本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)藥用資源橘皮，又稱(chēng)為陳皮，具有祛痰、平喘，降血壓，抗菌，抗炎，抗氧化等藥理作用。橘皮中除了含有精油以外，還含有大量的黃酮類(lèi)化合物，研究表明，橘皮中的黃酮類(lèi)化合物是其發(fā)揮抗炎、抗氧化等藥理活性的主要相關(guān)因素。橘皮中黃酮類(lèi)化合物成分復(fù)雜，目前已經(jīng)從橘皮中分離到了60多種黃酮類(lèi)化合物，其中比較常見(jiàn)的有橘皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川皮素、柚皮苷、柚皮蕓香甘等。

新橙皮苷和橙皮苷因其含量高，藥理活性突出等優(yōu)點(diǎn)，來(lái)源廣泛，在當(dāng)前的研究中得到了更普遍的關(guān)注。其藥理活性包括抗肝癌細(xì)胞擴(kuò)增、抑制小鼠因感染引起的內(nèi)毒素休克、抗過(guò)敏、抗雌激素、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化、自由基清除以及潛在的胃腸道保護(hù)作用等等。但有研究證實(shí)新橙皮苷或橙皮苷會(huì)被腸道菌的水解代謝，釋放出其苷元橙皮素，而橙皮素具有更廣泛的藥理活性，其抗炎活性要高于糖苷本身，因此兩者口服后發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)可能是橙皮素。如何通過(guò)含量較高糖苷水解制備含量較低的苷元，以闡明其發(fā)揮活性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，或?qū)⒌蛢r(jià)值的成分轉(zhuǎn)為高價(jià)值的成分，在食品和藥學(xué)領(lǐng)域都成為橘皮資源研究的熱門(mén)。

目前水解轉(zhuǎn)化糖苷類(lèi)化合物常用的方法有化學(xué)法和生物法。在新橙皮苷或橙皮苷的研究中，多采用酸水解法，如美國(guó)專(zhuān)利US4150038中利用濃硫酸等在低碳醇的作用下水解橙皮苷產(chǎn)生橙皮素。此外還有很多文獻(xiàn)報(bào)道生成橙皮素的 方法，如水相法、水相-乙醇法、甲醇法、環(huán)己醇法等，但這些方法都會(huì)涉及到工藝繁瑣、污染嚴(yán)重、產(chǎn)物純化困難等其中部分缺點(diǎn)。

利用微生物發(fā)酵法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化也是一種常見(jiàn)的方法。Zhang Wei等利用Clostridium sp.8,Bacteroides sp.15,Bacillus sp.46,Enterobacter sp.41-1和sp.73等五株腸道菌的發(fā)酵液催化新橙皮苷轉(zhuǎn)化，得到水解產(chǎn)物、脫羥基、脫甲基以及乙酰化產(chǎn)物。盡管微生物發(fā)酵法反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、環(huán)境污染小，但反應(yīng)產(chǎn)物種類(lèi)多樣、成分復(fù)雜，不僅影響收率，對(duì)于純化分離也造成了更大的困難。

酶促水解反應(yīng)也是一種生物轉(zhuǎn)化的常用手段，糖苷酶可以選擇性的識(shí)別不同種類(lèi)或不同構(gòu)型的糖苷鍵，以定向地水解相應(yīng)的糖苷鍵。其主要特點(diǎn)為轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng)、條件溫和易實(shí)現(xiàn)，排除了后期繁瑣的分離過(guò)程。因此通過(guò)尋找經(jīng)濟(jì)高效、專(zhuān)一穩(wěn)定的工具酶來(lái)定向地進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，獲得所需要的目標(biāo)化合物也逐漸成為現(xiàn)代研究的重要突破點(diǎn)。盡管一步水解制備橙皮素的實(shí)例較為缺乏，但通過(guò)篩選合適的工具酶和反應(yīng)條件，獲得更高含量、高活性的苷元仍是值得去探索的領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種通過(guò)酶法水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法。

一種通過(guò)酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制備橙皮素的方法，按照以下步驟進(jìn)行：

1)采用Penicillium decumbens(斜臥青霉)發(fā)酵產(chǎn)生的高α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的粗酶液，在緩沖液中選擇性的水解新橙皮苷或橙皮苷，使其轉(zhuǎn)化為橙皮素，具體方法為，取20-50mg的新橙皮苷或橙皮苷置于反應(yīng)釜中，按照10：1：0.1的體積比依次加入緩沖液、粗酶液和激活劑后共同孵育；

2)橙皮素的制備：待反應(yīng)結(jié)束后，將上述轉(zhuǎn)化液與等倍體積的甲醇混合，離心后取上清，于40-50℃減壓濃縮后溶于0.5倍體積的甲醇，過(guò)制備型色譜柱即得到橙皮素。

所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、或檸檬酸緩沖液；

所述的激活劑為：CaCl₂溶液。

所述步驟1)中:反應(yīng)體系中激活劑濃度為5-20mM，緩沖液的pH值為5.5-7.0，水解反應(yīng)溫度為20-40℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5-4h，離心條件為4℃下20000g離心20min。

所述步驟2)中處理沉淀的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇或丙酮。

上述粗酶液處理新橙皮苷或橙皮苷后，使得二糖苷一步轉(zhuǎn)化為苷元，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98％以上。

本發(fā)明提供了一種利用工具酶高效高選擇性轉(zhuǎn)化新橙皮苷或橙皮苷，制備更高應(yīng)用價(jià)值的代謝產(chǎn)物的方法，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到98％以上，最終收率可達(dá)95％。與其他方法相比，該方法轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng)、條件溫和易實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)物純度高，縮減了后期繁瑣的分離過(guò)程。

附圖說(shuō)明

圖1為酶解新橙皮苷制備橙皮素的液相轉(zhuǎn)化圖，反應(yīng)時(shí)間為4h，新橙皮苷完全轉(zhuǎn)化。

圖2為酶解橙皮苷制備橙皮素的液相轉(zhuǎn)化圖，反應(yīng)時(shí)間為4h，橙皮苷完全轉(zhuǎn)化。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容予以進(jìn)一步闡明，其目的僅僅為了更好理解本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。實(shí)施例需要體現(xiàn) 權(quán)利要求中范圍的上限、下限和中間值，至少還需要添加一個(gè)實(shí)施例。將權(quán)利要求中的激活劑等具體物質(zhì)代入實(shí)施例中。

實(shí)施例1

粗酶液的制備

使用含有3％的麥麩提取物，0.2％酵母提取物，1％葡萄糖，0.5％的KH2PO4，0.2％的(NH4)2SO4作為種子培養(yǎng)基，將上述種子培養(yǎng)基50ml分配到100ml錐形瓶中，在120℃滅菌15min，將Penicillium decumbens的瓊脂平板培養(yǎng)物接種到其中，并在30℃培養(yǎng)2天作為種子液。

500ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中放入100ml含5％玉米漿，0.2％酵母提取物，0.2％的KH2PO4，1％柚皮苷的培養(yǎng)基，PH4.5，高壓滅菌121度30min。將1ml種子液接種于此培養(yǎng)基，150rpm，25℃搖床培養(yǎng)5天。離心收集上清液，即為粗酶液。

實(shí)施例2

取100ml三角瓶依次加入20ml磷酸緩沖液(pH6.0)，3.5ml粗酶液，250ul濃度為20mM的激活劑，600ul濃度為80mM的新橙皮苷溶液，封閉瓶口后，于37℃下200rpm旋轉(zhuǎn)式搖床反應(yīng)4h，每隔1h取樣進(jìn)行HPLC分析(檢測(cè)波長(zhǎng)283nm，流動(dòng)相為：乙腈(B)/純水(A)，梯度為，0-10min，25％-50％B；10.0-12.0min，50％-90％B；12.0-16.0min，90％-90％B，流速1ml/min)，新橙皮苷0.5h轉(zhuǎn)化率大于98％，反應(yīng)4h后完全轉(zhuǎn)化。制備出的產(chǎn)品為橙皮素.如圖1所示，由圖1可以看出該粗酶液對(duì)新橙皮苷具有極高的轉(zhuǎn)化率。

實(shí)施例3

取100ml三角瓶依次加入20ml磷酸緩沖液(pH6.0)，3.5ml濃度為100mg/ml的酶溶液，250ul濃度為20mM的激活劑，600ul濃度為80mM的橙皮苷溶液，封閉瓶口后，于37℃下200rpm旋轉(zhuǎn)式搖床反應(yīng)4h，每隔1h取樣進(jìn) 行HPLC分析(檢測(cè)波長(zhǎng)283nm，流動(dòng)相為：乙腈(B)/純水(A)，梯度為，0-10min，25％-50％B；10.0-12.0min，50％-90％B；12.0-16.0min，90％-90％B，流速1ml/min)，橙皮苷0.5h轉(zhuǎn)化率大于98％，反應(yīng)4h后完全轉(zhuǎn)化。制備出的產(chǎn)品為橙皮素.如圖2所示，由圖2可以看出該粗酶液在轉(zhuǎn)化橙皮苷制備橙皮素方面具有很顯著的優(yōu)勢(shì)。