2,Rs為H，Ra為F。
[00幼英光探針4 ;Ri為H，Rz為N(CHs) 2,Rs為F，Ra為H。
[0026]實(shí)施例1英光分子探針與微管蛋白結(jié)合引起的英光發(fā)射W及英光光譜性質(zhì) 將不同英光分子探針與微管蛋白混合在微管蛋白工作液中（80禮PIPESpH6.9，2.0 mlMgC12,and0. 5mlEGTA)，37°C賠育30min后，于37°C多功能酶標(biāo)儀上波譜掃描模式 下對(duì)英光分子-微管蛋白結(jié)合后的英光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，先固定激發(fā)波長(zhǎng)Ex=365 nm，對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)Em進(jìn)行掃描，W確定最佳發(fā)射波長(zhǎng)，然后固定發(fā)射波長(zhǎng)Em為最佳發(fā)射波長(zhǎng)， 對(duì)激發(fā)波進(jìn)行掃描，W確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)。將不同英光分子探針與微管蛋白混合在微管蛋 白工作液中，在最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下，對(duì)英光探針與微管蛋白結(jié)合引起的英光動(dòng)力學(xué)進(jìn) 行測(cè)定。結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)英光探針1和2的最佳激發(fā)波長(zhǎng)約為365nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng) 為約465nm，而英光探針3和4的最佳激發(fā)波長(zhǎng)約為430nm，