本發(fā)明涉及制備a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法,屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
L-谷氨酸氧化酶(EC 1.4.3.11,L-glutamate oxidase,GLOD)是以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的一種L-氨基酸氧化酶,是80年代初開始發(fā)現(xiàn)的一種新酶,最早從蛇的毒液、鼠的腎臟、無脊椎動物和微生物等生物體中分離純化得到。L-谷氨酸氧化酶能在不添加外源性輔助因子的條件下氧化L-谷氨酸脫氨,生成α-酮戊二酸和過氧化氫。GLOD 對催化反應(yīng)底物有高度的立體異構(gòu)選擇性,催化效率高,反應(yīng)條件溫和,已被廣泛用于食品、輕工、化工、醫(yī)藥、環(huán)保、能源和科研等各個領(lǐng)域。該酶自 20 世紀(jì) 80 年代被發(fā)現(xiàn)以來,一直是工具酶研究的熱點之一。現(xiàn)階段酶的主要研究集中在,一是借由現(xiàn)代的觀察及測定手段研究酶的結(jié)構(gòu)以及作用機制,二是利用酶的特性以及工程學(xué)的方法研究如何利用酶來服務(wù)于人類的生產(chǎn)、生活。
近年來,國內(nèi)外科學(xué)家先后分別從土壤中分離到能產(chǎn)生 GLOD 的鏈霉菌、放線菌,并建立了較完善的液體發(fā)酵產(chǎn)酶體系,制備了 GLOD 粗品,通過對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,純化得到的該酶都具有以下特性: 能專一性地催化L-谷氨酸生成過氧化氫、氨和a-酮戊二酸。目前,GLOD 發(fā)酵生產(chǎn)距工業(yè)化生產(chǎn)還有很大距離,這在很大程度上限制了其應(yīng)用。因此需要進(jìn)一步研究其發(fā)酵工藝,通過工藝優(yōu)化,改進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件,創(chuàng)造適合菌體生長和生物代謝的最佳條件,充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力,顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量。
L-谷氨酸氧化酶一方面可以應(yīng)用到測定 L-谷氨酸及其偶聯(lián)反應(yīng);另一方面則可以用于a-酮戊二酸的制備,進(jìn)而制備L-谷氨酸-a-酮戊二酸。國內(nèi)目前為止還沒有廠家對其進(jìn)行生產(chǎn),國外也只有一家生產(chǎn)重組于大腸桿菌的 L-谷氨酸氧化酶。價格的昂貴、來源的單一,嚴(yán)重制約著 L-谷氨酸氧化酶的應(yīng)用和發(fā)展。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種制備a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法,本發(fā)明克服了L-谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)a-酮戊二酸的瓶頸,轉(zhuǎn)化效率過,價格低廉易得,工藝簡單,產(chǎn)品純度高。
制備a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法,在pH為8.5的磷酸緩沖液中,添加L-谷氨酸氧化酶或者L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L(fēng)-谷氨酸鈉,37℃,200r/min 轉(zhuǎn)化 24 h,即得含a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化液。優(yōu)選的,磷酸緩沖液的終濃度為50mmol,L-谷氨酸氧化酶的終濃度為15U/ml, H2O2酶的終濃度為20U/ml、MnCl2的終濃度為5mmol,L-谷氨酸鈉的終濃度為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。
本發(fā)明中,利用菌株 MQO-160 制備L-谷氨酸氧化酶粗酶液的方法,具體如下:
(1)斜面培養(yǎng):將菌株 MQO-160 在無菌條件下接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行倒置培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28℃,培養(yǎng)時間為48h;
斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g,KNO3 1g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,NaCl 0.5g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g ,瓊脂20g,加純凈水至 1L,用 NaOH 調(diào) pH 至7.4-7.6,滅菌溫度115℃,15min。
(2)種子擴大培養(yǎng):從步驟(1)的斜面培養(yǎng)基上挑取菌落,加水稀釋獲得菌體溶液,將菌體溶液接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行擴大培養(yǎng),接種量為 10%(v/v),擴大培養(yǎng)的溫度為 28℃,搖床轉(zhuǎn)速 120r/min,培養(yǎng)時間為12h。
種子培養(yǎng)基:蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO4 6g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g,加純凈水至 1L,用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0,滅菌溫度 115℃,15min。
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將擴大培養(yǎng)后的菌體接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中,接種量為10%(v/v),擴大培養(yǎng)溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速150r/min,發(fā)酵周期36h。
發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30g,玉米漿干粉20g,蔗糖30g,酵母膏 1g, (NH4)2SO410g,谷氨酸鈉 10g,MgCl2 0.5g,KCl 0.5g,NaH2PO40.5g,用自來水配成 1L 溶液,用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0,滅菌溫度 121℃,滅菌時間 20min。
(4)30L 發(fā)酵罐培養(yǎng):將步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液接種到 30L
發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為10%(v/v),控制罐壓強為0.05MPa,在28℃條件下培養(yǎng) 48 小時,攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm,風(fēng)量為10 L/min,發(fā)酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液。
(5)將L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液先經(jīng)過陶瓷膜過濾,去除菌體,上清液再經(jīng)過反滲透膜濃縮50倍,即得L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。
本發(fā)明經(jīng)過對Streptomyces sp.206(土壤分離)進(jìn)行紫外誘變和化學(xué)誘變,篩選到一株谷氨酸酶活性較高的菌株,經(jīng)分離純化后獲得菌株MQO-160,其保藏編號為:CGMCC No.12892;保藏單位為:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;保藏日期為:2016 年8月22日;保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路 1 號院3 號。
菌株 MQO-160 的生物特性為:該菌株基內(nèi)和氣生菌絲均為乳白色,菌絲有較多的隔膜,氣生菌絲有較多的枝狀分支,部分菌絲處于旺盛的生長期,有芽狀結(jié)構(gòu),該菌株產(chǎn)生金黃色或紫紅色可溶性色素。該菌株孢子卵圓形、球形或柱形,表面光滑,孢子絲呈螺旋狀。菌株MQO-160分類命名為鏈霉菌Streptomyces sp.。
本發(fā)明采用一步酶促反應(yīng),轉(zhuǎn)化液中添加過氧化氫酶,避免了轉(zhuǎn)化過程過氧化氫對L-谷氨酸氧化酶的抑制作用,從而影響a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化合成,使a-酮戊二酸可以積累到較高的濃度。
本發(fā)明還包括將含a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化液的分離純化,具體步驟如下:
離子交換:將轉(zhuǎn)化液經(jīng)D301大孔弱堿性陰樹脂吸附后用水反洗樹脂至流出液清澈,用0.25N 鹽酸溶液洗脫,洗脫收率達(dá)到95%;
納濾:采用600-800分子量納濾膜過濾a-酮戊二酸洗脫液純化液得到a-酮戊二酸納濾清液,用3倍濃縮液體積的去離子水分3次清洗濃縮液后,棄去濃縮液,收集含a-酮戊二酸產(chǎn)品的納濾透析液,該步驟收率達(dá)到97%;
活性炭脫色:pH 3.0,用活性炭進(jìn)行脫色,活性炭的用量為a-酮戊二酸納濾清液的1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),脫色溫度為50℃,脫色時間為30min,用0.22μm濾膜過濾得脫色液,脫色液透光率≥99%,脫色收率達(dá)到99%;
反滲透濃縮:將a-酮戊二酸脫色液經(jīng)反滲透膜濃縮至原體積一半得到a-酮戊二酸預(yù)濃縮液,反滲透收率達(dá)到99%;
濃縮結(jié)晶:將預(yù)濃縮液在真空度≥0.095,蒸發(fā)溫度50℃條件下濃縮至含量≥80%的濃縮液,將濃縮液攪拌冷卻至20℃結(jié)晶5h。
干燥:結(jié)晶結(jié)束后,抽濾獲得晶體,將結(jié)晶晶體50℃真空干燥,得到a-酮戊二酸成品。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下有益效果:
(1)篩選到了一株MQO-160,解決了酶轉(zhuǎn)化工藝酶來源和酶成本高的限制;
(2)采用L-谷氨酸發(fā)酵純化液作為轉(zhuǎn)化原料,克服了L-谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)a-酮戊二酸的瓶頸,價格低廉易得,工藝簡單,產(chǎn)品純度高;
(3)采用膜分離、納濾脫色、膜濃縮等先進(jìn)處理工藝節(jié)省了能耗,節(jié)省了活性炭的用量,減少了對環(huán)境的污染,降低了生產(chǎn)成本,提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
(4)本發(fā)明L-谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)a-酮戊二酸中底物轉(zhuǎn)化率87%,轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物濃度可達(dá)105g/L,a-酮戊二酸的一次性提取收率50%。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的,并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是,在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換,但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
菌株MQO-160,其保藏編號為:CGMCC No.12892;保藏單位為:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;保藏日期為:2016 年8月22日;保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路 1 號院3 號。
實施例1 制備a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法
在pH為8.5的磷酸緩沖液中,添加L-谷氨酸氧化酶或者L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L(fēng)-谷氨酸鈉,37℃,200r/min 轉(zhuǎn)化 24 h,即得含a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化液;磷酸緩沖液的終濃度為50mmol,L-谷氨酸氧化酶的終濃度為15U/ml, H2O2酶的終濃度為20U/ml、MnCl2的終濃度為5mmol,L-谷氨酸鈉的終濃度為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。
實施例2利用菌株 MQO-160 制備L-谷氨酸氧化酶粗酶液的方法
具體如下:
(1)斜面培養(yǎng):將菌株 MQO-160 在無菌條件下接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行倒置培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28℃,培養(yǎng)時間為48h;
斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉20g,KNO3 1g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,NaCl 0.5g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g ,瓊脂20g,加純凈水至 1L,用 NaOH 調(diào) pH 至7.4-7.6,滅菌溫度115℃,15min。
(2)種子擴大培養(yǎng):從步驟(1)的斜面培養(yǎng)基上挑取菌落,加水稀釋獲得菌體溶液,將菌體溶液接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行擴大培養(yǎng),接種量為 10%(v/v),擴大培養(yǎng)的溫度為 28℃,搖床轉(zhuǎn)速 120r/min,培養(yǎng)時間為12h。
種子培養(yǎng)基:蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO4 6g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g,加純凈水至 1L,用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0,滅菌溫度 115℃,15min。
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將擴大培養(yǎng)后的菌體接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中,接種量為10%(v/v),擴大培養(yǎng)溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速150r/min,發(fā)酵周期36h。
發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30g,玉米漿干粉20g,蔗糖30g,酵母膏 1g, (NH4)2SO410g,谷氨酸鈉 10g,MgCl2 0.5g,KCl 0.5g,NaH2PO40.5g,用自來水配成 1L 溶液,用 NaOH 調(diào) pH 至 7.0,滅菌溫度 121℃,滅菌時間 20min。
(4)30L 發(fā)酵罐培養(yǎng):將步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液接種到 30L
發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為10%(v/v),控制罐壓強為0.05MPa,在28℃條件下培養(yǎng) 48 小時,攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm,風(fēng)量為10 L/min,發(fā)酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液。
(5)將L-谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液先經(jīng)過陶瓷膜過濾,去除菌體,上清液再經(jīng)過反滲透膜濃縮50倍,即得L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。
實施例3 菌株 MQO-160 的生物特性
菌株 MQO-160的基內(nèi)和氣生菌絲均為乳白色,菌絲有較多的隔膜,氣生菌絲有較多的枝狀分支,部分菌絲處于旺盛的生長期,有芽狀結(jié)構(gòu),該菌株產(chǎn)生金黃色或紫紅色可溶性色素。該菌株孢子卵圓形、球形或柱形,表面光滑,孢子絲呈螺旋狀。
實施例4含a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化液的分離純化
具體步驟如下:
離子交換:將轉(zhuǎn)化液經(jīng)D301大孔弱堿性陰樹脂吸附后用水反洗樹脂至流出液清澈,用0.25N HCl溶液洗脫,洗脫收率達(dá)到95%;
納濾:采用600-800分子量納濾膜過濾a-酮戊二酸洗脫液純化液得到a-酮戊二酸納濾清液,用3倍濃縮液體積的去離子水分3次清洗濃縮液后,棄去濃縮液,收集含a-酮戊二酸產(chǎn)品的納濾透析液,該步驟收率達(dá)到97%;
活性炭脫色:pH 3.0,用活性炭進(jìn)行脫色,活性炭的用量為a-酮戊二酸納濾清液的1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),脫色溫度為50℃,脫色時間為30min,用0.22μm濾膜過濾得脫色液,脫色液透光率≥99%,脫色收率達(dá)到99%;
反滲透濃縮:將a-酮戊二酸脫色液經(jīng)反滲透膜濃縮至原體積一半得到a-酮戊二酸預(yù)濃縮液,反滲透收率達(dá)到99%;
濃縮結(jié)晶:將預(yù)濃縮液在真空度≥0.095,蒸發(fā)溫度50℃條件下濃縮至含量≥80%的濃縮液,將濃縮液攪拌冷卻至20℃結(jié)晶5h。
干燥:結(jié)晶結(jié)束后,抽濾獲得晶體,將結(jié)晶晶體50℃真空干燥,得到a-酮戊二酸成品。
試驗例1 a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化條件的確定
(1)反應(yīng)溫度的確定 反應(yīng)溫度對a-酮戊二酸產(chǎn)量的影響,在25℃-42℃范圍內(nèi)的不同溫度下,轉(zhuǎn)化反應(yīng)l0h的情況,溫度越高a-酮戊二酸產(chǎn)率越高,37℃達(dá)到最高,超過37℃則產(chǎn)率下降。
(2)pH的確定 pH對a-酮戊二酸產(chǎn)量的影響,配制不同pH條件下的底物溶液(pH6.0-10.0),在37℃下反應(yīng)10h,考察pH對酶活(產(chǎn)物量)的影響,pH為8.5時目的產(chǎn)物濃度最高,即相對酶活最高。
(3)轉(zhuǎn)速的確定 轉(zhuǎn)速對a-酮戊二酸產(chǎn)量的影響,當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時a-酮戊二酸產(chǎn)量最大。
(4)底物濃度和反應(yīng)時間的確定 底物濃度和反應(yīng)時間對a-酮戊二酸產(chǎn)量的影響,隨著L-谷氨酸濃度的增大,a-酮戊二酸濃度達(dá)到最大所需要的時間逐漸延長。當(dāng)L-谷氨酸濃度為10%時,轉(zhuǎn)化24h a-酮戊二酸濃度達(dá)到最大,延長時間產(chǎn)物濃度不再增加而趨于穩(wěn)定;當(dāng)L-谷氨酸濃度繼續(xù)增加時,產(chǎn)物a-酮戊二酸的產(chǎn)量不再增加而趨于穩(wěn)定,此時增加底物濃度已沒有意義,故而選擇底物L(fēng)-谷氨酸濃度為10%,轉(zhuǎn)化時間為24h。
試驗例2 a-酮戊二酸摩爾轉(zhuǎn)化率的測定
將菌體接種到50mL 液體培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的含有谷氨酸氧化酶的發(fā)酵液4 ℃下4000 r/min 離心30min,去除菌體,上清液再經(jīng)過反旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮50倍即為酶轉(zhuǎn)化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。在pH為8.5的磷酸緩沖液中,添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L(fēng)-谷氨酸鈉,37℃,200r/min 轉(zhuǎn)化 24 h,即得含a-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化液;磷酸緩沖液的終濃度為50mmol,L-谷氨酸氧化酶的終濃度為15U/ml, H2O2酶的終濃度為20U/ml、MnCl2的終濃度為5mmol,L-谷氨酸鈉的終濃度為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。6000 r/ min 離心10 min, 測定上清液中的a-酮戊二酸濃度, 并計算底物谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率y,以此表示谷氨酸氧化酶的活力。本發(fā)明測得谷氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為87%。
y=nA/nB
其中nA為轉(zhuǎn)化液中a-酮戊二酸的物質(zhì)的量(mol);nB為轉(zhuǎn)化液中原始的谷氨酸的物質(zhì)的量(mol)。