用于檢測自身免疫性疾病的診斷方法和相關(guān)主題的制作方法
【專利說明】用于檢測自身免疫性疾病的診斷方法和相關(guān)主題 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及新鑒定的自身免疫性疾病的診斷和治療，提供包含衍生自新的細胞表 面自身抗原的至少一個表位的多肽或蛋白以及用于檢測和治療所述自身免疫性疾病的相 關(guān)裝置（means)和方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 記憶、行為、認知和思維過程可以被自身抗體改變的這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)改變了之前被 認為是特發(fā)性的（idiopathic)神經(jīng)精神疾病的診斷和治療方法（approach)。從2007年以 來，已經(jīng)鑒定了七種這樣的抗體（抗匪0六1?、410^1?、6484(8)、1^11工38口12、6171?和11161111?5)， 均靶向細胞表面蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)參與突觸傳遞、可塑性或神經(jīng)興奮性并與盡管嚴重但 通常對免疫治療作出應(yīng)答的綜合征有關(guān)。 1患者可昏迷數(shù)月，具有怪異的行為、異常的動作 或頑固性癲癇并在免疫治療和擴展的護理支持下仍然恢復(fù)。2考慮到直到最近這些疾病是 未知的，一些疾病相對高的頻率已經(jīng)是令人驚訝的。例如，在專注于腦炎的診斷和流行病學(xué) 的中心（加利福尼亞腦炎項目）里，抗NMDAR腦炎的頻率超過了任何個體病毒性腦炎的頻 率。3由于這些原因，在未知病因的腦炎（經(jīng)常發(fā)生的情況）的背景下發(fā)展成快速進展性神 經(jīng)精神癥狀的患者中，類似的免疫機制被越來越多地予以考慮。目前大約70%的不明病因 的腦炎在針對感染性病因的廣泛評估之后仍未得到診斷。 4在這樣的情形下，針對神經(jīng)元細 胞表面抗原的自身抗體的鑒定將管理轉(zhuǎn)向了免疫治療的使用，并且可以在其它方式被認為 是徒勞的情況下擴展重癥監(jiān)護支持。
[0004] 鑒于上述情況，本發(fā)明的潛在問題在于提供分別用于之前未鑒定的自身免疫性腦 炎或不明病因的腦炎的診斷和治療的裝置。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 該問題由本申請權(quán)利要求的方案得到解決，特別是通過提供包含衍生自DPPX(用 于檢測和治療自身免疫性疾?。ㄌ貏e是腦炎）的新的自身抗原）的至少一個表位的多肽或 蛋白質(zhì)，編碼這樣的多肽的核酸或載體，包含這樣的載體的細胞，涉及這樣的多肽的體外診 斷方法和檢測試劑盒，包含這樣的多肽的藥物組合物，涂敷有這樣的多肽或藥物組合物的 醫(yī)療設(shè)備以及用于治療受試者中自身免疫性疾?。ㄌ貏e是腦炎）的方法。
[0007] 本發(fā)明的一個優(yōu)點在于這樣的事實，病因不明腦炎的診斷能夠分別鑒定所述疾病 為自身免疫性腦炎，區(qū)分其它（非自身免疫性）形式的腦炎或其他疾病或相關(guān)的癥狀，并從 而給患者的具體治療提供例如免疫抑制劑。
[0008] 附圖概述
[0009] 圖1顯示DPPX的免疫沉淀；
[0010] 圖2顯示腸肌叢中DPPX的表達；
[0011] 圖3顯示采用基于細胞的測定分析DPPX抗體；
[0012] 圖4顯示采用DPPX無效突變體和野生型小鼠的大腦對比患者的血清反應(yīng)性；
[0013] 圖5顯示用患者的血清免疫染色的大鼠大腦；
[0014] 圖6顯示采用表達缺失了DPPX細胞外結(jié)構(gòu)域的突變體（DPPXed-myc)的基于細胞 的測定分析患者的抗體；以及
[0015] 圖7顯示采用表達Kv4. 2的基于細胞的測定分析患者的抗體。
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，"多肽"應(yīng)理解為兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個或更多個 氨基酸的聚合物，其可以包括標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以及非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。本文互換使用術(shù)語多肽、肽和 蛋白質(zhì)。
[0018] 對于本發(fā)明，術(shù)語"自身免疫性疾病"涉及與抗DPPX抗體的出現(xiàn)有關(guān)的疾病。如本 文所報道的，具有這樣的自身免疫性疾病的患者患有例如包括癲癇、認知功能障礙、幻覺、 精神病癥狀、情緒激動、神志不清、靜止性震顫和肌陣攣的癥狀。這些癥狀的大部分與神經(jīng) 疾病有關(guān)。因此，根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，自身免疫性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫 性疾病。此外，本文所列的癥狀至少部分與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺陷有關(guān)。因此，根據(jù)本發(fā)明 的另一個實施方案，所述自身免疫性疾病是自身免疫性腦炎。更進一步地，一組特定的癥狀 (如震顫）也可以是由外周神經(jīng)系統(tǒng)的缺陷（例如由影響運動神經(jīng)元的自身免疫性疾?。?引起的。因此，根據(jù)本發(fā)明一個進一步的實施方案，所述自身免疫性疾病是外周神經(jīng)系統(tǒng)的 自身免疫性疾病。另外，在患有本文所述的疾病的患者中觀察到嚴重的腹瀉、便秘和體重減 輕，表明其它組織（如消化道的組織）也可以受這樣的自身免疫性疾病的影響。因此，根據(jù) 本發(fā)明的一個實施方案，所述自身免疫性疾病是自主神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病。本文互 換使用術(shù)語病癥（disorder)和疾?。╠isease)。
[0019] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"表位"應(yīng)理解為能夠被抗體特異性識別（即結(jié)合）的多肽的 一部分。所述表位可以是構(gòu)象表位（由多肽的氨基酸序列的不連續(xù)部分組成）或線性表位 (由多肽的氨基酸序列的連續(xù)部分組成）。
[0020] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對于表位，術(shù)語"衍生的"涉及由多肽或蛋白質(zhì)的一級氨基酸 序列的不連續(xù)或連續(xù)部分形成的表位。本領(lǐng)域已知的是，表位中的一個或更多個氨基酸可 以被取代，例如通過基本上不改變抗體結(jié)合強度或特異性的保守氨基酸置換（例如谷氨酸 至天冬氨酸E-D，谷氨酰胺至天冬酰胺Q-N，苯丙氨酸至酪氨酸F-Y，亮氨酸至異亮氨 酸L-I)。因此，術(shù)語"衍生的"還涉及這樣的表位：當(dāng)與具有原始氨基酸序列的表位相比， 盡管在氨基酸序列上具有差異，所述表位表現(xiàn)出不變的或基本上不變的抗體結(jié)合強度或特 異性。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，"核酸"涉及DNA或RNA聚合物，還包括其化學(xué)衍生物或合成類似物 (如肽核酸或嗎啉代核酸）。本領(lǐng)域已知的是，由于遺傳密碼的簡并性，核酸編碼的某些變 化不會導(dǎo)致其所編碼的肽序列的變化。因此，術(shù)語"核酸"還涵蓋編碼相同肽序列、與原始 核酸序列在序列上存在不同的核酸序列。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的"載體"應(yīng)理解為包括插入物（例如編碼所需蛋白質(zhì)的基因或核酸 序列）和其它特征（如載體復(fù)制、所述插入物的表達、承載載體的宿主細胞的陽性選擇或標(biāo) 記蛋白的表達所需的序列）的環(huán)狀或線性核酸序列。這樣的載體和序列是本領(lǐng)域廣泛已知 的。
[0023] 本發(fā)明范圍內(nèi)的"細胞"是能夠被載體轉(zhuǎn)化的任何原核或真核宿主細胞。例如，細 胞可以是細菌細胞（如大腸桿菌細胞）或真核細胞（如永生化的人培養(yǎng)細胞）。永生化的 人培養(yǎng)細胞的一個例子是J1EK293細胞。
[0024] 術(shù)語"DPPX"涉及二肽基肽酶樣蛋白-6 (DPP6或DPPX)，KV4. 2鉀通道的細胞表面 輔助亞基。DPPX的同義詞包括二肽基氨肽酶相關(guān)蛋白、二肽基肽酶6、二肽基肽酶IV樣蛋 白和二肽基肽酶VI。
[0025] DPPX是高度保守的，使得即使是來自與人類關(guān)系較遠的物種的DPPX也適合于引 發(fā)與人抗DPPX抗體的特異性結(jié)合。這也適用于DPPX蛋白的所有人同種型。此外，已知例如 線性MHCI類表位長度為大約8至11個氨基酸。因此，在DPPX同系物中，在各自物種和人 類之間保守的、長度在8至11個氨基酸的區(qū)域原則上已足以引發(fā)與人抗DPPX抗體的特異 性結(jié)合。在這方面，構(gòu)成構(gòu)象表位的保守序列可能甚至更短。因此，對于本發(fā)明，"DPPX"涉 及源自真核生物、優(yōu)選哺乳動物、更優(yōu)選智人（homosapiens)或大鼠（rattusnorvegicus) 的DPPX蛋白的任何已知同種型。
[0026] 此外，與人抗DPPX抗體的特異性結(jié)合也可被DPPX的同系物（如DPPX天然存在的 同系物）引發(fā)。還包括DPPX非天然存在的同系物，例如，如通過單個或多個氨基酸或甚至 蛋白質(zhì)基序或結(jié)構(gòu)域的缺失或交換衍生自DPPX天然存在的同系物的同系物。因此，對于本 發(fā)明，"DPPX"還涉及DPPX天然和非天然存在的同系物。
[0027] 我們在本文中報道4位患有新型自身免疫性疾病的患者，特征在于與抗 DPPX(KV4. 2鉀通道的細胞表面輔助亞基）抗體有關(guān)的認知功能障礙、情緒激動、幻覺、神志 不清、靜止性震顫和肌陣攣的亞急性發(fā)展。在三位患者中，嚴重腹瀉和體重減輕先于神經(jīng)學(xué) 癥狀出現(xiàn)或與其重疊，其程度達到兩位患者進行了廣泛的內(nèi)窺鏡活檢而沒有得到明確診斷 的地步。腦脊液（CSF)細胞增多、增加的IgG指數(shù)或寡克隆帶和針對密集或持久的免疫治 療的神經(jīng)學(xué)應(yīng)答的存在給該病的自身免疫性病因提供支持。采用患者的抗體，三組實驗確 立了DPPX作為主要自身抗原：從分離的大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)物中免疫沉淀DPPX;基于細 胞的測定中DPPX的免疫染色和野生型和DPPX無效小鼠的對比大腦免疫染色，顯示出患者 抗體與DPPX無效小鼠大腦的反應(yīng)性的消除，并在一位患者中顯示出針對未知抗原的額外 的抗體。
[0028]DPPX具有通過重構(gòu)通道門控"上調(diào)（tuningup) "Kv4. 2通道的關(guān)鍵作用。5這種 類型的鉀通道屬于哺乳動物ShalK+通道家族6(其具有與ShakerK+(Kvl)家族相比不同 的性質(zhì)），之前被認為是抗體相關(guān)邊緣性腦炎、神經(jīng)性肌強直或莫旺氏（Morvan's)綜合征 (主要自身抗原是LGI1和Caspr2)的靶標(biāo)。7'8Kv4. 2通道在膜電位的亞閾值范圍內(nèi)工作。 5這種細胞體-樹突亞閾值A(chǔ)型K+電流（ISA)是決定細胞體-樹突信號整合的電壓門控離 子流的集合（ensemble)的關(guān)鍵組成部分。9在許多神經(jīng)元中，始于軸丘（axonhillock)的 動作電位不但沿軸下傳而且回傳入樹突。在樹突樹中，這些動作電位充當(dāng)報告神經(jīng)元輸出 狀態(tài)的信號。樹突中的瞬時亞閾值、電流減弱動作電位的這種回傳。在靜息條件下，ISA 關(guān)閉該動作電位，因為它試圖傳入樹突樹的遠端區(qū)域。然而，在某個時間窗口內(nèi)興奮性突觸 輸入與體細胞動作電位配對時，在遠端樹突中隨之而來的亞閾值去極化滅活I(lǐng)SA，并且回傳 動作電位的衰減實質(zhì)上被降低了。6據(jù)信，這種相互作用提供了一致性檢測機制，其在樹突 Ca++信號傳導(dǎo)、信號整合和突觸可塑性中起著重要作用。5'6' 9
[0029]Kv4通道的功能依賴于兩個輔助亞基，即細胞內(nèi)Kv通道相互作用蛋白（KChIPs)，1Q 和細胞外DPPX(主要表達于海馬錐體神經(jīng)元和小腦）或DPP10 (具有不同的大腦表達譜并 且還存在于胰腺）。n'12DPPX由短的細胞質(zhì)N末端、單個跨膜結(jié)構(gòu)域和大的細胞外C末端組 成。依賴于細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的長度，已經(jīng)鑒定了兩個成熟形式，DPPX-S和DPPX-L。13'14與抗細 胞外表位抗體的存在一致的是，我們的4位患者的血清和CSF同等識別DPPX-S和DPPX-L， 但是兩位患者具有抗細胞外C末端被缺失的突變體構(gòu)建