專利名稱：一種針對(duì)ppGalNAc-T13多克隆抗體的特異性抗原肽及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，主要涉及了一種針對(duì)ppGalNAC-T13多克隆抗體的特異性抗原，并公開了所述抗原肽的制備及其在ppGalNAC-T13多克隆抗體制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族(ppGalNAc-Ts)是0_型糖蛋白糖鏈合成反應(yīng)的第一步起始糖基轉(zhuǎn)移酶，其催化形成Tn抗原(GalNAc-Ser/Thr)。ppGalNAc-T是一個(gè)大的基因家族，現(xiàn)在已報(bào)道的ppGlaNAc-T有20種。ppGalNAc-Ts家族成員均為II型膜蛋白，N端有一個(gè)4 22個(gè)氨基酸的胞漿區(qū)，繼以一個(gè)15 25個(gè)氨基酸的穿膜區(qū)，通過一個(gè)長短不一的莖區(qū)與C端伸入高爾基體內(nèi)大約450個(gè)氨基酸的催化區(qū)相連接。ppGalNAc-Ts 基因家族各個(gè)成員的在不同組織中的表達(dá)有很大差異，例如ppGalNAc-Tl是各組織廣泛分布的，ppGalNAc-T14為腎臟組織特異性表達(dá)，ppGalNAc-T13為神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)等。 目前國際上關(guān)于PPGalNAc-Ts基因家族的功能研究方興未艾，近年取得一些初步進(jìn)展，例如，ppGalNAc-Tl參與淋巴細(xì)胞和血細(xì)胞表面selectin Iigand糖基化，ppGalNAc-Tl的缺失影響微血管循環(huán)和淋巴細(xì)胞歸巢，還會(huì)造成B細(xì)胞的凋亡；ppGalNAC-T3參與FGF23 的糖基化修飾，保護(hù)其不受furin蛋白酶的剪切，使得FGF23能夠正常分泌到胞外行使功能。已在瘤樣鈣質(zhì)沉積的病人中發(fā)現(xiàn)多例ppGalNAC-T3基因上SNP，直接與瘤樣鈣質(zhì)沉積病的形成相關(guān)；ppGalNAC-T14參與死亡受體DR4和DR5的糖基化修飾，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)Apo2L/ TRAIL的敏感度，對(duì)于腫瘤的藥物治療有著重大意義；在Xenopus中的研究發(fā)現(xiàn)T16參與調(diào)控TGF-beta，Activin, BMP信號(hào)通路，對(duì)于Xenopus的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育起到了十分重要的作用。ppGalNAc-Ts家族成員因其不同的組織分布以及其和腫瘤、發(fā)育的相關(guān)性，使得 ppGalNAc-Ts家族各成員可以用做腫瘤診斷和發(fā)育的標(biāo)志物，在科研和臨床上有重大的應(yīng)用價(jià)值。例如，ppGalNAC-T3可作為前列腺癌的標(biāo)志物，并且與肺腺癌病人的生存期有一定的相關(guān)性；PpGalNAc-T6可以作為乳腺癌的免疫組化檢測標(biāo)志；ppGalNAC-T12可作為結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的負(fù)指數(shù)；ppGalNAC-T13可作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤向骨髓轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。ppGalNAc-T家族具有極高的保守性，家族成員間蛋白質(zhì)序列的同源性都在40% 以上，尤其是本發(fā)明中涉及的PpGalNAc-T13與同家族中的ppGalNAc-Tl在蛋白質(zhì)序列上的相似度高達(dá)85%，因此，如何保證T13抗體的特異性至關(guān)重要。目前，已報(bào)導(dǎo)的ppGalNAc-Ts家族中多克隆抗體的制備方法主要有兩種一種是使用合成多肽作為抗原；一種是使用外源表達(dá)的完整的PPGalNAc-Ts全酶作為抗原。這兩種方法各有優(yōu)劣。使用合成多肽作為抗原的優(yōu)點(diǎn)在于可以選擇同源性較低的多肽片段作為抗原，以保證抗體的特異性；但是，合成的多肽一般只有十幾個(gè)氨基酸殘基，分子量較小， 免疫原性較差，通常需要將其與MAP (multiple antigenic ρ印tide)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH) 等蛋白載體偶聯(lián)，有些還需加入免疫佐劑，因此，此方法成本十分高昂通常合成10 20mg的純度85%以上的抗原蛋白價(jià)格一般在120元/氨基酸殘基，偶聯(lián)MAP的價(jià)格在一千元以上。使用外源表達(dá)的完整PPfelNAc-Ts全酶作可以為抗原可以大大提高其免疫原性，但是對(duì)于生產(chǎn)出來的抗體特異性比較難保證，尤其像ppfeilNAC-T13與ppfeilNAc-Tl兩種糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列相似度高達(dá)85%，如使用全酶做抗原，基本不可能產(chǎn)生特異性針對(duì) ppfeilNAc-T 13的多克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有多克隆抗體制備方法價(jià)格昂貴、免疫原性差(合成多肽法)以及特異性不能保證(全酶法)等不足，本發(fā)明提供了一種PPfelNAc-T13的特異性抗原及其多克隆抗體的制備方法。本發(fā)明制備的ppfeilNAC-T13抗體不與相似度高達(dá)85%的ppfeilNAc-Tl 發(fā)生交叉反應(yīng)，也不與PPfelNAc-Ts家族中的其他成員發(fā)生交叉反應(yīng)；本發(fā)明通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得抗原，并且抗原攜帶有GST (glutathione S-transferase)標(biāo)簽，易于純化；本發(fā)明克服了合成多肽免疫原性差、價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，同時(shí)也具備極高的特異性。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案本發(fā)明第一方面提供了一種分離的抗原肽，所述抗原肽為氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的多肽或其保守性變異多肽。本發(fā)明第二方面提供了一種融合蛋白，含有所述抗原肽與標(biāo)簽蛋白，可以是所述抗原肽與標(biāo)簽蛋白的融合蛋白。所述標(biāo)簽蛋白選自GST、FLAG、MAP(multiple antigenic ρ 印 tide)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)。本發(fā)明實(shí)施例具體列舉了氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的多肽與GST的融合蛋白。本發(fā)明第三方面提供了一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸編碼所述抗原肽或融合蛋白。優(yōu)選的，編碼所述抗原肽的多核苷酸的堿基序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明第四方面提供了一種載體，含有所述多核苷酸。優(yōu)選的，所述載體選自pGEX-5X-l、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pGEX-4T-l、 PGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX_6P_l、pGEX_6P_2、pGEX_6P_3、pET_41a(+)、pET_41b(+)、 pET-41c(+)、pET-42a(+)、pET_42b(+)、pET_42c(+)。本發(fā)明第五方面提供了一種工程菌，含有所述載體。優(yōu)選的，所述工程菌選自原核表達(dá)菌株。更優(yōu)選的，所述原核表達(dá)菌株選自BL21 (DE3)、Rosetta 2、Origami 2、 Rosetta-gami 2、Origami B 等菌株。更優(yōu)選的，所述原核表達(dá)菌株為BL21 (DE3)。本發(fā)明第六方面提供了所述抗原肽或融合蛋白的制備方法選自以下任一(1)利用化學(xué)合成方法合成所述抗原肽；(2)在合適的條件下培養(yǎng)所述工程菌并使其表達(dá)所述抗原肽或融合蛋白，而后分離及純化獲得所述抗原肽或融合蛋白。本發(fā)明第七方面提供了所述抗原肽或融合蛋白用于制備特異性針對(duì)ppGalNAc-T13的多克隆抗體的用途。本發(fā)明第八方面提供了一種多克隆抗體，為以所述的抗原肽或融合蛋白為抗原制得。優(yōu)選的，所述多克隆抗體為采用本發(fā)明的抗原肽或融合蛋白作為免疫抗原免疫動(dòng)物獲得。本發(fā)明第九方面提供了所述的多克隆抗體在制備診斷或治療腫瘤藥物或制劑中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明制備的抗體不和與 ppfeilNAc-T 13相似度高達(dá)85 %的ppfeilNAc-Tl發(fā)生交叉反應(yīng)，更不與ppfeilNAc-Ts家族其它成員發(fā)生交叉反應(yīng)；本發(fā)明通過簡單的分子克隆實(shí)驗(yàn)制備出所需的抗原蛋白，且該抗原蛋白與GST融合表達(dá)，易于純化；本發(fā)明克服了合成多肽方法免疫原性差、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，也克服了使用全酶作為抗原特異性的不到保證的缺點(diǎn)；本發(fā)明得到的特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的多克隆抗體不僅可以用于檢測變性后的ppfeilNAC-T13蛋白，還可以用于檢測具有活性的天然構(gòu)象的PpfelNAc-T13蛋白，并且本發(fā)明提供的特異性針對(duì) ppGalNAc-T13的多克隆抗體具有極高的靈敏度。本發(fā)明中所涉及的菌株大腸桿菌DH5 α、大腸桿菌BL21 (DE3)已在《汪玲玲，楊輯， 黃誠之，王海洪；大腸桿菌holo-ACP的過表達(dá)、分離純化及長鏈脂酰ACP的合成，微生物學(xué)報(bào)，2008,48(7) :963 969》文獻(xiàn)中公開。本發(fā)明涉及的菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如上海天根生化科技(北京)有限公司，公司地址上海市漕溪路258弄27號(hào)航星商務(wù)樓1號(hào)樓606室。本發(fā)明涉及的GSTrap層析柱和ftx)tein A-Sepharose 4B層析柱均可通過市售的商業(yè)渠道獲得，如GE Healthcare公司。


圖1為GST-T13AG融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖；圖2為GST-T13AG融合蛋白純化電泳圖；圖3為特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的多克隆抗體IgG純化電泳圖；圖4為特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的多克隆抗體與其它ppfeilNAc-Ts的交叉特異性檢測圖；圖5為特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的多克隆抗體的靈敏度的結(jié)果圖6為用特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的抗體通過組織免疫熒光法檢測C57小鼠腦組織中ppGalNAC-T13蛋白表達(dá)分布結(jié)果圖；圖7為用特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的多克隆抗體通過免疫沉淀法檢測HEK193T 細(xì)胞中過表達(dá)PPGalNAc-T 13的Western Blotting結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
實(shí)施例1 特異性針對(duì)ppGalNAC-T13的多克隆抗體的制備(1)抗原序列的確立在ClustalX 軟件中輸入 ppGalNAc_T13 (RefSeq Accession Number :NP_443149) 和 ppGalNAc-Tl(RefSeq Accession Number :NP_065207)的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，在 ppGalNAc-T13蛋白的莖區(qū)選取一段序列T13 AG作為抗原，T13 AG序列如SEQ ID NO :2所示(RefSeq Accession Number :NP_443149 :ppGalNAc_T13 全蛋白質(zhì)編碼 29 位絲氨酸到 80 位亮氨酸)；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 抗原T13 AG的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQ ID NO 1所示；根據(jù)pGEX_5X_l 的多克隆位點(diǎn)和T13 AG的DNA序列設(shè)計(jì)引物上游引物5'ATGGATCCCCAGTGAATGTAACAAATGTGATGACA 3‘ ； (SEQ ID NO 3)；下游引物5,TAGAATTCGATTTTAAACAGCTCTTTCATTTTC 3‘ (SEQ ID NO 4) 以 ppGalNAc_T13 全長 cDNA(RefSeq Accession Number :NP_443149)為模板， 通過PCR擴(kuò)增得到目的片段，PCR反應(yīng)條件為94°C 3min ；94°C 30s, 56 °C 30s, 68 °C 30s， 25個(gè)循環(huán)；68°C IOmin ；目的片段經(jīng)BamH I (TaKaRa)、EcoR I (TaKaRa)雙酶切后膠回收， 以Ligation High連接酶(ToYoBo)連接入經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切的pGEX_5X_l質(zhì)粒 (Amersham)，連接反應(yīng)條件為
pGEX-5X-l 載體 1.0 μ ppGalNAc-T13 片段 1.0 μ Τ4連接酶1.0 μ
10 X連接緩沖液 1.0 μ 水16 μ
1 6 °C2h所構(gòu)建的原核表達(dá)載體命名為pGEX-5X-l-T13 AG。將所構(gòu)建的pGEX_5X-l_T13 AG 原核表達(dá)載體常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司)，使用含有ΙΟΟμ g/ml氨芐青霉素的LB平板，37°C過夜篩選培養(yǎng)；挑取單菌落后搖菌，提取質(zhì)粒并測序。(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)選擇步驟2中測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(天根生化科技有限公司)，IL大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)液在37°C培養(yǎng)至OD值達(dá)到1. O ；大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)基組分為1% (w/v)蛋白胨，0. 5% (w/v)酵母提取物，(w/v)NaCl，所述IL培養(yǎng)基中， 蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，余量為水；培養(yǎng)溫度為37°C。在大腸桿菌BL21 (DE3) 培養(yǎng)液中加入IPTG至0.5mM，26°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)3h ；裂解大腸桿菌BL21 (DE3)將IL誘導(dǎo)后的大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)液離心收集菌體，用100ml裂解緩沖液重懸，該緩沖液的組分為 PBS (pH = 7. 3), 1% (v/v) Triton X-100，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF，Phenylmethanesulfonyl fluoride)，所述 IL 緩沖液中，Triton X-lOOlmL，PMSF 174. 2mg，余量為 PBS (pH = 7. 3)；超聲波破碎20次，每次k。然后將經(jīng)超聲波破碎后的菌體在4°C條件下，10, OOOrpm離心 15min，收集上清。所得帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白命名為GST-T13 AG，在大腸桿菌中經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)得到的含有GST-T13 AG融合蛋白的大腸桿菌裂解液的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，1為未用IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解后的裂解液上清，2為用IPTG誘導(dǎo)后的菌體裂解后的裂解液上清。發(fā)明人對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌BL21(DE!3)中可通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到了 GST-T13 AG融合蛋白。(4)純化大腸桿菌BL21 (DE3)菌體裂解破碎后的蛋白上清使用GE Healthcare公司的GSTrap HP親和純化柱，先用5倍柱床體積的PBS平衡該柱，接著上樣超聲破碎離心后得到的上清，再用5倍柱床體積的PBS沖洗該柱，然后用5 倍柱床體積的還原性谷胱甘肽溶液洗脫。還原性谷胱甘肽溶液的組分為50mM Tris-HCl, IOmM還原性谷胱甘肽，pH為8.0，通過UV檢測收集洗脫峰。然后使用安捷倫公司的Ultra 超濾離心柱對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮，得到高濃度的GST-T13 AG抗原蛋白。帶有GST標(biāo)簽的 GST-T13AG融合蛋白經(jīng)GSTrap親和純化柱純化以及經(jīng)Ultra超濾離心柱濃縮得到的產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示，1為IPTG誘導(dǎo)后的菌體裂解后的裂解液上清經(jīng)GSTrap親和純化柱純化后的產(chǎn)物；2為純化得到的產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)Ultra超濾離心柱濃縮后得到的產(chǎn)物。 發(fā)明人對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GSTrap親和純化柱純化及超濾離心濃縮后得到的產(chǎn)物分子量與理論分子量一致，其濃度達(dá)到免疫動(dòng)物的要求。經(jīng)測序，結(jié)果符合預(yù)期。(5)所述氨基酸序列為SEQ ID NO 2的分離的抗原肽的獲得所述氨基酸序列為SEQ ID NO 2的分離的抗原肽由化學(xué)合成多肽的方法直接制備獲得。(6)用純化的抗原蛋白對(duì)家兔進(jìn)行免疫每次使用步驟4中所得的純化的融合蛋白200 μ g作為免疫抗原對(duì)家兔進(jìn)行免疫，兩星期一次；3個(gè)月后取血清，3，OOOrpm離心15分鐘后得到抗血清；純化抗血清使用GEHealthcare公司的Hitrap Protein AHP親和純化柱，先用10倍柱床體積的結(jié)合液平衡該柱，結(jié)合液成分為20mM Na3P04, pH為7. 0，接著讓特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的抗血清通過該柱，再用5倍柱床體積的結(jié)合液沖洗該柱，然后用5倍柱床體積的洗脫液洗脫，洗脫液成分為0. IM Na3C6H507, pH為3. 0，通過UV QMnm)檢測收集洗脫峰。特異性針對(duì)ppfeilNAc-T13的抗血清經(jīng)Hitrap Protein A HP親和純化柱純化后得到的產(chǎn)物的 SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，1為marker，2為未純化的ppfeilNAc-T13抗血清，3為純化后的 pp(}alNAC-T13多克隆抗體。發(fā)明人對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，抗血清經(jīng)過Hitrap Protein AHP親和純化柱純化后得到的產(chǎn)物已將高豐度的血清白蛋白有效的去除，IgG抗體的純度達(dá)到預(yù)期。由于GST融合的抗原肽可產(chǎn)生ppfeilNAC-T13特異性多克隆抗體，而GST中并不含有對(duì)應(yīng)于PpfelNAc-T13的抗原表位結(jié)構(gòu)特征，因此認(rèn)為由融合蛋白所產(chǎn)生的 ppGalNAc-T13多克隆抗體對(duì)于ppfeilNAc-T13的特異性均源自融合蛋白中的SEQ ID NO 2 片段，而SEQ IDN0:2在pp(ialNAC-T13蛋白序列中為親水結(jié)構(gòu)域，此序列的多肽能夠自然折疊并具有抗原表位的結(jié)構(gòu)特征，所以序列為SEQ ID NO :2的抗原肽即使不與GST融合也可產(chǎn)生ppfeilNAC-T13的多克隆抗體，并且其對(duì)于ppfeilNAC-T13的特異性應(yīng)與所述GST融合的抗原肽所產(chǎn)生的ppfeilNAC-T13的多克隆抗體類似。
實(shí)施例2 Western Blotting檢測本實(shí)施例制備的多克隆抗體的特異性將實(shí)施例1所制備的特異性針對(duì)pp(;alNAc-T13的多克隆抗體、抗Flag抗體和抗 3 -actin抗體分別與帶Flag標(biāo)簽的ppfeilNAc-h進(jìn)行交叉特異性檢測。試驗(yàn)步驟將編碼ppfeilNAc-I^s基因家族成員的cDNA分別克隆至pFLAG-CMV-3質(zhì) 粒中，克隆時(shí)所使用的引物序列如下，ppGalNAc-Tl 正向(5，GCGAATTCATGTGATGAAAAAAAGGAGAG3，) (SEQ ID NO :5)反向(5，CGGGATCCTCAGAATATTTCTGGAAGGGT3，) (SEQ ID NO :6)ppGalNAc-T2 正向(5，GCGAATTCAAAAAAGAAAGACCTTCACAG3，) (SEQ ID NO :7)反向(5，CGGGATCCCTACTGCTGCAGGTTGAGCGT3，) (SEQ ID NO :8)ppGalNAc-T3 正向(5，GCGAATTCATCAAGGATGGAAAGGAACAT3，) (SEQ ID NO :9)反向(5，CGGGATCCTTAATCATTTTGGCTAAGTAT3，) (SEQ ID NO :10)ppGalNAc-T4 正向(5，GCGAATTCATTTCATGCCTCCGCAGGAGC3，) (SEQ ID NO :11)反向(5，CGGGATCCCTATTTCTCAAAACTCCAAAT3，) (SEQ ID NO :12)ppGalNAc-T6 正向(5，GCGAATTCAGTCCTGGACCTCATGCTGGA3，) (SEQ ID NO :13)反向(5，CGGGATCCCTAGACAAAGAGCCACAACTG3，) (SEQ ID NO :14)ppGalNAc-T8 正向(5，GCGAATTCAGGGACTTTACAAAACCTGTT3，) (SEQ ID NO :15)反向(5，CGGGATCCTCACTGGCTGTTGGTCTGACC3，) (SEQ ID NO :16)ppGalNAc-T9 正向(5，GCGAATTCACGCATCGTGAGCGGCGACCG3，) (SEQ ID NO :17)反向(5，CGGGATCCTCAGTGCCGTGCGTGTTTGAT3，) (SEQ ID NO :18)ppGalNAc-TlO 正向(5，GCGAATTCACGGCAGCCCGACGGCACCCC3，) (SEQ ID NO :19)反向(5，CGGGATCCTCAGTTCCTATTGAATTTTTC3，) (SEQ ID NO :20)ppGalNAc-T12 正向(5，GCGAATTCACGGCGCGAGCCGGTCATGCC3，) (SEQ ID NO :21)反向(5，CGGGATCCTCATAACATGCGCTCTTTGAA3，) (SEQ ID NO :22)ppGalNAc-T13 正向(5，GCGAATTCACGGGGCGCGCAGAGGGCAGG3，) (SEQ ID NO :23)反向(5，CGGGATCCTCATGTGCCCAAGGTCATGTT3，) (SEQ ID NO :24)ppGalNAc-T14 正向(5，GCGAATTCAGTGCAGACCCCTAAGCCTTC3，) (SEQ ID NO :25)反向(5，CGGGATCCTCAAGAGCTCACCATGTCCCA3，) (SEQ ID NO :26)ppGalNAc-T15 正向(5，GCGAATTCAGCCAGGTACCGCCTGGACTT3，) (SEQ ID NO :27)反向(5，CGGGATCCTCATCGTTCATCCACAGCATT3，) (SEQ ID NO :28)ppGalNAc-T16 正向(5，GCGAATTCACGGGGCGCGCAGCGGGCAGG3，) (SEQ ID NO :29)反向(5，CGGGATCCTCAATCAGGGGCTCTCCTGCC3，) (SEQ ID NO :30)ppGalNAc-T17 正向(5，GCGAATTCACGCAGCGGAGACGCCTTCCA3，) (SEQ ID NO :31)反向(5，CGGGATCCCTACTTGATGGAGTTCTTAAT3，) (SEQ ID NO :32)ppGalNAc-T18 正向(5，GCGAATTCACGGGGGCAGGAGCCGGCGCC3，) (SEQ ID NO :33)反向(5，CGGGATCCTCAGGACGCGAGGCTCCTCAG3，) (SEQ ID NO :34)ppGalNAc-T20 正向(5，GCGAATTCAGATAAGCACCTGGTGAAGTC3，) (SEQ ID NO :35)反向(5，CGGGATCCCTAGGAGTTGGCATGGTGGTT3，) (SEQ ID NO :36)克隆的內(nèi)切酶選用EcoRI和BamHI。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-^3T細(xì)胞，蹄選出陽性克隆，培養(yǎng)并鑒定表達(dá)的蛋白正確，真核表達(dá)帶有FLAG標(biāo)簽的ppfelNAc-Ts蛋白，轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，收集細(xì)胞，裂解得到含有帶有FLAG標(biāo)簽的ppfelNAc-Ts蛋白的細(xì)胞總蛋白，將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行進(jìn)一步W^festern Blotting的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示，從左到右依次為過表達(dá)含帶Flag標(biāo)簽的ppGalNAc-Tl、 ppGalNAc-T2、ppGalNAc_T3、ppGalNAc_T4、ppGalNAc_T6、ppGalNAc_T8、ppGalNAc_T9、 ppGalNAc-T10、 ppGalNAc_T12、 ppGalNAc_T13、 ppGalNAc_T14、 ppGalNAc_T15、 ppGalNAc-T16、ppGalNAc_T17、ppGalNAc_T18 和 ppGalNAc_T20 的 HEK-293T 細(xì)胞裂解液。 其中圖A，圖B和圖C中分別為轉(zhuǎn)染Flag-ppGalNAc-Ts質(zhì)粒的ΗΕΚ493Τ細(xì)胞裂解液，圖A 為抗pp(ialNAC-T13多克隆抗體檢測圖，圖B為抗Flag抗體檢測圖，圖C為抗β -actin抗體檢測圖。圖4-A為用特異性針對(duì)pp(ialNAC-T13的多克隆抗體檢測帶Flag標(biāo)簽的 ppGalNAc-Tl、ppGalNAc_T2、ppGalNAc_T3、ppGalNAc_T4、ppGalNAc_T6、ppGalNAc_T8、 ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、 ppGalNAc-T16、ppGalNAc_T17、ppGalNAc_T18 和 ppGalNAc_T20 蛋白的 Western Blotting 結(jié)果圖。一抗比例為1 2000，抗兔二抗比例為1 10000，使用Li-COR Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)顯影拍照。圖4-B 為用抗 Flag 抗體檢測帶 Flag 標(biāo)簽的 ppfeilNAc-Tl、ppGalNAc-T2, ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4, ppGalNAc_T6、ppGalNAc_T8、ppGalNAc_T9、ppGalNAc-T10、 ppGalNAc-T12、 ppGalNAc_T13、 ppGalNAc_T14、 ppGalNAc_T15、 ppGalNAc_T16、 ppGalNAc-T17、ppGalNAc_T18 和 ppGalNAc_T20 蛋白的 Western Blotting 結(jié)果圖；一抗比例為1 2000，抗鼠二抗比例為1 15000，使用Li-COR Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)顯影拍照。圖4-C為用內(nèi)參基因抗體抗β-actin抗體檢測圖4-A及4-B中各泳道相同含有帶 Flag 標(biāo)簽的 ppGalNAc-Tl、ppGalNAc_T2、ppGalNAc_T3、ppGalNAc_T4、ppGalNAc_T6、 ppGalNAc-T8、ppGalNAc_T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc_T12、ppGalNAc_T13、ppGalNAc_T14、 ppGalNAc-T15、ppGalNAc_T16、ppGalNAc_T17、ppGalNAc_T18 和 ppGalNAc_T20 表達(dá)的細(xì)胞裂解液蛋白的Astern Blotting結(jié)果圖；一抗比例為1 2000，抗鼠二抗比例為 1 15000，使用Li-COR Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)顯影拍照。發(fā)明人對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)方法所制備的特異性針對(duì) ppGalNAc-T13的多克隆抗體具有極高的特異性，不與其它的ppfelNAc-Ts家族成員發(fā)生交叉反應(yīng)。實(shí)施例3 Western Blotting檢測本實(shí)施例制備的多克隆抗體的靈敏度實(shí)驗(yàn)原料純化后的GST-T13AG融合蛋白，特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)步驟將GST-T13AG融合蛋白溶液梯度稀釋，然后進(jìn)行flfestern Blotting的實(shí)驗(yàn)通過Wfestern Blotting檢測實(shí)施例1中所制備的特異性針對(duì)ppfeilNAC-T13的多克隆抗體的靈敏度的結(jié)果如圖5所示，1-6分別表示上樣量為25ngU2. 5ng、6. 25ng、0. 625ng、 0. 0625ng、0. 00625ng的GST-T13 AG融合蛋白，抗體稀釋比例一抗為1 2000，抗兔二抗為1 10000。發(fā)明人對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)方法所制備的特異性針對(duì) ppGalNAc-T13的多克隆抗體具有極高的靈敏度，可檢測出最低為0. 0625ng的抗原蛋白。實(shí)施例4:本發(fā)明所提供的特異性針對(duì)ppGalNAC-T13的多克隆抗體在免疫組化中的應(yīng)用試驗(yàn)原料成年C57小鼠的腦組織、特異性針對(duì)ppGalNAC-T13的多克隆抗體、神經(jīng)元特異性抗體Anti-Neun。試驗(yàn)步驟成年C57小鼠經(jīng)多聚甲醛灌注固定后，取腦組織，進(jìn)行組織冰凍切片； 得到的腦組織切片經(jīng)血清封閉，通透后加入特異性針對(duì)PpGalNAc-T13的多克隆抗體以及 anti-Neim抗體孵育過夜，再用熒光標(biāo)記的驢抗鼠、驢抗兔IgG 二抗孵育2小時(shí)，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。用實(shí)施例1中所制備的特異性針對(duì)ppGalNAC-T13的多克隆抗體通過組織免疫熒光法檢測C57小鼠腦組織中ppGalNAC-T13蛋白表達(dá)分布結(jié)果如圖6所示，其中左圖為 Anti-Neun抗體標(biāo)記熒光圖像，中圖為特異性針對(duì)ppGalNAC-T13的多克隆抗體標(biāo)記熒光圖像，右圖為左圖和中圖的疊加圖像。白色箭頭所示處即為用抗體檢測到的PpGalNAc-T13 蛋白在C57小鼠腦組織中的表達(dá)分布。發(fā)明人對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所提供的特異性針對(duì)PpGalNAc-T13的多克隆抗體可以應(yīng)用于組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測動(dòng)物組織內(nèi) ppGalNAc-T13蛋白的表達(dá)分布情況。實(shí)施例5:本發(fā)明所提供的特異性針對(duì)ppGalNAC-T13的多克隆抗體在免疫沉淀中的應(yīng)用試驗(yàn)原料pcDNA3.1 (+)載體，HEK-293T 細(xì)胞，ProteinA Beads,特異性針對(duì) ppGalNAc-T13的多克隆抗體。試驗(yàn)步驟將全長的ppGalNAC-T13基因cDNA克隆至pcDNA3. 1⑴載體中，分別用pcDNA3. 1 (+)空載體和上述構(gòu)建的pcDNA3. l-ppGalNAc_T13載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞， 48小時(shí)后，收集細(xì)胞，裂解，將細(xì)胞裂解液使用Protein A Beads進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，將 beads上吸附的蛋白洗脫下來進(jìn)行Western Blotting的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明所提供的特異性針對(duì) ppGalNAc-T13的多克隆抗體通過免疫沉淀法檢測HEK-293T細(xì)胞過表達(dá)全長ppGalNAC-T13 裂解液的Western Blotting結(jié)果如圖7所示，其中1和2分別為轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1 (+)載體和轉(zhuǎn)染pcDNA3. l-ppGalNAc-T13載體的HEK-293T細(xì)胞裂解液上清經(jīng)過Protein Abeads免疫共沉淀后的洗脫液；3為轉(zhuǎn)染pcDNA3. l-ppGalNAc-T13載體的HEK-293T細(xì)胞裂解液上清。 發(fā)明人對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所提供的特異性針對(duì)ppGalNAC-T13的多克隆抗體可以應(yīng)用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測和富集細(xì)胞裂解液中PpGalNAc-T13。本發(fā)明所得的特異性針對(duì)ppGalNAc-T13的多克隆抗體是用ppGalNAC-T13的莖區(qū)一段蛋白作為抗原得到的，由上述實(shí)施例可知，該抗體不與和ppGalNAC-T13同源性最高的 ppGalNAc-Tl發(fā)生交叉反應(yīng)，也不與其它的ppGalNAc-Ts家族成員發(fā)生交叉反應(yīng)。具有免疫印跡、組織細(xì)胞染色及免疫沉降等用途。不僅可以用于ppGalNAC-T13蛋白的體內(nèi)檢測，還可以用于ppGalNAC-T13蛋白的體外檢測，并具有極高的靈敏度。
權(quán)利要求
1.一種分離的抗原肽，其特征在于，所述抗原肽為氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的多肽或其保守性變異多肽。
2.一種分離的融合蛋白，含有權(quán)利要求1所述抗原肽與標(biāo)簽蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述標(biāo)簽蛋白選自GST、FLAG、 MAP (multiple antigenic ρ印tide)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
4.如權(quán)利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為氨基酸序列如SEQID NO 2所示的多肽與GST的融合蛋白。
5.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述分離的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述抗原肽或編碼權(quán)利要求2-4任一權(quán)利要求所述融合蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中，編碼所述抗原肽的多核苷酸的堿基序列如SEQ ID N0:1所示。
7.一種載體，含有權(quán)利要求5或6所述多核苷酸。
8.如權(quán)利要求7所述載體，其特征在于，所述載體選自pGEX-5X-l、pGEX_5X_2、 PGEX-5X-3、pGEX-4T-l、pGEX_4T_2、pGEX_4T_3、pGEX_6P_l、pGEX_6P_2、pGEX_6P_3、 pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET_41c(+)、pET_42a(+)、pET_42b(+)或 pET_42c(+)。
9.一種工程菌，含有權(quán)利要求7或8所述載體。
10.如權(quán)利要求9所述工程菌，其特征在于，所述工程菌選自原核表達(dá)菌株。
11.如權(quán)利要求10所述原核表達(dá)菌株，其特征在于，所述原核表達(dá)菌株選自 BL21(DE3)、Rosetta 2、Origami 2、Rosetta-gami 2 或 Origami B。
12.如權(quán)利要求11所述原核表達(dá)菌株，其特征在于，所述原核表達(dá)菌株為BL21(DE3)。
13.如權(quán)利要求1所述抗原肽或權(quán)利要求2-4中任一所述融合蛋白的制備方法選自以下任一a)利用化學(xué)合成方法合成所述抗原肽或融合蛋白；b)在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9-12中任一所述工程菌并使其表達(dá)所述抗原肽或融合蛋白，而后分離及純化獲得所述抗原肽或融合蛋白。
14.如權(quán)利要求1所述抗原肽或權(quán)利要求2-4中任一所述融合蛋白用于制備特異性針對(duì)ppGalNAC-T13的多克隆抗體的用途。
15.一種多克隆抗體，為以權(quán)利要求1所述的抗原肽或權(quán)利要求2-4中任一所述融合蛋白為抗原制得。
16.如權(quán)利要求15所述的多克隆抗體在制備診斷或治療腫瘤藥物或制劑中的應(yīng)用。
17.如權(quán)利要求15所述多克隆抗體的制備方法，為以權(quán)利要求1所述抗原肽或權(quán)利要求2-4中任一所述融合蛋白為免疫抗原免疫動(dòng)物獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化學(xué)及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，公開了針對(duì)ppGalNAc-T13多克隆抗體的特異性抗原肽及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明所述抗原肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示或其保守性變異多肽。ppGalNAc-T13與ppGalNAc-T1相似度高達(dá)85%，但與本發(fā)明制備的特異性針對(duì)ppGalNAc-T13的多克隆抗體不與ppGalNAc-T1發(fā)生交叉反應(yīng)，也不與ppGalNAc-Ts家族中的其他成員發(fā)生交叉反應(yīng)；本發(fā)明采用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得抗原，并且抗原攜帶有GST標(biāo)簽的技術(shù)方案，使產(chǎn)物易于純化。本發(fā)明所提供的制備方法簡單，制備的抗體免疫原性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C07K16/40GK102296052SQ20111023682
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者龐文杰, 張延 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)