一種促進仔豬生長的生物活性肽及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種促進仔豬生長的生物活性肽，所述生物活性肽包含SEQ IDNo.1所示氨基酸序列，該生物活性肽可明顯提高仔豬對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，促進仔豬的生長發(fā)育，降低發(fā)病率，提高仔豬存活率。進一步的，提供了促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法及其在促進仔豬生長、降低仔豬死亡率中的應(yīng)用，通過多種產(chǎn)酶益生菌的協(xié)同作用下產(chǎn)生促進仔豬生長發(fā)育的生物活性肽，應(yīng)用于仔豬，促進機體合成代謝和脂肪分解，促使蛋白質(zhì)合成，達到促進仔豬的生長，提高其生長速度的目的，通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素水平，發(fā)揮促進仔豬生長發(fā)育的作用，克服了激素殘留的問題，達到健康綠色養(yǎng)殖的目的。
【專利說明】
一種促進仔豬生長的生物活性肽及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種有效促進仔豬生長發(fā)育、提高其 生長速度促進仔豬生長的生物活性肽及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 仔豬的生長發(fā)育是關(guān)系到生豬生產(chǎn)的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，由于仔豬獨特的消化生理結(jié) 構(gòu)，其消化器官不健全，消化腺的生理機能不完善，缺乏先天性免疫力，體溫調(diào)節(jié)機能不健 全，對寒冷應(yīng)激的抵抗力差，仔豬在一般飼養(yǎng)條件下，多種疾病的發(fā)病率高，存活率低。提高 仔豬對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，促進仔豬的生長發(fā)育，降低發(fā)病率，提高仔豬存活 率，是豬場普遍關(guān)注的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種具有安全、環(huán)保、無殘留，能提高仔豬的生長速度，降 低仔豬的死亡率的優(yōu)點的促進仔豬生長的生物活性肽及其制備方法和應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明第一方面提供了一種促進仔豬生長的生物活性肽，所述生物活性肽包含 SEQ ID No. 1所示氨基酸序列。
[0005] 本發(fā)明第二方面提供了上述促進仔豬生長的生物活性肽在促進仔豬生長、降低仔 豬死亡率中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明第三方面提供了上述促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，包括如下步 驟：
[0007] A、分別篩選乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲 酵母后培養(yǎng)；
[0008] B、將步驟A所得乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假 絲酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵，提取發(fā)酵液上清液后濃縮、干燥，分離提純后得生物活性肽。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的促進仔豬生長發(fā)育的生物活性肽，應(yīng)用于生 長階段的仔豬，通過促進機體合成代謝和脂肪分解，促使蛋白質(zhì)合成，達到促進仔豬的生 長，提高其生長速度的目的。生物活性肽，不是生物激素，而是一種能夠模擬激素生物活性 的多肽，通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素水平，發(fā)揮促進仔豬生長發(fā)育的作用，克服了激素殘留 的問題，達到健康綠色養(yǎng)殖的目的。實際應(yīng)用的結(jié)果證明，本發(fā)明提供的促進仔豬生長發(fā)育 的生物活性肽可使仔豬平均日增重提高6.38 % (P<0.05 )，仔豬斷奶之后，采食量增加 4.16%(P<0.05)，死亡率較未使用生物活性肽的死亡率降低50% (P<0.05)，效果明顯。
【具體實施方式】
[0010] 本發(fā)明第一方面提供了一種促進仔豬生長的生物活性肽，所述生物活性肽包含 SEQ ID No. 1所示氨基酸序列。
[0011] 該種生物活性肽是具有十三個氨基酸殘基的多肽，其氨基酸序列為Arg-Pro-Cys- Leu-Ser-Ala-Glu-I Ie-Leu-Ser-Thr-Ser-Val，含有精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、 亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸等多種必需氨基酸和限制性氨基酸，形成一定的分子空間結(jié)構(gòu)。仔 豬消化道的生理機能發(fā)育不完全，分泌的蛋白酶的數(shù)量和種類少，難以降解該種生物活性 肽。該種生物活性肽在仔豬胃腸道內(nèi)，通過仔豬發(fā)育不完全的腸道細胞進入到仔豬的循環(huán) 系統(tǒng)，發(fā)揮類似激素樣作用，促進合成代謝能力，加快N沉積，增強蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮促進 仔豬生長發(fā)育的作用，達到健康綠色養(yǎng)殖的目的。
[0012] 多肽類作為蛋白水解的產(chǎn)物，有著許多蛋白質(zhì)不具備的生物活性和物理性質(zhì)。豆 柏、魚粉等蛋白原料富含多種蛋白質(zhì)，通過多種產(chǎn)蛋白酶的益生菌利用蛋白原料，進行同步 復(fù)合培養(yǎng)，發(fā)酵降解產(chǎn)生能促進仔豬生長的生物活性肽。這種生物活性肽，安全、高效、環(huán) 保、無殘留，能提高仔豬的生長速度，降低仔豬的死亡率，可成為激素類促生長藥物的安全 有效替代物。
[0013] 本發(fā)明第二方面提供了上述促進仔豬生長的生物活性肽在促進仔豬生長、降低仔 豬死亡率中的應(yīng)用。
[0014] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述應(yīng)用為將生物活性肽凍干粉用人工胃液稀釋后對 仔豬進行灌服。該生物活性肽的應(yīng)用方式包括但不限于這一種，還可以通過配制在仔豬飼 料中等多種方式進行應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明第三方面提供了上述促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，包括如下步 驟：
[0016] A、分別篩選乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲 酵母后培養(yǎng)；
[0017] B、將步驟A所得乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假 絲酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵，提取發(fā)酵液上清液后濃縮、干燥，分離提純后得生物活性肽。
[0018] 所述的促進仔豬生長發(fā)育的生物活性肽是在多種產(chǎn)酶益生菌的協(xié)同作用下產(chǎn)生 的。通過人工誘變提高益生菌產(chǎn)酶特性、產(chǎn)酶量及酶活，將乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié) 芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母按照相應(yīng)的不同配比進行同步復(fù)合培養(yǎng)，不同的益 生菌菌種在同一培養(yǎng)條件下表達分泌酶類，降解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)類、多糖類等大分子物 質(zhì)，為芽孢桿菌類菌種的代謝活動提供氨基酸、維生素、寡糖、有機酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，從而 促進其代謝形成相應(yīng)的生物活性肽。將該種生物活性肽應(yīng)用于生長階段的仔豬，可通過仔 豬尚未發(fā)育成熟的胃腸道粘膜屏障直接進入到仔豬血液循環(huán)，發(fā)揮類似激素生物活性作 用，增強動物機體合成代謝，加快氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促使蛋白質(zhì)合成， 促進仔豬的生長發(fā)育，提高其生長速度，達到健康綠色養(yǎng)殖的目的。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明實施例提供的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，該方法還可以 具有如下附加的技術(shù)特征：
[0020] 優(yōu)選的，步驟A所述篩選包括如下步驟：
[0021] a、初篩:將乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵 母分別加入至酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基的無菌平板上，紫外誘變培養(yǎng)后選取透明圈直徑和菌 落直徑比(HC)大于1.5的菌落移種培養(yǎng)；
[0022] b、復(fù)篩:將經(jīng)過步驟a得到的各優(yōu)勢菌株進行微波誘變后，采用酪蛋白分離篩選培 養(yǎng)基，30-34Γ下恒溫培養(yǎng)2-3天，選取透明圈直徑和菌落直徑比(HC)大于1.5的菌落移種培 養(yǎng)；
[0023] c、再復(fù)篩:將經(jīng)過步驟b得到的各優(yōu)勢菌株分別與180-220yg/mL亞硝基胍溶液等 體積混合后30-35 °C下培養(yǎng)20-30min，終止反應(yīng)后洗滌、配制為菌懸液，將菌懸液涂布于酪 蛋白分離篩選培養(yǎng)基平板，35-39°C下培養(yǎng)34-38小時，選取透明圈直徑和菌落直徑比（HC) 大于1.5的菌落。
[0024]更加優(yōu)選的，上述步驟b所述的微波誘變步驟包括:850W最大功率、額定微波頻率 2450MHz的微波爐里，微波輻照45-55s，且每隔5-10s冰浴處理，微波輻照結(jié)束后避光冷藏 10-14小時。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，步驟A所述培養(yǎng)步驟包括:將篩選后的乳酸腸球菌、地 衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40小時，再轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于35-39°C下培養(yǎng)45-50小時。
[0026]優(yōu)選的，步驟B所述混合培養(yǎng)發(fā)酵步驟包括：以質(zhì)量百分比計，按乳酸腸球菌20-23%、地衣芽孢桿菌22-25%、凝結(jié)芽孢桿菌26-30%、短小芽孢桿菌10-14%、產(chǎn)朊假絲酵母 14-17%的比例接種于同一裝有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)。
[0027]更加優(yōu)選的，步驟B所述乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿 菌、產(chǎn)朊假絲酵母分別按8%-12%的接種量接種于種子液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)馴化10-14小時后 進行混合培養(yǎng)發(fā)酵。
[0028]更加優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為pH7.2-7.4，攪拌轉(zhuǎn)速180-220rpm，溫度為35-39°C，通氣量1:0 · 5-1:0 · 7，發(fā)酵時間22-24小時。
[0029] 優(yōu)選的，步驟B所述分離提純步驟包括:將濃縮、干燥后的產(chǎn)品配置為溶液，依次經(jīng) 101(0&、51(0 &、31(0&、11(0&的超濾膜逐級分離，收集得到生物活性肽超濾片段，再進行交聯(lián)葡 聚糖凝膠色譜純化，洗脫流速0.8-1.2mL/h，檢測波長為220nm，收集組分后冷凍干燥。
[0030] 下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的促進仔豬生長的生物活性肽及其制備方 法和應(yīng)用予以進一步說明。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解 為對本發(fā)明的限制。
[0031] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實 驗材料如無特殊說明，均為市場購買得到。
[0032] 實施例1
[0033] 本實施例所采用的所有菌種都是可在飼料中添加的微生物菌種，且乳酸腸球菌、 地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母均是由農(nóng)業(yè)微生物學國家重點 實驗室提供，市場上購得的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊 假絲酵母也能達到非常近似的效果。
[0034] -、本實施例的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法包括如下步驟：
[0035] 第一步:培育菌種，利用誘變育種技術(shù)對各菌種進行優(yōu)選。
[0036]在功率為20W的紫外燈、30cm照射距離下，將保存的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝 結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母的菌懸液2mL分別酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基的無菌 平板上，照射2-3分鐘培養(yǎng)計數(shù)，觀察在酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基上的透明圈，選取透明圈直 徑和菌落直徑比(HC)大于1.5的菌落移種至試管斜面上培養(yǎng)。選取經(jīng)紫外誘變后優(yōu)勢較好 的菌株，制成IO 6-IO8AiL的菌懸液，在850W最大功率、額定微波頻率2450MHz的微波爐里，微 波輻照55s，且每隔IOs冰浴處理消除熱效應(yīng)，避光4°C冷藏14小時，涂布于酪蛋白分離篩選 培養(yǎng)基，35°C恒溫培養(yǎng)2天后，觀察在酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基上的透明圈，選取透明圈直徑 和菌落直徑比(HC)大于1.5的菌落移種至試管斜面上培養(yǎng)。選取經(jīng)微波誘變后優(yōu)勢較好的 菌株，用無菌水制成IO 6-IO8AiL的菌懸液，將其與200yg/mL亞硝基胍溶液等體積置于潔凈的 錐形瓶內(nèi)混勻，35°C下處理20min后用冷生理鹽水稀釋到50倍終止反應(yīng)，離心洗滌3次去除 藥物，再稀釋成IO 6-IO8倍菌懸液，取〇.2mL菌懸液均勻涂布于酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基平板 上，將平板倒置于39°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)34小時，選取透明圈直徑和菌落直徑比（HC)大于 1.5的菌落移種至試管斜面上作為生產(chǎn)制菌。
[0037] 所述亞硝基胍溶液的配制：精確稱取0.020g亞硝基胍，置于IOOmL的容量瓶中，加 入適量的丙酮溶液助溶，加入PH7.2的磷酸鹽緩沖液定容，制得200yg/mL亞硝基胍溶液，4°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0038]所述酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基:干酪素0.4-0.6 %、牛肉膏0.2-0.4 % g、蛋白胨0.5-1.5%、氯化鈉0.5-1.5%、瓊脂1.0-2.0%、？!17.0-7.2、蒸餾水100011^，121°(：滅菌18-2211^11。 [0039] 第二步:生產(chǎn)制菌
[0040] 將篩選出來的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假 絲酵母分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)40小時，再轉(zhuǎn)接至裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄 子瓶中，于37 °C下培養(yǎng)48小時，放入4°C冰箱保存。
[0041] 所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:葡萄糖5.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5. Og， 無菌水 1000mL、pH7 · 0-7 · 2，121°C 滅菌 20-25min。
[0042]所述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3. Og、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5. Og、瓊脂20.0 g，無菌水 100011^、？!17.0-7.2，121。(：滅菌20-2511^11。
[0043]第三步:復(fù)合菌的同步培養(yǎng)
[0044]將保存的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵 母，按12%的接種量分別接種于種子液培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)14小時。
[0045]按以下重量百分比稱取各菌種:乳酸腸球菌20%、地衣芽孢桿菌25%、凝結(jié)芽孢桿 菌30%、短小芽孢桿菌10%、產(chǎn)朊假絲酵母15%。
[0046]將培養(yǎng)的所有菌種按重量百分比接種于同一裝有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)， pH7.2-7.4，攪拌轉(zhuǎn)速180-220rpm，培養(yǎng)溫度為35-39°C，通氣量1:0.5-1:0.7，發(fā)酵時間為24 小時。
[0047] 所述種子液培養(yǎng)基：葡萄糖1-3 %、酵母膏0.5-1.0 %、蛋白胨0.5-1.5 %、牛肉膏 0.5-1 ·0%、硫酸鎂0.05-0.1%、磷酸二氫鉀0.05-0.15%、無菌水94-96%、ρΗ7·0-7.2,121 °C 滅菌 20_25min。
[0048] 所述發(fā)酵液培養(yǎng)基：豆柏10-15%、魚粉8-12%、麥麩4-10%、玉米漿6-10%、葡萄 糖1-3 %、氯化鈉0.5-1.5 %、酵母膏0.5-1.0 %、硫酸鎂0.05-0.1 %、磷酸二氫鉀0.5-1.0 %， 硫酸銨0 · 5-1 · 5 %、硫酸錳0 · 005-0 · 01 %、硫酸亞鐵0 · 01-0 · 03 %，無菌水62-65 %，pH7 · 2-7·4，121Γ 滅菌 20-25min。
[0049] 第四步:生物活性肽的分離
[0050] 在復(fù)合菌的最佳發(fā)酵條件下完成對復(fù)合蛋白原料的發(fā)酵后，將發(fā)酵液在4500-5500rpm轉(zhuǎn)速條件下離心25-35min，取上清液進行真空濃縮，冷凍干燥制得生物活性肽的粗 品。
[0051]將生物活性肽的粗品溶解于去離子水中，配置成溶液，用截留分子量為IOKDa的超 濾膜對生物活性肽的粗品溶液進行分離，收集所得到透過液，再經(jīng)截留分子量為5KDa的超 濾膜進一步分離，隨后按照同樣的方法分別采用3KDa、lKDa的超濾膜逐級分離，將最后收集 得到生物活性肽超濾片段，經(jīng)真空濃縮后，冷凍干燥成凍干粉備用。再將生物活性肽超濾片 段凍干粉溶解于去離子水中配置成質(zhì)量體積濃度為50mg/mL的溶液，混合均勻后上樣2mL進 行交聯(lián)葡聚糖凝膠色譜純化，洗脫流速為〇. 8-1.2mL/h，檢測波長為220nm，利用自動收集器 進行分離組分的收集，重復(fù)多次上樣，不斷富集各組分并冷凍干燥得到生物活性肽的純品， 保存?zhèn)溆?。對分離提純的多肽進行氨基酸測序，其氨基酸序列為Arg-Pro-Cys-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Leu-Ser-Thr-Ser-Val，如序列表SEQ ID No. 1 所不。
[0052]二、將制備得到的生物活性肽應(yīng)用于仔豬，評價生物活性肽促仔豬生長的效果，具 體方法包括：
[0053] 人工胃液的制備:量取234mL濃鹽酸加入無菌水稀釋至lOOOmL，制得10%稀鹽酸。 取該稀鹽酸16.4mL，加入無菌水800mL和胃蛋白酶IOg，攪拌均勾，加入無菌水稀釋至1000 mL 即得。
[0054]供試品溶液的制備:精確稱取生物活性肽凍干粉成品0.04g，用100.0 g人工胃液溶 解稀釋制成供試品溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0055] 選取10-15日齡的仔豬100頭，隨機分為A、B兩組，每組50頭。對每頭仔豬用編號的 耳部標號分別加以識別。A組作為對照組，每天灌服2mL的供試品溶液，連續(xù)灌喂20天;B組作 為對照組，自由飲水、采食，與A組的區(qū)別僅在于未灌服供試品溶液。每天觀察仔豬的生長狀 態(tài)，對仔豬進行稱重，并作好記錄。為期20天的試驗，試驗組的仔豬平均日增重提高6.38% (P<0.05)，仔豬斷奶之后，采食量增加4.16%(P<0.05)，死亡率較對照組降低50% (P< 0.05)〇
[0056] 實施例2
[0057] 本實施例所采用的所有菌種都是可在飼料中添加的微生物菌種，且乳酸腸球菌、 地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母均是于市場上購得，不同廠家 的菌種均能達到近似的效果。
[0058] 一、本實施例的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法包括如下步驟：
[0059] 第一步:培育菌種，利用誘變育種技術(shù)對各菌種進行優(yōu)選。
[0060] 在功率為20W的紫外燈、30cm照射距離下，將保存的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝 結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母的菌懸液2mL分別酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基的無菌 平板上，照射2-3分鐘培養(yǎng)計數(shù)，觀察在酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基上的透明圈，選取透明圈直 徑和菌落直徑比(HC)大于1.5的菌落移種至試管斜面上培養(yǎng)。選取經(jīng)紫外誘變后優(yōu)勢較好 的菌株，制成IO 6-IO8AiL的菌懸液，在850W最大功率、額定微波頻率2450MHz的微波爐里，微 波輻照45s，且每隔5s冰浴處理消除熱效應(yīng)，避光4°C冷藏10小時，涂布于酪蛋白分離篩選培 養(yǎng)基，30°C恒溫培養(yǎng)3天后，觀察在酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基上的透明圈，選取透明圈直徑和 菌落直徑比(HC)大于1.5的菌落移種至試管斜面上培養(yǎng)。選取經(jīng)微波誘變后優(yōu)勢較好的菌 株，用無菌水制成IO 6-IO8AiL的菌懸液，將其與220yg/mL亞硝基胍溶液等體積置于潔凈的錐 形瓶內(nèi)混勻，30°C下處理30min后用冷生理鹽水稀釋到50倍終止反應(yīng)，離心洗滌3次去除藥 物，再稀釋成IO6-IO8倍菌懸液，取0.2mL菌懸液均勻涂布于酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基平板上， 將平板倒置于35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)38小時，選取透明圈直徑和菌落直徑比（HC)大于1.5 的菌落移種至試管斜面上作為生產(chǎn)制菌。
[0061 ] 所述亞硝基胍溶液的配制：精確稱取0.020g亞硝基胍，置于IOOmL的容量瓶中，加 入適量的丙酮溶液助溶，加入PH7.2的磷酸鹽緩沖液定容，制得200yg/mL亞硝基胍溶液，4°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0062]所述酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基:干酪素0.4-0.6 %、牛肉膏0.2-0.4% g、蛋白胨0.5-1.5%、氯化鈉0.5-1.5%、瓊脂1.0-2.0%、？!17.0-7.2、蒸餾水100011^，121°(：滅菌18-2211^11。 [0063] 第二步:生產(chǎn)制菌
[0064] 將篩選出來的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假 絲酵母分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)30小時，再轉(zhuǎn)接至裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄 子瓶中，于35 °C下培養(yǎng)50小時，放入4°C冰箱保存。
[0065] 所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:葡萄糖5.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5. Og， 無菌水 1000mL、pH7 · 0-7 · 2，121°C 滅菌 20-25min。
[0066]所述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂20.0 g，無菌水 100011^、？!17.0-7.2，121。(：滅菌20-2511^11。
[0067]第三步:復(fù)合菌的同步培養(yǎng)
[0068] 將保存的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵 母，按8%的接種量分別接種于種子液培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)10小時。
[0069] 按以下重量百分比稱取各菌種:乳酸腸球菌22%、地衣芽孢桿菌22%、凝結(jié)芽孢桿 菌26%、短小芽孢桿菌13%、產(chǎn)朊假絲酵母17%。
[0070] 將培養(yǎng)的所有菌種按重量百分比接種于同一裝有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)， pH7 · 2-7 · 4，攪拌轉(zhuǎn)速180-220rpm，培養(yǎng)溫度為35-39°C，通氣量1:0 · 5-1:0 · 7，發(fā)酵時間為22 小時。
[0071 ] 所述種子液培養(yǎng)基：葡萄糖1-3 %、酵母膏0.5-1.0 %、蛋白胨0.5-1.5 %、牛肉膏 0.5-1 ·0%、硫酸鎂0.05-0.1%、磷酸二氫鉀0.05-0.15%、無菌水94-96%、ρΗ7·0-7.2,121 °C 滅菌 20_25min。
[0072] 所述發(fā)酵液培養(yǎng)基：豆柏10-15%、魚粉8-12%、麥麩4-10%、玉米漿6-10%、葡萄 糖1-3 %、氯化鈉0.5-1.5 %、酵母膏0.5-1.0 %、硫酸鎂0.05-0.1 %、磷酸二氫鉀0.5-1.0 %， 硫酸銨0 · 5-1 · 5 %、硫酸錳0 · 005-0 · 01 %、硫酸亞鐵0 · 01-0 · 03 %，無菌水62-65 %，pH7 · 2-7·4，121Γ 滅菌 20-25min。
[0073] 第四步:生物活性肽的分離
[0074] 在復(fù)合菌的最佳發(fā)酵條件下完成對復(fù)合蛋白原料的發(fā)酵后，將發(fā)酵液在4500-5500rpm轉(zhuǎn)速條件下離心25-35min，取上清液進行真空濃縮，冷凍干燥制得生物活性肽的粗 品。
[0075] 將生物活性肽的粗品溶解于去離子水中，配置成溶液，用截留分子量為IOKDa的超 濾膜對生物活性肽的粗品溶液進行分離，收集所得到透過液，再經(jīng)截留分子量為5KDa的超 濾膜進一步分離，隨后按照同樣的方法分別采用3KDa、lKDa的超濾膜逐級分離，將最后收集 得到生物活性肽超濾片段，經(jīng)真空濃縮后，冷凍干燥成凍干粉備用。再將生物活性肽超濾片 段凍干粉溶解于去離子水中配置成質(zhì)量體積濃度為50mg/mL的溶液，混合均勻后上樣2mL進 行交聯(lián)葡聚糖凝膠色譜純化，洗脫流速為〇. 8-1.2mL/h，檢測波長為220nm，利用自動收集器 進行分離組分的收集，重復(fù)多次上樣，不斷富集各組分并冷凍干燥得到生物活性肽的純品， 保存?zhèn)溆?。對分離提純的多肽進行氨基酸測序，其氨基酸序列為Arg-Pro-Cys-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Leu-Ser-Thr-Ser-Val，如序列表SEQ ID No. 1 所不。
[0076]二、將制備得到的生物活性肽應(yīng)用于仔豬，評價生物活性肽促仔豬生長的效果，具 體方法包括：
[0077] 人工胃液的制備:量取234mL濃鹽酸加入無菌水稀釋至1000 mL，制得10 %稀鹽酸。 取該稀鹽酸16.4mL，加入無菌水800mL和胃蛋白酶IOg，攪拌均勾，加入無菌水稀釋至1000 mL 即得。
[0078]供試品溶液的制備:精確稱取生物活性肽凍干粉成品0.05g，用100.0 g人工胃液溶 解稀釋制成供試品溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0079] 選取10-15日齡的仔豬100頭，隨機分為A、B兩組，每組50頭。對每頭仔豬用編號的 耳部標號分別加以識別。A組作為對照組，每天灌服2mL的供試品溶液，連續(xù)灌喂20天;B組作 為對照組，自由飲水、采食，與A組的區(qū)別僅在于未灌服供試品溶液。每天觀察仔豬的生長狀 態(tài)，對仔豬進行稱重，并作好記錄。為期20天的試驗，試驗組的仔豬平均日增重提高6.50% (P<0.05)，仔豬斷奶之后，采食量增加4.31 % (P<0.05)，死亡率較對照組降低50% (P< 0.05)〇
[0080] 實施例3
[0081] 本實施例所采用的所有菌種都是可在飼料中添加的微生物菌種，且乳酸腸球菌、 地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母均是于市場上購得，不同廠家 的菌種均能達到近似的效果。
[0082] -、本實施例的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法包括如下步驟：
[0083] 第一步:培育菌種，利用誘變育種技術(shù)對各菌種進行優(yōu)選。
[0084]在功率為20W的紫外燈、30cm照射距離下，將保存的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝 結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母的菌懸液2mL分別酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基的無菌 平板上，照射2-3分鐘培養(yǎng)計數(shù)，觀察在酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基上的透明圈，選取透明圈直 徑和菌落直徑比(HC)大于1.5的菌落移種至試管斜面上培養(yǎng)。選取經(jīng)紫外誘變后優(yōu)勢較好 的菌株，制成IO 6-IO8AiL的菌懸液，在850W最大功率、額定微波頻率2450MHz的微波爐里，微 波輻照45s，且每隔5s冰浴處理消除熱效應(yīng)，避光4°C冷藏10小時，涂布于酪蛋白分離篩選培 養(yǎng)基，32°C恒溫培養(yǎng)3天后，觀察在酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基上的透明圈，選取透明圈直徑和 菌落直徑比(HC)大于1.5的菌落移種至試管斜面上培養(yǎng)。選取經(jīng)微波誘變后優(yōu)勢較好的菌 株，用無菌水制成IO 6-IO8AiL的菌懸液，將其與200yg/mL亞硝基胍溶液等體積置于潔凈的錐 形瓶內(nèi)混勻，33°C下處理25min后用冷生理鹽水稀釋到50倍終止反應(yīng)，離心洗滌3次去除藥 物，再稀釋成IO 6-IO8倍菌懸液，取〇. 2mL菌懸液均勻涂布于酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基平板上， 將平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時，選取透明圈直徑和菌落直徑比(HC)大于1.5 的菌落移種至試管斜面上作為生產(chǎn)制菌。
[0085] 所述亞硝基胍溶液的配制：精確稱取0.020g亞硝基胍，置于IOOmL的容量瓶中，加 入適量的丙酮溶液助溶，加入PH7.2的磷酸鹽緩沖液定容，制得200yg/mL亞硝基胍溶液，4°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0086] 所述酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基:干酪素0.4-0.6 %、牛肉膏0.2-0.4 % g、蛋白胨0.5- 1.5%、氯化鈉0.5-1.5%、瓊脂1.0-2.0%、？!17.0-7.2、蒸餾水100011^，121°(：滅菌18-2211^11。 [0087] 第二步:生產(chǎn)制菌
[0088] 將篩選出來的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假 絲酵母分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)35小時，再轉(zhuǎn)接至裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄 子瓶中，于37 °C下培養(yǎng)47小時，放入4°C冰箱保存。
[0089] 所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:葡萄糖5.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5. Og， 無菌水 1000mL、pH7 · 0-7 · 2，121°C 滅菌 20-25min。
[0090]所述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂20.0 g，無菌水 100011^、？!17.0-7.2，121。(：滅菌20-2511^11。
[0091]第三步:復(fù)合菌的同步培養(yǎng)
[0092] 將保存的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵 母，按10%的接種量分別接種于種子液培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)12小時。
[0093] 按以下重量百分比稱取各菌種:乳酸腸球菌23%、地衣芽孢桿菌23%、凝結(jié)芽孢桿 菌28%、短小芽孢桿菌11 %、產(chǎn)朊假絲酵母15%。
[0094] 將培養(yǎng)的所有菌種按重量百分比接種于同一裝有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)， pH7 · 2-7 · 4，攪拌轉(zhuǎn)速180-220rpm，培養(yǎng)溫度為35-39°C，通氣量1:0 · 5-1:0 · 7，發(fā)酵時間為23 小時。
[0095] 所述種子液培養(yǎng)基：葡萄糖1-3 %、酵母膏0.5-1.0 %、蛋白胨0.5-1.5 %、牛肉膏 0.5-1 ·0%、硫酸鎂0.05-0.1%、磷酸二氫鉀0.05-0.15%、無菌水94-96%、ρΗ7·0-7.2,121 °C 滅菌 20_25min。
[0096] 所述發(fā)酵液培養(yǎng)基：豆柏10-15%、魚粉8-12%、麥麩4-10%、玉米漿6-10%、葡萄 糖1-3 %、氯化鈉0.5-1.5 %、酵母膏0.5-1.0 %、硫酸鎂0.05-0.1 %、磷酸二氫鉀0.5-1.0 %， 硫酸銨0 · 5-1 · 5 %、硫酸錳0 · 005-0 · 01 %、硫酸亞鐵0 · 01-0 · 03 %，無菌水62-65 %，pH7 · 2-7·4，121Γ 滅菌 20-25min。
[0097] 第四步:生物活性肽的分離
[0098] 在復(fù)合菌的最佳發(fā)酵條件下完成對復(fù)合蛋白原料的發(fā)酵后，將發(fā)酵液在4500-5500rpm轉(zhuǎn)速條件下離心25-35min，取上清液進行真空濃縮，冷凍干燥制得生物活性肽的粗 品。
[0099] 將生物活性肽的粗品溶解于去離子水中，配置成溶液，用截留分子量為IOKDa的超 濾膜對生物活性肽的粗品溶液進行分離，收集所得到透過液，再經(jīng)截留分子量為5KDa的超 濾膜進一步分離，隨后按照同樣的方法分別采用3KDa、lKDa的超濾膜逐級分離，將最后收集 得到生物活性肽超濾片段，經(jīng)真空濃縮后，冷凍干燥成凍干粉備用。再將生物活性肽超濾片 段凍干粉溶解于去離子水中配置成質(zhì)量體積濃度為50mg/mL的溶液，混合均勻后上樣2mL進 行交聯(lián)葡聚糖凝膠色譜純化，洗脫流速為〇. 8-1.2mL/h，檢測波長為220nm，利用自動收集器 進行分離組分的收集，重復(fù)多次上樣，不斷富集各組分并冷凍干燥得到生物活性肽的純品， 保存?zhèn)溆?。對分離提純的多肽進行氨基酸測序，其氨基酸序列為Arg-Pro-Cys-Leu-Ser-Ala-Gln-Ile-Leu-Ser-Thr-Ser-Val，如序列表SEQ ID No. 1 所不。
[0100]二、將制備得到的生物活性肽應(yīng)用于仔豬，評價生物活性肽促仔豬生長的效果，具 體方法包括：
[0101] 人工胃液的制備:量取234mL濃鹽酸加入無菌水稀釋至1000 mL，制得10 %稀鹽酸。 取該稀鹽酸16.4mL，加入無菌水800mL和胃蛋白酶IOg，攪拌均勾，加入無菌水稀釋至1000 mL 即得。
[0102] 供試品溶液的制備:精確稱取生物活性肽凍干粉成品0.04g，用100.0 g人工胃液溶 解稀釋制成供試品溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0103] 選取10-15日齡的仔豬100頭，隨機分為A、B兩組，每組50頭。對每頭仔豬用編號的 耳部標號分別加以識別。A組作為對照組，每天灌服2mL的供試品溶液，連續(xù)灌喂20天;B組作 為對照組，自由飲水、采食，與A組的區(qū)別僅在于未灌服供試品溶液。每天觀察仔豬的生長狀 態(tài)，對仔豬進行稱重，并作好記錄。為期20天的試驗，試驗組的仔豬平均日增重提高6.2%(P <〇.〇5)，仔豬斷奶之后，采食量增加4.2 % (P<0.05)，死亡率較對照組降低50 % (P< 0.05)〇
[0104] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種促進仔豬生長的生物活性肽，其特征在于:所述生物活性肽包含SEQ ID No.1所 示氨基酸序列。2. 權(quán)利要求1所述促進仔豬生長的生物活性肽在促進仔豬生長、降低仔豬死亡率中的 應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，其特征在于：包括如下步 驟： A、 分別篩選乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母 后培養(yǎng)； B、 將步驟A所得乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵 母混合培養(yǎng)發(fā)酵，提取發(fā)酵液上清液后濃縮、干燥，分離提純后得生物活性肽。4. 如權(quán)利要求3所述的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，其特征在于：步驟A所 述篩選包括如下步驟： a、 初篩:將乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母分 別加入至酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基的無菌平板上，紫外誘變培養(yǎng)后選取透明圈直徑和菌落直 徑比大于1.5的菌落移種培養(yǎng)； b、 復(fù)篩：將經(jīng)過步驟a得到的各優(yōu)勢菌株進行微波誘變后，采用酪蛋白分離篩選培養(yǎng) 基，30-34Γ下恒溫培養(yǎng)2-3天，選取透明圈直徑和菌落直徑比大于1.5的菌落移種培養(yǎng)； c、 再復(fù)篩:將經(jīng)過步驟b得到的各優(yōu)勢菌株分別與180-220yg/mL亞硝基胍溶液等體積 混合后30-35 °C下培養(yǎng)20-30min，終止反應(yīng)后洗滌、配制為菌懸液，將菌懸液涂布于酪蛋白 分離篩選培養(yǎng)基平板，35-3%~下培養(yǎng)34-38小時，選取透明圈直徑和菌落直徑比大于1.5的 菌落。5. 如權(quán)利要求4所述的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，其特征在于：步驟b所 述的微波誘變步驟包括:850W最大功率、額定微波頻率2450MHz的微波爐里，微波輻照45-55s，且每隔5-10s冰浴處理，微波輻照結(jié)束后避光冷藏10-14小時。6. 如權(quán)利要求3所述的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，其特征在于：步驟A所 述培養(yǎng)步驟包括:將篩選后的乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn) 朊假絲酵母于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)30-40小時，再轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于35-39 °C下培養(yǎng)45-50小時。7. 如權(quán)利要求3所述的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，其特征在于：步驟B所 述混合培養(yǎng)發(fā)酵步驟包括：以質(zhì)量百分比計，乳酸腸球菌20-23%、地衣芽孢桿菌22-25%、 凝結(jié)芽孢桿菌26-30%、短小芽孢桿菌10-14%、產(chǎn)朊假絲酵母14-17%的比例接種于同一裝 有液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)發(fā)酵。8. 如權(quán)利要求7所述的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，其特征在于：步驟B所 述乳酸腸球菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母分別按8%-12%的接種量接種于種子液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)馴化10-14小時后進行混合培養(yǎng)發(fā)酵。9. 如權(quán)利要求7所述的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，其特征在于:所述培養(yǎng) 發(fā)酵的條件為PH7.2-7.4，攪拌轉(zhuǎn)速180-220rpm，溫度為35-39°C，通氣量1:0.5-1:0.7，發(fā)酵 時間22-24小時。10. 如權(quán)利要求3所述的促進仔豬生長的生物活性肽的制備方法，其特征在于:步驟B所 述分離提純步驟包括:將濃縮、干燥后的產(chǎn)品配置為溶液，依次經(jīng)1 OKDa、5KDa、3KDa、lKDa的 超濾膜逐級分離，收集得到生物活性肽超濾片段，再進行交聯(lián)葡聚糖凝膠色譜純化，洗脫流 速0.8-1.2mL/h，檢測波長為220nm，收集組分后冷凍干燥。
【文檔編號】C07K7/08GK105859839SQ201610347325
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】孫國平, 吳正榮, 范博文, 陳義杰, 李亮
【申請人】湖北博大生物股份有限公司