本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及山梨酸或其鹽在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一種微生物發(fā)酵產(chǎn)生的谷氨酸聚合物，而相對分子量是其重要特征參數(shù)，與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。低分子量的γ-PGA在化妝品中應(yīng)用廣泛，具有保濕、維持皮膚彈性、提升天然保濕因子含量、美白膚色、促進營養(yǎng)成分吸收等功效。還有研究使用低分子量的γ-PGA制備藥物載體，使藥物容易滲透到達(dá)作用位點。但是直接發(fā)酵產(chǎn)物分子量較大(＞1000kD)，有必要生產(chǎn)低分子量γ-PGA。目前已報道多種獲得低分子量γ-PGA的方法，如篩選產(chǎn)低分子量γ-PGA的生產(chǎn)菌，但篩選周期長，不確定性高；分段收集，但得率低；采用酸、堿或超聲水解，雖然是現(xiàn)在生產(chǎn)γ-PGA最常用的方法，但有數(shù)據(jù)表明水解后其含量會減少32％；酶解法效率高，但還處于實驗研究階段。如果能在直接發(fā)酵獲得低分子量的γ-PGA，則是一種高效低成本生產(chǎn)低分子量γ-PGA的新工藝，具有潛在的經(jīng)濟和社會效益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個目的是提供山梨酸或其鹽在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸中的應(yīng)用。

優(yōu)選，所述的低分子量γ-聚谷氨酸為分子量低于245kD的γ-聚谷氨酸。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將山梨酸或其鹽加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中并混合，由此得到含有山梨酸或其鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后將枯草芽孢桿菌接種到含有山梨酸或其鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸；

或者，將枯草芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸含量達(dá)17g/L以上時，加入山梨酸或其鹽至發(fā)酵液中，混合后繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸。

優(yōu)選，以山梨酸計，所述的山梨酸或其鹽在含有山梨酸或其鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基或發(fā)酵液中的濃度為0.037～3.7g/L。即是將山梨酸或其鹽加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中并混合，此時以山梨酸計，山梨酸或其鹽的終濃度為0.037～3.7g/L，進一步優(yōu)選為0.37～0.75g/L。或者所述的將山梨酸或其鹽加入發(fā)酵液中，此時以山梨酸計，山梨酸或其鹽的終濃度為0.037～3.7g/L。

優(yōu)選，所述的山梨酸鹽選自山梨酸鉀、山梨酸鈉或山梨酸鈣。

優(yōu)選，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基每升含有：檸檬酸12g、甘油80g、L-谷氨酸20g、氯化銨7g、磷酸氫二鉀0.5g、七水硫酸鎂0.5g、二水氯化鈣0.15g、六水氯化鐵0.04g和一水硫酸錳0.104g，余量為水，pH 6.5。

優(yōu)選，所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PGA-7，其保藏編號為：CCTCC NO：M206102。

所述的將枯草芽孢桿菌接種到含有山梨酸或其鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)或者將枯草芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)選，其種子液的接種量為1～10％，發(fā)酵溫度37℃，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)72～120h，搖床轉(zhuǎn)速80～150r/min，沖程為65～75mm。

本發(fā)明將山梨酸或其鹽應(yīng)用于枯草芽孢桿菌的γ-聚谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，可以提高低分子量γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率。利用本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸的方法，使高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸的百分?jǐn)?shù)從原來的80.28％下降到21.50％～72.18％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸的百分?jǐn)?shù)從原來的19.72％上升至27.49％～52.72％，而低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸的百分?jǐn)?shù)從原來的0上升至0.3％～25.78％；也使γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量維持15g/L以上。本發(fā)明的山梨酸或其鹽提高低分子量γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量的發(fā)酵方法簡單有效，提供了一種有別于物理或化學(xué)方法生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸的方法。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

以下實施例中的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PGA-7，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為：CCTCC NO：M206102，該菌公開于專利號：ZL 200610122640.5，發(fā)明名稱為：γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌及利用該菌株制備γ-聚谷氨酸的方法的專利中。

實施例1：

菌種的活化：將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PGA-7菌種接種在固體培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)16～24h，得到活化的枯草芽孢桿菌菌種。所述的固體培養(yǎng)基的成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L，余量為水，pH7.0～7.2；配制方法是將上述成分混合均勻后，調(diào)pH值，然后滅菌備用。

種子液的制備：取2環(huán)上述活化的枯草芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，37℃，100rpm振蕩培養(yǎng)18h，得到枯草芽孢桿菌種子液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分：檸檬酸12g/L，甘油80g/L，L-谷氨酸20g/L，氯化銨7g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，二水氯化鈣0.15g/L，一水硫酸錳0.104g/L，六水氯化鐵0.04g/L，余量為水，調(diào)pH為6.5；配制方法是將上述成分混合均勻后，調(diào)pH值，然后滅菌備用。

液體搖瓶發(fā)酵：按上述方法配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分?jǐn)?shù)2.5％接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速80r/min，沖程為65mm；當(dāng)發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸達(dá)到17g/L時，加入無菌的山梨酸鉀溶液，使發(fā)酵液中山梨酸鉀濃度達(dá)到5g/L(以山梨酸計，濃度為3.7g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。發(fā)酵完畢，檢測γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為22.58g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為72.18％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為27.49％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為0.33％。

實施例2：

菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。

液體搖瓶發(fā)酵：將山梨酸溶于乙醇中，配制成母液。在發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)中加入山梨酸母液，使山梨酸的終濃度為0.037g/L，配制成含有山梨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分?jǐn)?shù)10％接入到含有山梨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，沖程為75mm。發(fā)酵完畢，檢測γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為23.82g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為68.86％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為30.84％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為0.3％。

實施例3：

菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。

液體搖瓶發(fā)酵：在發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)中加入山梨酸鈣，使培養(yǎng)基中的山梨酸鈣濃度達(dá)0.087g/L(以山梨酸計，濃度為0.075g/L)，配制成含有山梨酸鈣的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分?jǐn)?shù)1％的量接種至含有山梨酸鈣的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)96h，搖床轉(zhuǎn)速110r/min，沖程為75mm。發(fā)酵完畢，檢測γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為22.333g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為50.75％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為44.94％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為4.31％。

實施例4：

菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。

液體搖瓶發(fā)酵：在發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)中加入山梨酸鉀，使培養(yǎng)基中的山梨酸鉀濃度達(dá)0.5g/L(以山梨酸計濃度為0.37g/L)，配制成含有山梨酸鉀的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分?jǐn)?shù)5％的量接種至含有山梨酸鉀的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)96h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，沖程為75mm。發(fā)酵完畢，檢測γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為17.48g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為28.26％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為51.51％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為20.23％。

實施例5：

菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。

液體搖瓶發(fā)酵：在發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)中加入山梨酸鈉，使培養(yǎng)基中的山梨酸鈉濃度達(dá)0.89g/L(以山梨酸計濃度為0.75g/L)，配制成含有山梨酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分?jǐn)?shù)10％的量接種至含有山梨酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)120h，搖床轉(zhuǎn)速110r/min，沖程為65mm。發(fā)酵完畢，檢測γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為15.49g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為21.50％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為52.72％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為25.78％。

對比例1：

菌種的活化：將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PGA-7菌種接種在固體培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)16～24h，得到活化的枯草芽孢桿菌菌種。所述的固體培養(yǎng)基的成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L，余量為水，pH7.0～7.2；配制方法是將上述成分混合均勻后，調(diào)pH值，然后滅菌備用。

種子液的制備：取2環(huán)上述活化的枯草芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，37℃，100rpm振蕩培養(yǎng)18h，得到枯草芽孢桿菌種子液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分：檸檬酸12g/L，甘油80g/L，L-谷氨酸20g/L，氯化銨7g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，二水氯化鈣0.15g/L，一水硫酸錳0.104g/L，六水氯化鐵0.04g/L，余量為水，調(diào)pH為6.5；配制方法是將上述成分混合均勻后，調(diào)pH值，然后滅菌備用。

液體搖瓶發(fā)酵：按上述按配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按照接種量為體積分?jǐn)?shù)1％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃。在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)96h，搖床轉(zhuǎn)速110r/min，沖程為75mm。發(fā)酵完畢，檢測γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為25.68g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為80.28％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為19.72％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為0。

對比例2：

菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。

液體搖瓶發(fā)酵：將滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分?jǐn)?shù)5％的量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)96h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，沖程為75mm。發(fā)酵完畢，檢測γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為26.58g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為77.23％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為22.77％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為0。

對比例3：

菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。

液體搖瓶發(fā)酵：將滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分?jǐn)?shù)10％的量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)120h，搖床轉(zhuǎn)速110r/min，沖程為65mm。發(fā)酵完畢，檢測γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為27.56g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為74.76％，100-245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為25.24％，低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為0。