修飾的真菌細胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明遺傳修飾的木霉屬（Trichoderma)真菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細胞壁由具有各種組成的e_(1，4)-連接的葡萄糖聚合物纖維素、半纖維素 多糖和木質(zhì)素組成。前兩種由植物分別以約7. 2和6X1010噸的年生產(chǎn)速度形成。因此它 們是地球上可再生碳來源的最大儲存庫，其可以用于生產(chǎn)生物燃料和其他生物煉制產(chǎn)品， 由此代替衍生自化石碳組分的產(chǎn)品。雖然用于使這些聚合物水解的化學和酶促方法是已知 的，但是酶促水解是優(yōu)選的，因為其沒有產(chǎn)生抑制性的副產(chǎn)物，并且因此具有環(huán)境相容性。
[0003] 里氏木霉（Trichodermareesei)在工業(yè)生產(chǎn)纖維素水解酶和半纖維素水解酶 中使用最為廣泛，并且已經(jīng)成為用于對這些酶進行研宄的范例。因此，與這些纖維素酶和 半纖維素酶的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的很多細節(jié)已經(jīng)得到闡明，并且它們表達并且分泌到培養(yǎng)基 中的調(diào)控的若干方面也已有描述。里氏木霉的基因組序列已經(jīng)公開（Martinez等，Nat. Biotech. 26 (2008)，553-560 ;包括UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號G0RL42 (2011))。
[0004]Mukherjee等（AppliedandEnvironmentalMicrobiologyAPR 76 (2010) ,2345-2352)報道了通過VELVET蛋白veil對綠木霉（Trichodermavirens)中的 形態(tài)發(fā)生和生物控制性能的調(diào)控。Kubicek等（BiotechnologyforBiofuels2(2009)，19) 公開了用于通過紅褐肉座菌（Hypocreajeorina(T.reesei))改善纖維素生成的代謝 改造策略。W0 2011/161063A1公開了具有轉(zhuǎn)錄促進蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。TO 2010/060188A1公開了用于纖維素生成的宿主和發(fā)酵方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供提高纖維素水解酶和半纖維素水解酶和經(jīng)受相同調(diào)控 環(huán)路的其他酶例如碳水化合物酯酶和幾丁質(zhì)酶在木霉屬中的生產(chǎn)的方法。本發(fā)明還有一個 目的是提供經(jīng)過修飾的木霉屬真菌，所述經(jīng)過修飾的木霉屬真菌顯示出與它們的野生型細 胞相比增加的纖維素水解酶和半纖維素水解酶的生成。
[0006]因此，本發(fā)明涉及肉座菌科的優(yōu)選為木霉屬或者肉座菌屬的遺傳修飾的真菌細 胞，所述真菌細胞能夠以與沒有修飾的野生型真菌細胞相比較高的量表達調(diào)控蛋白VEL1。
[0007] 今天，已知三種轉(zhuǎn)錄激活子即XYR1、ACE2和HAP2/3/5復合物以及兩種抑制子CRE1 和ACE1參與纖維素酶調(diào)控。多細胞真菌中發(fā)育特異性基因表達的一個核心調(diào)節(jié)子（目前 還不知道影響纖維素酶和半纖維素酶基因表達）是VELVET(VeA，VEL1)。velvet調(diào)控蛋白 家族具有真菌特異性，但是在子囊菌（ascomycetes)和擔子菌（basidiomycetes)中是高度 保守的。VeA最早在構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans)中發(fā)現(xiàn)。在所述蛋白中攜帶有特異 性點突變的菌株產(chǎn)生比帶有完整的VeA蛋白的野生型菌株更多的分生孢子和更少的子實 體。VeA同系物在其他子囊菌中的作用是多樣化的，但是總是與發(fā)育和次生代謝有關(guān)。最 近的研宄已經(jīng)證明，VeA還參與不同的曲霉（Aspergillusspp.)、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum)、頂頭抱霉（Cephalosporiumacremonium)和綠木霉（Trichodermavirens) 的次生代謝（BayramandBraus，F(xiàn)EMSMicrobiolRev. 36 (2012):l-24)〇
[0008] 在2008年，發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉（A.nidulans)中，VeA(VELl)和第二velvet家族蛋 白VelB與LaeA/LAEl形成三聚體復合物，該復合物對于協(xié)調(diào)次生代謝和黑暗中的發(fā)育是必 須的（Bayram等，Science320 (2008): 1504-1506)。然而，對于木霉屬和任何其他真菌，還 沒有描述涉及VEL1蛋白的纖維素酶和半纖維素酶基因表達的發(fā)育調(diào)控。
[0009] 令人驚訝的是，木霉屬真菌中的VEL1的過表達被證明導致細胞中的纖維素酶、半 纖維素酶、碳水化合物酯酶和/或其他同多糖和雜多糖降解酶優(yōu)選的是幾丁質(zhì)酶的生成的 顯著增加。這些蛋白/酶的表達的這種增加是特別有利的，因為其允許例如包括例如纖維 素水解底物等生物底物降解得更好、更快并且降解得到改善。而且，工業(yè)有關(guān)的纖維素酶、 半纖維素酶、碳水化合物酯酶和其他同多糖和雜多糖降解酶如幾丁質(zhì)酶的生成能夠比野生 型真菌細胞有效得多。
[0010] 術(shù)語"遺傳修飾的"或者"重組的"在本文中根據(jù)它們確定的意思使用，以將"遺傳 修飾的"或"重組的"細胞或核酸分子與天然存在的細胞或者核酸分子尤其是這些細胞或者 核酸分子的天然存在的相應(yīng)物區(qū)分開。
[0011] 本文使用的術(shù)語"能夠以與未修飾的野生型真菌細胞相比較高的量表達調(diào)控蛋白 VEL1"是指本發(fā)明的細胞以該細胞能夠以比未修飾的細胞表達的VEL1的量更高的量表達 Veil的方式進行遺傳修飾?？梢酝ㄟ^使用相應(yīng)的PCR技術(shù)測量mRNA轉(zhuǎn)錄本、通過使用基于 酶特異性抗體的方法（例如ELISA)測定所生成的酶的量、或者通過測定過表達的酶的酶促 活性來確定遺傳修飾細胞和野生型細胞的VEL1表達的差異。相應(yīng)的方法和措施在本領(lǐng)域 中是已知的。
[0012] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，用于對真菌特別是肉座菌科的真菌進行遺傳修飾的方 法是熟知的。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，編碼所述VEL1蛋白的天然存在的基因被可 操作地連接至能夠誘導與未修飾的野生型真菌細胞相比增加的VEL1蛋白的表達的重組啟 動子。
[0014] 為了在本發(fā)明的所述遺傳修飾的真菌細胞中過表達VEL1，編碼真菌細胞的VEL1 蛋白的天然存在的基因被可操作地連接至重組啟動子，該重組啟動子不是野生型真菌細胞 的固有的Veil啟動子。野生型veil啟動子的交換允許提高真菌細胞中的VEL1蛋白的表 達速度，當然前提是所述重組啟動子在所述遺傳修飾的真菌細胞中具有更高的活性。將啟 動子重組地導入到真菌尤其是木霉屬真菌的染色體DNA的特定位點的方法對于本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說熟知的。
[0015] VEL1蛋白過表達的條件取決于所使用的啟動子。如果所述啟動子是誘導型啟動 子，那么必須采用相應(yīng)的條件或者物質(zhì)以開啟或者調(diào)解該啟動子的活性。
[0016] "被可操作地連接"是指并置情況（juxtaposition)，其中所述及的組分處于允許 它們以它們的所期望的方式發(fā)揮作用的關(guān)系。"被可操作地連接"至編碼序列的啟動子存在 于細胞中使得所述編碼序列的表達受到所述啟動子的直接影響。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式，所述真菌細胞包含表達載體，所述表達載 體攜帶編碼VEL1蛋白的被可操作地連接至啟動子的基因。
[0018] 為了提高VEL1在木霉屬宿主細胞中的表達速度，可以向宿主細胞中導入攜帶有 編碼所述VEL1蛋白的基因，所述基因被可操作地連接至啟動子。由于肉座菌科的細胞特別 是木霉屬的細胞天然地表達VEL1，因此所述載體可以包含被可操作地連接至veil基因的 野生型veil啟動子。在同一啟動子的控制下veil基因存在多于一個的拷貝已經(jīng)導致VEL1 在這些細胞中的表達增加。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，所述啟動子選自由如下啟動子組成的組： tefl啟動子（轉(zhuǎn)錄延長因子1)、gpdl啟動子、pkil啟動子、enol啟動子、pgkl啟動子 和cdnal啟動子（UzbasF等.ApplMicrobiolBiotechnol93(2012): 1601 - 1608; Trire2:110879,GenBankAccessionNo:GL985078. 1 ;Trire2accessionnumber accordingtoMartinezD等.NatBiotechnol.26(2008)，553-560)〇
[0020] 優(yōu)選的啟動子還選自由如下如下啟動子組成的組：pkil、gpdA、gpdl 和hexl啟動子。進一步優(yōu)選的啟動子還公開在例如Nakari-Setdla等（Appl. Env.Microbiol.61(1995)，3650_3655)、Rahman等（Biosci.Biotechnol. Biochem. 73 (2009)，1083-1089 ;egl3 和xyn3 啟動子）、W0 98/23764A1 (短cbhl啟動子）、 EP0 952 223A1 (綠色木霉（Trichodermaviride)的cbhl-啟動子）、US7,393,664、US 7, 517, 685(hexl啟動子）和Mach等（Curr.Genetics25 (1994): 567-570 ;pkil)中。在本 發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述啟動子可以具有異源或者同源的來源。
[0021] 最優(yōu)選的啟動子是tefl啟動子、cdnal啟動子、pgkl啟動子和pkil啟動子。
[0022] 當然，也可以使用能夠用來調(diào)控宿主生物體例如里氏木霉（Trichodermareesei) 中的基因表達的其他任何啟動子。特別優(yōu)選的啟動子是調(diào)控里氏木霉中的如下蛋白的 蛋白表達的那些啟動子：GH5糖苷水解酶（蛋白ID81087)、慢生根瘤菌博來霉素抗性 (Bradorhizobiumbleomycinresistance)(蛋白ID103009)、未知的假定蛋白（蛋白ID 106270)、HHE域蛋白、保守的（蛋白ID70608)、假定保守蛋白（蛋白ID109925)、PTH11-型 GPCRs(蛋白ID109146)、MSF通透酶（蛋白ID78585)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（蛋白ID 112022)、過氧化氫酶（蛋白ID58472)、甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶（蛋白ID60445)、未知蛋 白（蛋白ID105287)、翻譯起始調(diào)節(jié)子Gnc20(蛋白ID22839)、咪唑丙酸酶（imidazole proprionase)相關(guān)的氨基水解酶（蛋白ID110757)、MSF轉(zhuǎn)運子（蛋白ID3405)、短鏈 脫氫酶/還原酶（蛋白ID106164)、MSF通透酶（蛋白ID79202)、未知蛋白（蛋白ID 60370)、假定分泌蛋白（蛋白ID122889)、黃酮醇還原酶/肉桂?；?CoA還原酶（蛋白ID 111716)、鋅結(jié)合氧化還原酶（蛋白ID23292)、假定蛋白（蛋白ID124198)、未知蛋白（蛋 白ID109523)、犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶K(蛋白ID122820)、GPR1/FUN34/ yaaH-樣蛋白（蛋白ID60810)、假定蛋白（蛋白ID54352)、預定Zn-依賴型水解酶（0-內(nèi) 酰胺酶超家族）（蛋白ID70197)、亞硫酸鹽報告子ssul(蛋白ID2076)、未知蛋白（蛋白 ID4851)、未知分泌蛋白（蛋白ID110830)、未知酯酶/脂肪酶（蛋白ID70491)和MSF通 透酶（蛋白ID105260)。這些基因在纖維素誘導條件（例如里氏木霉在乳糖上的培養(yǎng)）下 受調(diào)控地上調(diào)。
[0023] 肉座菌科的真菌細胞優(yōu)選為木霉屬或者肉座菌屬的真菌細胞。
[0024] 肉座菌科是奠殼菌綱（Sordariomycetes)中的一個科。這個科的真菌包括若 干個屬：Aphysiostroma、葡枝霉屬（Cladobotryum)、膠枝霉屬（Gliocladium)、肉座菌 屬、類肉座菌屬（Hypocreopsis)、菌寄生屬（Hypomyces)、琉孢霉屬（Mycogone)、叢赤殼 屬（Nectria)、肉棒菌屬（Podostroma)、Protocrea、Rogersonia、Sarawakus、黃瘤抱屬 (Sepedonium)、泥炭蘚屬（Sphaerostilbella)、Sporophagomyces、冠抱屬（Stephanoma)和 木霉屬，由此準備根據(jù)本發(fā)明進行遺傳修飾的所述真菌細胞優(yōu)選為木霉屬或者肉座菌屬的 真菌細胞。
[0025] 木霉屬包括若干個種，由此里氏木霉是最優(yōu)選的代表。
[0026]VEL1蛋白的氨基酸序列和編碼VEL