本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及氧傳遞速率和中和劑組合調(diào)控高糖濃度高效生產(chǎn)L-乳酸的方法。

背景技術(shù)：

工業(yè)乳酸發(fā)酵過程多采用批發(fā)酵或補(bǔ)料批發(fā)酵模式。對批發(fā)酵來說，高產(chǎn)物濃度和高產(chǎn)率往往表現(xiàn)出相互矛盾，因此如何平衡兩者之間的關(guān)系成為實(shí)現(xiàn)整體發(fā)酵過程高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。高底物濃度是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)物濃度和高轉(zhuǎn)化率的前提。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，一般認(rèn)為乳酸生產(chǎn)菌難以耐受200g/L以上的初始葡萄糖濃度。同時Giraud等人發(fā)現(xiàn)在乳酸發(fā)酵后期，胞內(nèi)pH降低和乳酸根離子積累是抑制細(xì)胞生長和代謝的主要原因。而且乳酸存在形式(解離或未解離)不同以及發(fā)酵液中增加的可溶性物質(zhì)和滲透壓也認(rèn)為是后期乳酸產(chǎn)率嚴(yán)重降低的重要因素。

合適的菌株以及優(yōu)化的過程控制策略能有效促進(jìn)乳酸發(fā)酵效率的提高，過程控制包括滲透壓調(diào)節(jié)、保護(hù)劑的添加，pH控制等等各方面因素。

綜上，本領(lǐng)域還需要進(jìn)一步研究影響工業(yè)乳酸發(fā)酵的各種因素，找到關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因素，一起提高乳酸產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供氧傳遞速率和中和劑組合調(diào)控高糖濃度高效生產(chǎn)L-乳酸的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種生產(chǎn)L-乳酸的方法，所述方法包括：

在初始葡萄糖濃度80～270g/L的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)擬干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)；

其中，在擬干酪乳桿菌生長期，控制氧攝取速率(OUR)為0.21±0.04mmol/L/h，在在擬干酪乳桿菌生長期，控制氧攝取速率為0.11±0.03mmol/L/h；

其中，在發(fā)酵的前9～13小時，采用氫氧化鈣控制pH為6.0±0.3，之后采用氨水控制pH為6.0±0.3。

在一個優(yōu)選例中，所述的方法中，初始葡萄糖濃度為100～260g/L；更佳地為200～250g/L。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，在擬干酪乳桿菌生長期，控制氧攝取速率為0.21±0.02mmol/L/h，在擬干酪乳桿菌生長期，控制氧攝取速率為0.11±0.015mmol/L/h。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，在發(fā)酵的前10～12.5小時，采用氫氧化鈣控制pH為6.0±0.3，之后采用氨水控制pH為6.0±0.3；更佳地，在發(fā)酵的前12±0.5小時，采用氫氧化鈣控制pH為6.0±0.3，之后采用氨水控制pH為6.0±0.3。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，控制pH為6.0±0.2，更佳地為6.0±0.1。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，發(fā)酵液中殘留葡萄糖含量為0時發(fā)酵結(jié)束(例如，發(fā)酵時間為30～60小時或?yàn)?5～55小時)。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括：葡萄糖80～270g/L，蛋白胨13.33±3g/L，酵母提取物13.33±3g/L，乙酸鈉0.67±0.2g/L，硫酸鎂0.0133±0.003g/L，硫酸錳0.0133±0.003g/L，氯化鈉0.0133±0.003g/L，硫酸鐵0.0133±0.003g/L。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，調(diào)整蛋白胨和酵母提取物的比例，使得葡萄糖，蛋白胨和酵母提取物的質(zhì)量比為(15±2):(1±0.1):(1±0.1)。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，培養(yǎng)溫度為37±1℃；較佳地為37±0.5℃；

培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150±5rpm；較佳地為150±2rpm。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，所述的擬干酪乳桿菌是擬干酪乳桿菌20647(也稱為NCBIO-01)。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯 而易見的。

附圖說明

圖1、初始葡萄糖濃度對擬干酪乳桿菌生長(A)，葡萄糖消耗(B)和L-乳酸生成(C)的影響。

圖2、不同供氧水平下，擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中DO和OUR(A)，菌體生長(B)，葡萄糖消耗和L-乳酸生成(C)的變化。

圖3、中和劑組合變換時間對擬干酪乳桿菌生長，葡萄糖消耗，L-乳酸生產(chǎn)的影響(A)，以及發(fā)酵過程中環(huán)境滲透壓的變化(B)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，揭示了一種優(yōu)化的生產(chǎn)L-乳酸的方法，該方法包括：在初始葡萄糖濃度較高的條件下發(fā)酵培養(yǎng)擬干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)，在發(fā)酵的不同階段調(diào)控氧攝取速率(OUR)和更換不同pH調(diào)節(jié)劑(中和劑)。本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了高效的發(fā)酵，大大提高了L-乳酸的產(chǎn)量。

由于需要大量的葡萄糖來轉(zhuǎn)化為L-乳酸，因此，高初始葡萄糖濃度是實(shí)現(xiàn)L-乳酸高效生產(chǎn)的前提。然而，現(xiàn)有技術(shù)中普遍認(rèn)為，高的初始葡萄糖濃度對于乳酸生產(chǎn)菌的生長造成影響，乳酸生產(chǎn)菌難以耐受高于200g/L的初始葡萄糖濃度，這大大限制了工業(yè)生產(chǎn)L-乳酸的效率。鑒于此，本發(fā)明人考察了較多了乳酸生產(chǎn)菌，意外地發(fā)現(xiàn)，對于擬干酪乳桿菌(如NCBIO-01)而言，初糖濃度高至250g/L對菌體生長和代謝也基本沒有影響?？梢姅M干酪乳桿菌(如NCBIO-01)是一種潛在的高乳酸濃度生產(chǎn)菌株。因此，應(yīng)用擬干酪乳桿菌進(jìn)行L-乳酸生產(chǎn)，可以有效地提高發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖的濃度，從而為L-乳酸高效生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。

在利用擬干酪乳桿菌進(jìn)行高初始葡萄糖濃度發(fā)酵過程中，本發(fā)明人又進(jìn)一步研究了發(fā)酵工藝中各個因素對于菌株生長、L-乳酸產(chǎn)量的影響，從諸多因素 中發(fā)現(xiàn)，氧攝取速率(OUR)以及pH調(diào)節(jié)劑(中和劑)的應(yīng)用對于發(fā)酵過程的影響是非常大的。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然不同OUR水平下，L-乳酸都是葡萄糖代謝的最主要產(chǎn)物，但是最終L-乳酸濃度受到OUR水平的影響。整個發(fā)酵過程中，擬干酪乳桿菌的生長期大概約為0-16h(階段1)，而16h以后基本都進(jìn)入穩(wěn)定期(階段2)。高OUR水平能夠在生長期促進(jìn)細(xì)胞生長，當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后，此時L-乳酸產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率都隨OUR水平的下降而升高，適當(dāng)?shù)腛UR水平在穩(wěn)定期維持更高產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在擬干酪乳桿菌生長期，控制氧攝取速率(OUR)為0.21±0.04mmol/L/h，在擬干酪乳桿菌生長期，控制氧攝取速率為0.11±0.03mmol/L/h。

同時，中和劑組合策略(前12h使用氫氧化鈣，然后變換為氨水作為中和劑)不但能夠有效緩和發(fā)酵后期高滲透應(yīng)激，而且避免了乳酸鈣濃度過高而導(dǎo)致的結(jié)晶。

本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氨水作為調(diào)節(jié)pH值的中和劑時，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄糖消耗和L-乳酸生成速率會呈現(xiàn)明顯下降趨勢。氫氧化鈣作為pH值的中和劑時能夠有效地減輕發(fā)酵后期細(xì)胞所受的高滲透應(yīng)激，但產(chǎn)物乳酸鈣隨著濃度的升高會出現(xiàn)結(jié)晶，從而嚴(yán)重影響發(fā)酵液流動性，導(dǎo)致發(fā)酵終止，單一使用氫氧化鈣作中和劑不適合于高濃度乳酸發(fā)酵。鑒于此，本發(fā)明人采用氫氧化鈣和氨水組合策略，尋找到兩種中和劑變換的最佳時間點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵后期高滲透應(yīng)激的緩和，并且不析出乳酸鈣晶體。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在發(fā)酵的前9～13小時，采用氫氧化鈣控制pH為6.0±0.3，之后采用氨水控制pH為6.0±0.3。

在上述控制條件下，擬干酪乳桿菌能夠完全耗盡250g/L初始葡萄糖，生成L-乳酸230.8g/L，同時L-乳酸產(chǎn)率達(dá)到6.21g/L/h。相比于以前乳酸發(fā)酵報(bào)道的結(jié)果，本研究中不管是L-乳酸濃度還是產(chǎn)率都是最高的。

現(xiàn)有技術(shù)中，目前在乳酸發(fā)酵過程中，還沒有關(guān)于將氧攝取速率(OUR)作為控制參數(shù)的報(bào)道。此外通過中和劑組合來緩和發(fā)酵后期高滲透應(yīng)激的策略不需要其它過程控制策略那般擁有復(fù)雜理論和設(shè)備。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

材料與方法

菌種

擬干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)20647，獲自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，也稱為NCBIO-01。

試劑

葡萄糖：上?；菖d生化試劑有限公司；

蛋白胨(Peptone)：Oxoid；

酵母提取物(Yeast Extract)：Oxoid；

牛肉提取物(Beef Extract)：上海生工生物有限公司；

葡萄糖試劑盒：上?？迫A生物工程股份有限公司；

其它試劑來源于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器

5L攪拌式生物反應(yīng)器：上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司；

pH和溶氧(DO)電極：美國梅特勒-托勒多公司；

752紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；

SBA-40D生化分析儀：山東省科學(xué)院；

冰點(diǎn)滲透壓儀：上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；

MAX300-LG過程質(zhì)譜儀：美國Extrel質(zhì)譜公司。

培養(yǎng)基成分

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物10，檸檬酸氫二銨2，磷酸氫二鉀2，乙酸鈉4，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.2，氯化鈉0.03， 硫酸鐵0.01，碳酸鈣25，吐溫-801ml/L。氫氧化鈉調(diào)節(jié)上述溶液pH至6.0，115℃滅菌20min。葡萄糖(40g/L)與上述其它成分分開配制，115℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖200或250或?qū)嵤├芯唧w寫明的量，蛋白胨13.33，酵母提取物13.33，乙酸鈉0.67，硫酸鎂0.0133，硫酸錳0.0133，氯化鈉0.0133，硫酸鐵0.0133。搖瓶發(fā)酵時，氫氧化鈉調(diào)節(jié)上述溶液pH至6.0，115℃滅菌20min。在考察初始葡萄糖濃度實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖(50g/L，100g/L，150g/L，200g/L，250g/L，300g/L，400g/L)與上述其它成分分開配制，同時調(diào)整蛋白胨和酵母提取物的比例，維持葡萄糖，蛋白胨和酵母提取物的質(zhì)量比為15:1:1，115℃滅菌20min。

培養(yǎng)條件種子培養(yǎng)

用50ml無菌水將新鮮茄子瓶斜面中的菌體懸浮，取15ml懸浮液接種于85ml種子培養(yǎng)基中，在37℃，110r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將20ml種子培養(yǎng)液接種于80ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為20％。250ml三角搖瓶置于37℃，110r/min培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24和48h。發(fā)酵初始加入一定量碳酸鈣(40g/L)調(diào)節(jié)過程pH在大約5.0左右(pH4.6-5.2)。

5L罐發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵過程中工作體積為4L，接種量為20％，溫度和轉(zhuǎn)速分別為37℃和150rpm。供氧水平通過不同通氣水平來調(diào)節(jié)(表1)。25％(w/w)氨水或35％(w/w)氫氧化鈣溶液用于控制pH在6.0。

中和劑組合實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵過程先用氫氧化鈣再用氨水控制pH，變換時間為10h(策略1，發(fā)酵的前10h使用氫氧化鈣，然后變換為氨水作為中和劑)，12h(策略2，發(fā)酵的前12h使用氫氧化鈣，然后變換為氨水作為中和劑)和14h(策略3，發(fā)酵的前14h使用氫氧化鈣，然后變換為氨水作為中和劑)。

細(xì)胞生物量測定

用稀鹽酸稀釋發(fā)酵液一定倍數(shù)，在紫外可見分光光度計(jì)測定620nm下的吸光值。細(xì)胞生物量通過細(xì)胞干重(DCW)來表示，兩者關(guān)系為：1OD相當(dāng)于0.41g/L DCW。

發(fā)酵液中滲透壓，L-乳酸和葡萄糖測定

取一定量發(fā)酵液在5,000rpm條件下離心10min，棄去菌體，上清稀釋一定倍數(shù)后待測。滲透壓按照儀器說明通過冰點(diǎn)滲透壓儀進(jìn)行測定。L-乳酸濃度通過SB-40C生物傳感分析儀進(jìn)行測定。葡萄糖濃度通過試劑盒進(jìn)行測定。

發(fā)酵過程中OUR檢測

OUR計(jì)算通過對發(fā)酵尾氣的分析數(shù)據(jù)計(jì)算得到。以進(jìn)氣和尾氣中惰性氣體N₂維持恒定建立平衡方程，求得OUR的計(jì)算公式如下:

F_in：進(jìn)氣流量l/min；V：發(fā)酵液體積L；C_惰in、C_O2in、C_CO2in:分別為進(jìn)氣中惰性氣體、氧氣及二氧化碳的質(zhì)量分率；C_O2out、C_CO2out:分別為排氣中氧氣和二氧化碳的質(zhì)量分率；P_in:進(jìn)氣的絕對壓強(qiáng)Pa；t_in:進(jìn)氣的溫度℃；h:進(jìn)氣的相對濕度(％)。

上述所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行。

實(shí)施例1、初始葡萄糖濃度對擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響

本實(shí)施例在250ml搖瓶中進(jìn)行，并保持恒定C/N比。從圖1A可以看出，經(jīng)過24h培養(yǎng)，細(xì)胞生物量隨著初始葡萄糖濃度的升高而增加(50-100g/L范圍內(nèi))。當(dāng)初始葡萄糖濃度超過100g/L時，細(xì)胞生物量呈下降趨勢，特別是在高初始葡萄糖濃度下(大于250g/L)。培養(yǎng)48h后，發(fā)現(xiàn)初始葡萄糖在100-250g/L之間有利于細(xì)胞生物量合成，均明顯高于其它濃度下的細(xì)胞生物量。結(jié)合葡萄糖消耗圖(圖1B)可以看到，50g/L初始葡萄糖在發(fā)酵24h時已經(jīng)完全耗盡，而100g/L初始葡萄糖也在發(fā)酵48h后基本耗盡。相對應(yīng)地，L-乳酸生成也表現(xiàn)出與葡萄糖消耗一致的趨勢(圖1C)。這說明50g/L條件下細(xì)胞生物量較低是由葡萄糖限制引起，而高初始葡萄糖(大于300g/L)條件下 細(xì)胞生物量低則更可能是由高底物濃度或高滲透壓抑制所導(dǎo)致?？傮w來看，100g/L，200g/L和250g/L初始葡萄糖都具有良好的發(fā)酵表現(xiàn)。在48h發(fā)酵時間內(nèi)，其葡萄糖消耗速率分別為2.08，2.21和2.08g/L/h，L-乳酸產(chǎn)率為1.93，2.09和1.92g/L/h。

因此，從以上結(jié)果可以得出：隨著初始糖濃度從100g/L提高到250g/L，擬干酪乳桿菌的生長和代謝能力沒有表現(xiàn)出明顯變化。在接下來的5L罐實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人選擇200g/L初始葡萄糖濃度進(jìn)行發(fā)酵過程控制研究。

實(shí)施例2、供氧水平(OTR)對擬干酪乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸的影響

采用5L罐發(fā)酵培養(yǎng)。

在擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中，發(fā)酵一開始大概3h左右以后，DO電極測得發(fā)酵液中的DO就處于跌零水平，一直至發(fā)酵結(jié)束，這說明菌體處于氧限制狀態(tài)。

因此，本實(shí)施例中，通過改變通氣水平來定量調(diào)節(jié)OTR從而實(shí)現(xiàn)OUR調(diào)控，并研究不同OUR水平在200g/L初始糖濃度下，以氨水為中和劑時，對擬干酪乳桿菌生長、耗糖以及產(chǎn)酸的影響。

通過圖2A可以看出，發(fā)酵過程中，OUR水平隨通氣量增加而增加。當(dāng)通氣量為0.25，0.15，0.1，0.05和0.025vvm時，相對應(yīng)的OUR值分別為0.48，0.33，0.21，0.16和0.11mmol/L/h(表1)。比較不同OUR水平下細(xì)胞生長情況(圖2B)，發(fā)現(xiàn)整個發(fā)酵過程中，生長期大概為0-16h(階段1)，而16h以后基本都進(jìn)入穩(wěn)定期(階段2)。此外，高OUR水平能夠在生長期促進(jìn)細(xì)胞生長，在穩(wěn)定期維持更高細(xì)胞生物量。雖然不同OUR水平下，L-乳酸都是葡萄糖代謝的最主要產(chǎn)物，但是最終L-乳酸濃度受到OUR水平的影響(圖2C)，這說明供氧水平的不同會造成L-乳酸轉(zhuǎn)化率的差異。高供氧條件下，會顯著降低L-乳酸的轉(zhuǎn)化率。隨著OUR水平從0.11mmol/L/h上升至0.48mmol/L/h，L-乳酸轉(zhuǎn)化率從94.0％下降到82.2％(表1)。

值得注意的是，在菌體生長期，雖然L-乳酸產(chǎn)率隨OUR升高而下降，但是轉(zhuǎn)化率卻呈現(xiàn)上升趨勢?？刂凭wOUR為0.21mmol/L/h能夠很好地平衡產(chǎn)率與轉(zhuǎn)化率之間的矛盾，同時保持較高的L-乳酸產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率(4.70g/L/h和96.8％)。當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后，此時L-乳酸產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率都隨OUR水平的 下降而升高，分別從1.73g/L/h和80.5％增加到2.35g/L/h和92.9％(表1)。

這些結(jié)果表明，控制低OUR水平(0.11mmol/L/h)有利于提高L-乳酸的生產(chǎn)效率。因此，綜合考慮生長期和穩(wěn)定期的L-乳酸產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率，接下來的實(shí)驗(yàn)中將采取兩階段OUR控制策略，即分別控制生長期(0-16h)和穩(wěn)定期(16h-發(fā)酵結(jié)束)的OUR為0.21和0.11mmol/L/h。

表1、不同供氧水平下L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)物比較

注：表中“OUR”和“細(xì)胞干重”為穩(wěn)定期的平均值，其標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在15％和5％之內(nèi)；“產(chǎn)率”和“轉(zhuǎn)化率”為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，其標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在5％和2％之內(nèi)。

實(shí)施例3、中和劑組合變換時間對擬干酪乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸的影響

當(dāng)氨水作中和劑時，如圖2B和表1所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄糖消耗和L-乳酸生成速率呈明顯下降趨勢。同時，在本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，環(huán)境滲透壓不斷升高是造成發(fā)酵后期耗糖和產(chǎn)酸速率迅速下降的主要原因。氫氧化鈣作中和劑時能夠有效地減輕發(fā)酵后期細(xì)胞所受的高滲透應(yīng)激，但產(chǎn)物乳酸鈣隨著濃度的升高會出現(xiàn)結(jié)晶，從而嚴(yán)重影響發(fā)酵液流動性，導(dǎo)致發(fā)酵終止。因此，單一使用氫氧化鈣作中和劑不適合于高濃度乳酸發(fā)酵。

鑒于此，本發(fā)明人采用氫氧化鈣和氨水組合策略，尋找到兩種中和劑變換的最佳時間點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵后期高滲透應(yīng)激的緩和，并且不析出乳酸鈣晶體。在此實(shí)驗(yàn)中，為了進(jìn)一步提高L-乳酸濃度，控制初始葡萄糖為250g/L，并采用兩階段OUR控制策略(生長期OUR為0.21mmol/L/h，穩(wěn)定期OUR為 0.11mmol/L/h)。此外，將中和劑變換時間定在10h(策略1)，12h(策略2)和14h(策略3)。

結(jié)果顯示(圖3)，在策略3下，由于乳酸鈣大量結(jié)晶并析出，發(fā)酵只能進(jìn)行至18h。相比之下，通過策略1和策略2，250g/L初始葡萄糖最終都能完全耗盡，同時細(xì)胞生長情況也較為相近。但是策略2整體發(fā)酵時間(葡萄糖耗盡)要比策略1縮短6h，其整體葡萄糖消耗速率和L-乳酸產(chǎn)率能夠達(dá)到6.72和6.21g/L/h，分別比策略1提高了18.7和24.3％(表2)。結(jié)合發(fā)酵過程中環(huán)境滲透壓的變化進(jìn)行分析(圖3B)，可以得出乳酸鈣產(chǎn)生的滲透壓要大大低于乳酸銨產(chǎn)生的滲透壓，而且發(fā)酵后期策略2滲透壓比策略1低大約200mOsm/kg。這也可能是策略2發(fā)酵時間短，耗糖速率高，產(chǎn)酸速率快的原因。理論上，氨水越晚代替氫氧化鈣，產(chǎn)生的環(huán)境滲透壓就越低，也更有利于菌體生長、代謝和生存。但在實(shí)際發(fā)酵過程中，特別是對于擬干酪乳桿菌這種嗜溫細(xì)菌來說，必須考慮產(chǎn)物乳酸鈣的飽和以及結(jié)晶濃度。另一方面，從L-乳酸轉(zhuǎn)化率上來看，策略2比策略1提高了4.8％，這說明微生物在發(fā)酵后期可能需要合成其它物質(zhì)來抵抗高滲透應(yīng)激，從而降低產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。

表2、不同中和劑組合策略下，擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸各參數(shù)比較

注：表中數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；策略3中各參數(shù)為18h發(fā)酵時間計(jì)算所得。

本發(fā)明獲得最終L-乳酸濃度(230.8g/L)和L-乳酸產(chǎn)率(6.21g/L/h)，這充分說明了本發(fā)明的優(yōu)化工藝實(shí)現(xiàn)了極其優(yōu)異的技術(shù)效果。

結(jié)論

本發(fā)明研究了擬干酪乳桿菌在高葡萄糖濃度條件下，供氧水平和中和劑 組合策略對菌體生長，葡萄糖消耗以及L-乳酸生成的影響。通過兩階段OUR控制，并在12h變換中和劑，擬干酪乳桿菌能夠完全耗盡250g/L初始葡萄糖，并生成L-乳酸230.8g/L，其產(chǎn)率達(dá)到6.21g/L/h。不管是L-乳酸濃度還是產(chǎn)率均達(dá)到非常理想的水平。本發(fā)明的菌株具有作為工業(yè)規(guī)模高效生產(chǎn)L-乳酸的潛力。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。