本發(fā)明涉及高分子聚合物制備領(lǐng)域，尤其是一種制備不同分子量聚蘋果酸的提取方法。

背景技術(shù)：

聚蘋果酸是以蘋果酸為唯一單體合成的均聚高分子聚合物，特殊的立體結(jié)構(gòu)使其具有生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等優(yōu)良性質(zhì)。聚蘋果酸作為一種水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性和可化學(xué)衍生性。聚蘋果酸的這些獨(dú)特的性質(zhì)，使其在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理以及香精香料等許多方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

聚蘋果酸的生產(chǎn)方式主要有化學(xué)法和微生物合成法兩種，相比于化學(xué)合成法，生物法合成聚蘋果酸具有成本低、反應(yīng)條件溫和和分子量相對(duì)較高等優(yōu)點(diǎn)，因此生物法合成聚蘋果酸越來(lái)越吸引人們的注意。由于出芽短梗霉進(jìn)行聚蘋果酸發(fā)酵時(shí)，同時(shí)產(chǎn)生的色素和胞外多聚糖等副產(chǎn)物對(duì)聚蘋果酸的提取造成一定的影響。因此，提取工藝的建立以及優(yōu)化是聚蘋果酸實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)急需解決的問題，所以對(duì)聚蘋果酸提取工藝的研究有重要的意義和研究前景。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)聚蘋果酸的研究越來(lái)越多，主要集中在聚蘋果酸的發(fā)酵菌株、發(fā)酵工藝等方面進(jìn)行深入研究，并獲得了高產(chǎn)量的菌株以及生產(chǎn)工藝，但對(duì)生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的提取工藝的研究很少，大多數(shù)專利和論文著重介紹的都是聚蘋果酸菌株篩選以及發(fā)酵培養(yǎng)等方法以及簡(jiǎn)單的提取方法，例如申請(qǐng)?zhí)枮?01310746941.5的發(fā)明專利采用添加維生素的方法提高聚蘋果酸的合成量，使產(chǎn)量達(dá)到45g/L；申請(qǐng)?zhí)枮?01410830995.4的發(fā)明專利采用補(bǔ)料發(fā)酵的方法提高聚蘋果酸的產(chǎn)量，產(chǎn)量提高了11%~20%；宋存江2007年申請(qǐng)的專利中主要是采用有機(jī)溶劑醇沉獲得聚蘋果酸；2009年萬(wàn)印華發(fā)表的專利中主要是采用膜過濾、離子交換樹脂等方法將發(fā)酵液中的其他物質(zhì)去除來(lái)得到聚蘋果酸產(chǎn)品；南京工業(yè)大學(xué)王浩等人采用離子交換法從發(fā)酵液中提取聚蘋果酸；提取方法大多集中于有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮等)或離子交換提取聚蘋果酸，不僅成本高，而且可能造成有機(jī)溶劑的殘留，存在安全隱患。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種制備不同分子量聚蘋果酸的提取方法，工序少，降低了提取過程中聚蘋果酸的損失率，提高了提取效率；工藝簡(jiǎn)單，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化提取工藝。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種制備不同分子量聚蘋果酸的提取方法，包括以下步驟：

（1）發(fā)酵培養(yǎng)；

將出芽短梗霉斜面進(jìn)行活化，采用洗菌的方法將孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，在28℃，200r/min條件下培養(yǎng)40h；培養(yǎng)好的種子液按10%(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25℃，200r/min條件下培養(yǎng)144h，即可獲得聚蘋果酸的發(fā)酵液；

（2）分離純化；

一是板框過濾除菌脫色：發(fā)酵獲得發(fā)酵液，加入等體積的蒸餾水進(jìn)行稀釋；添加0.8%~1.2%(m/v)的活性炭，攪拌均勻后，攪拌器攪拌條件下反應(yīng)30min；然后添加1.0%~1.4%(m/v)的硅藻土作為助濾劑，實(shí)驗(yàn)室采用的硅藻土粒度統(tǒng)一為200目，攪拌均勻，使用800-1200目濾布經(jīng)板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾，除去菌體和活性炭，濾液添加相同量的硅藻土進(jìn)行二次板框處理去除殘留的活性炭，達(dá)到脫色并除菌的效果；

二是分級(jí)超濾：除菌后的濾液分別經(jīng)過截留分子量為10KDa、5000Da、3000Da、1000Da的中空纖維濾膜進(jìn)行超濾，其中截留分子量為10KDa的濾膜主要是截留分子量較大的多糖等物質(zhì)，截留分子量為1000Da的濾膜主要是去除小分子雜質(zhì)，獲得不同分子量區(qū)間的濾液；

三是成品制備：經(jīng)過超濾獲得的不同分子區(qū)間的濾液，經(jīng)過旋蒸濃縮、冷凍干燥制備聚蘋果酸的成品；真空干燥參數(shù)為真空度0.09MPa，溫度-50℃；

四是聚蘋果酸純度的測(cè)定：稱取一定量待測(cè)的聚蘋果酸成品，配成濃度為2g/L的溶液，采用水解的方法將聚蘋果酸水解成蘋果酸單體，通過反向高效液相色譜的方法測(cè)定水解液中蘋果酸的含量，進(jìn)一步折算成聚蘋果酸的含量，即可得出產(chǎn)品的純度；

五是聚蘋果酸分子量的測(cè)定：將聚蘋果酸樣品用流動(dòng)相稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋?.45μm的水膜過濾后，置于進(jìn)樣瓶中備用；然后用流動(dòng)相分別精確配置2g/L 不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，利用液相色譜檢測(cè)，得出色譜圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將樣品的液相檢測(cè)圖譜與標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比即可得出聚蘋果酸的分子量。

本發(fā)明所用菌種來(lái)源：天津北洋百川生物技術(shù)有限公司申請(qǐng)的專利名稱為一種惰性載體吸附固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)β-聚蘋果酸的方法，申請(qǐng)?zhí)柺?00910071171.2。該專利中公開了本發(fā)明所用菌種為出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào)CGMCC3337。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明針對(duì)出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的提取過程中存在雜質(zhì)多、工序繁瑣、損失率高等缺陷，進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，將除菌操作與脫色環(huán)節(jié)合并，在減少工序環(huán)節(jié)節(jié)約能源的同時(shí)，降低了聚蘋果酸的損失率；經(jīng)過分級(jí)超濾獲得不同分子區(qū)間的聚蘋果酸，不僅能截留大分子雜質(zhì)除小分子物質(zhì)，還能獲得不同分子量的聚蘋果酸；最后經(jīng)過濃縮、干燥即可獲得成品；本發(fā)明的提取工藝具有操作簡(jiǎn)單、工序少、綠色環(huán)保、損失率低等優(yōu)點(diǎn)，易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模提取過程，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；通過實(shí)驗(yàn)，效果明顯，分別獲得分子區(qū)間為1000~3000Da、3000~5000Da、5000~10KDa的聚蘋果酸成品。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

（1）發(fā)酵培養(yǎng)；

將出芽短梗霉斜面進(jìn)行活化，采用洗菌的方法將孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，28℃，200r/min條件下培養(yǎng)40h；培養(yǎng)好的種子液按10%(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，200r/min條件下培養(yǎng)144h，即可獲得聚蘋果酸的發(fā)酵液；

（2）分離純化；

一是板框過濾除菌脫色：發(fā)酵獲得發(fā)酵液，加入等體積的蒸餾水進(jìn)行稀釋。添加0.8% (m/v)的活性炭，攪拌均勻后，攪拌器攪拌條件下反應(yīng)30min；然后添加1.0% (m/v)的硅藻土作為助濾劑，實(shí)驗(yàn)室采用的硅藻土粒度統(tǒng)一為200目，攪拌均勻，使用800目濾布經(jīng)板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾，除去菌體和活性炭，濾液添加相同量的硅藻土進(jìn)行二次板框處理去除殘留的活性炭，達(dá)到脫色并除菌的效果；

二是分級(jí)超濾：除菌后的濾液分別經(jīng)過截留分子量為10KDa、5000Da、3000Da、1000Da的中空纖維濾膜進(jìn)行超濾，其中截留分子量為10KDa的濾膜主要是截留分子量較大的多糖等物質(zhì)，截留分子量為1000Da的濾膜主要是去除小分子雜質(zhì)，獲得不同分子量區(qū)間的濾液；

三是成品制備：經(jīng)過超濾獲得的不同分子區(qū)間的濾液，經(jīng)過旋蒸濃縮、冷凍干燥制備聚蘋果酸的成品；真空干燥參數(shù)為真空度0.09MPa，溫度-50℃；

經(jīng)上述提取方法，得到不同的分子區(qū)間的聚蘋果酸，分子區(qū)間在1000~3000Da、3000~5000Da、5000~10KDa的聚蘋果酸成品純度分別為81%、74.6%、80.9%。

實(shí)施例2

（1）發(fā)酵培養(yǎng)；

將出芽短梗霉斜面進(jìn)行活化，采用洗菌的方法將孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，28℃，200r/min條件下培養(yǎng)40h；培養(yǎng)好的種子液按10%(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，200r/min條件下培養(yǎng)144h，即可獲得聚蘋果酸的發(fā)酵液；

（2）分離純化；

一是板框過濾除菌脫色：發(fā)酵獲得發(fā)酵液，加入等體積的蒸餾水進(jìn)行稀釋。添加1.0% (m/v)的活性炭，攪拌均勻后，攪拌器攪拌條件下反應(yīng)30min；然后添加1.2% (m/v)的硅藻土作為助濾劑，實(shí)驗(yàn)室采用的硅藻土粒度統(tǒng)一為200目，攪拌均勻，使用1000目濾布經(jīng)板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾，除去菌體和活性炭，濾液添加相同量的硅藻土進(jìn)行二次板框處理去除殘留的活性炭，達(dá)到脫色并除菌的效果；

二是分級(jí)超濾：除菌后的濾液分別經(jīng)過截留分子量為10KDa、5000Da、3000Da、1000Da的中空纖維濾膜進(jìn)行超濾，其中截留分子量為10KDa的濾膜主要是截留分子量較大的多糖等物質(zhì)，截留分子量為1000Da的濾膜主要是去除小分子雜質(zhì)，獲得不同分子量區(qū)間的濾液；

三是成品制備：經(jīng)過超濾獲得的不同分子區(qū)間的濾液，經(jīng)過旋蒸濃縮、冷凍干燥制備聚蘋果酸的成品。真空干燥參數(shù)為真空度0.09MPa，溫度-50℃；

經(jīng)上述提取方法，得到不同的分子區(qū)間的聚蘋果酸。分子區(qū)間在1000~3000Da、3000~5000Da、5000~10KDa的聚蘋果酸成品純度分別為88.2%、84.7%、90.1%。

實(shí)施例3

（1）發(fā)酵培養(yǎng)；

將出芽短梗霉斜面進(jìn)行活化，采用洗菌的方法將孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，28℃，200r/min條件下培養(yǎng)40h；培養(yǎng)好的種子液按10%(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，200r/min條件下培養(yǎng)144h，即可獲得聚蘋果酸的發(fā)酵液；

（2）分離純化；

一是板框過濾除菌脫色：發(fā)酵獲得發(fā)酵液，加入等體積的蒸餾水進(jìn)行稀釋。添加1.2% (m/v)的活性炭，攪拌均勻后，攪拌器攪拌條件下反應(yīng)30min；然后添加1.4% (m/v)的硅藻土作為助濾劑，實(shí)驗(yàn)室采用的硅藻土粒度統(tǒng)一為200目，攪拌均勻，使用1200目濾布經(jīng)板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾，除去菌體和活性炭，濾液添加相同量的硅藻土進(jìn)行二次板框處理去除殘留的活性炭，達(dá)到脫色并除菌的效果；

二是分級(jí)超濾：除菌后的濾液分別經(jīng)過截留分子量為10KDa、5000Da、3000Da、1000Da的中空纖維濾膜進(jìn)行超濾，其中截留分子量為10KDa的濾膜主要是截留分子量較大的多糖等物質(zhì)，截留分子量為1000Da的濾膜主要是去除小分子雜質(zhì)，獲得不同分子量區(qū)間的濾液；

三是成品制備：經(jīng)過超濾獲得的不同分子區(qū)間的濾液，經(jīng)過旋蒸濃縮、冷凍干燥制備聚蘋果酸的成品；真空干燥參數(shù)為真空度0.09MPa，溫度-50℃；

經(jīng)上述提取方法，得到不同的分子區(qū)間的聚蘋果酸；分子區(qū)間在1000~3000Da、3000~5000Da、5000~10KDa的聚蘋果酸成品純度分別

為85.2%、84.7%、88.9%。