一種促進(jìn)丙酮酸分泌的基因、其提取方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)丙酮酸分泌的基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠分泌各種有機(jī)酸，比較常見的有機(jī)酸有琥珀酸、檸檬酸、 α_酮戊二酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸和草酸。這些有機(jī)酸具有多種 作用，在農(nóng)業(yè)上，能夠溶解土壤無(wú)機(jī)磷提高土壤磷素的利用率，有機(jī)酸與土壤中鐵、鋁、鈣等 離子螯合，從而使難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷，提高磷肥利用率。
[0003] 丙酮酸分子式CH3C0C00H，可通過(guò)乙酰CoA和三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基 酸間的互相轉(zhuǎn)化，在三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用，是參與整個(gè)生物體 基本代謝的中間產(chǎn)物之一。丙酮酸用途和廣泛，可用于生產(chǎn)色氨酸、苯丙氨酸和維生素 B的 主要原料，是生物合成L-多巴的原料，也是乙烯聚合物的起始劑，是殺菌劑噻菌靈的中間 體，也是一種食品用香料;丙酮酸及它生成的鹽，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用很廣，用于生產(chǎn)鎮(zhèn)靜劑、抗 氧劑、抗病毒劑、合成治療尚血壓的藥物等等。
[0004] 微生物的溶磷機(jī)理大致分為5種:有機(jī)酸、氫質(zhì)子(NH4-N供應(yīng)）、磷酸酶(蛋白質(zhì)）、 螯合作用和氧化還原，其中產(chǎn)生有機(jī)酸是一種主要的溶磷方式，有機(jī)酸能與鐵、鋁、鈣等離 子螯合，從而使難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷(唐超西，龔明波，2012,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，45(18) :3792-3800. )〇
[0005] 關(guān)于溶磷相關(guān)基因研究以細(xì)菌為主，其主要機(jī)制是將葡萄糖直接氧化產(chǎn)生葡萄糖 酸(GA)，其中葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脫氫酶(GDH)和協(xié)同因子吡咯喹啉奎寧(PQQ)完成 (Goldstein AH，1999，F(xiàn)EMS Microbiology Ecology，30(4) :295-300.)。目前關(guān)于真菌溶磷 相關(guān)基因的克隆也有報(bào)道，主要是以黑曲霉和草酸青霉為主，但其數(shù)量非常少，主要機(jī)制也 不是很明確，也有報(bào)道從草酸青霉中克隆到的基因編碼合成蘋果酸脫氫酶在大腸桿菌中表 達(dá)，分泌蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、草酸等有機(jī)酸從而使難溶磷溶解(Gong MB，2014， Canadian Journal of Microbiology,60:1-5)〇
[0006] 目前，在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)布 了真菌Aspergi 1 lus niger CBS 5 13 · 88 (XM_ 001398218.2)的全基因組序列，與本發(fā)明序列同源性都為99%，該基因編碼的蛋白與 Aspergillus niger CBS 513.88編碼的蛋白disulfide isomerase(XP_001399725.1)的蛋 白同源性為100% 以及Aspergillus kawachii IF0 4308編碼的蛋白disulfide isomerase (GAA82152.1)的蛋白同源性為99%，但未報(bào)到其具有產(chǎn)生丙酮酸的功能。其它報(bào)道的都為 假定蛋白，沒(méi)有進(jìn)行功能分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)本領(lǐng)域存在的不足之處，本發(fā)明的目的是提出一種促進(jìn)分泌丙酮酸的基因 psa C〇
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提出所述基因 psa C的提取方法。
[0009]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提出所述基因 psa C的應(yīng)用。
[0010]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術(shù)方案為：
[0011] 一種基因 psa C，所述基因 psa C的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0012] -種所述的基因 psa c編碼的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 [0013]本發(fā)明所述基因 psa C的提取方法，包括步驟：
[0014] 1)在難溶磷無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)黑曲霉菌HI (Aspergillus niger H1)，從培養(yǎng)的 黑曲霉菌H1基因組中提取總RNA，再?gòu)目俁NA中純化出mRNA，用引物5 ' - (GA) 1QACTAGTCTCGAG (T)18V-3'（V:A or C or G擴(kuò)增，合成cDNA第一鏈；
[0015] 2) cDNA 第一鏈以 5 ' -AAGCTTAAGGGTATCAACGCAGAGTAC-3為引物，通過(guò) LD-PCR 合成雙 鏈cDNA，
[0016] 3)將cDNA序列連接到pBluescript SK 11( + )上，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌上， 通過(guò)難溶磷培養(yǎng)基篩選具有溶磷透明圈的轉(zhuǎn)化子；
[0017] 4)篩選出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，篩選克隆子進(jìn)行測(cè)序分析，得到全長(zhǎng)為1007bp 的cDNA序列，利用DNAMAN分析其基因開放閱讀框?yàn)?08個(gè)氨基酸。
[0018] 其中，步驟1)可用RNAiso plus試劑盒提取總RNA，用Oligotex mRNA Mini Kit試 劑盒從總RNA中純化mRNA。
[0019] PCR反應(yīng)條件可以為：95°C預(yù)變性lmin;95°C變性158;65°(：退火3〇8,68°(：延伸 6min，30cycles 4°Cforever〇
[0020] 其中，步驟3)所述電轉(zhuǎn)化的條件為:每50yL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞施加電量25yF，電 擊的電壓為1.5KV。
[0021] 本發(fā)明還提出含有本發(fā)明所述基因的載體。
[0022] 其中，所述載體可以為表達(dá)載體pBluescript SK 11( + )。
[0023]含有本發(fā)明所述基因的工程菌。
[0024] 其中，所述工程菌為大腸桿菌。所述大腸桿菌可以為E.coli HST08。
[0025] 本發(fā)明還提出所述基因的應(yīng)用，即，基因 psa C在生產(chǎn)丙酮酸中的應(yīng)用。
[0026]以及，基因 psa C在溶解無(wú)機(jī)難溶磷中的應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明從黑曲霉H1中克隆溶磷基因，其編碼的蛋白導(dǎo)入大腸桿菌中，在難溶磷無(wú) 機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h時(shí)，促進(jìn)大腸桿菌分泌丙酮酸，含量達(dá)到1706yg/mL，溶液的pH值從 6.45降到3.34，釋放的可溶磷含量為0.18mg/mL。
[0028]本發(fā)明的有益效果在于：
[0029] 1、本發(fā)明首先提供了溶磷基因 psa C的核苷酸序列；
[0030] 2、本發(fā)明通過(guò)異源表達(dá)克隆得到的溶磷基因，利用大腸桿菌可高效產(chǎn)生丙酮酸；
[0031] 3、本發(fā)明通過(guò)異源表達(dá)克隆到的溶磷基因具有將難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷的效果。
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為實(shí)施例1黑曲霉菌H1在難溶磷無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的形態(tài)。
[0033]圖2為實(shí)施例1黑曲霉菌H1的總RNA圖。
[0034]圖3為實(shí)施例2中攜帶溶磷基因的克隆子。
[0035]圖4為工程菌培養(yǎng)不同溶液pH值的變化。
[0036] 圖5為工程菌培養(yǎng)不同溶液可溶磷含量的變化。
[0037] 圖6為實(shí)施例5大腸桿菌產(chǎn)丙酮酸的液相色譜圖。
[0038]圖7為5200mg/L的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)樣品液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，本發(fā)明的范圍不僅限于特定的實(shí)施方案，在不脫離本發(fā)明的精神下可以 進(jìn)行各種修飾和改變。
[0040] 實(shí)施例中，大腸桿菌菌種購(gòu)自大腸桿菌菌種購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公 司。
[0041] 如未特別說(shuō)明，【具體實(shí)施方式】中所采用的手段均為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段。
[0042] 實(shí)施例1黑曲霉菌的cDNA全長(zhǎng)文庫(kù)構(gòu)建
[0043]實(shí)驗(yàn)所用菌株黑曲霉H1為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所農(nóng)業(yè)菌種 保藏中心從土壤樣品中篩選，在難溶磷無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，取0.2g左右新鮮菌絲(如圖 1)，液氮研磨，利用RNAiso plus試劑盒提取總RNA，用Oligotex mRNA Mini Kit試劑盒從總 尺財(cái)中純化出1111?麻。每個(gè)離心管加入241^純化的1111?麻，141^濃度為124]\1的3'5]\^1?1'〇03 PrimerIIA(5，-(GA)iQACTAGTCTCGAG(T)18V-3'（V:A or C or G))，最后用RNase Free H20 補(bǔ)足至終體積為4.5yL，使溶液充分混勻后離心，72 °C水浴3min，立即轉(zhuǎn)到42 °C水浴2min，立 即向每個(gè)離心管中加入5.5yL混合液(表1)，充分混勻后離心，置于42°C水浴90min，立即放 置冰上，cDNA第一鏈合成，產(chǎn)物立即進(jìn)行LD-PCR或-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0044] 衷1第一鏈合成混合液
[0045]
[0046] 以2yL第一鏈cDNA產(chǎn)物為模板，SMARTer