專利名稱：分離塔三烷衍生物的方法及含其的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由植物的可再生源得到粗塔三烷(taxane)混合物的方法及含該混合物的組合物，本發(fā)明還涉及純化這些塔三烷混合物的方法和得到含特殊塔三烷的組合物。更具體講，本發(fā)明涉及以保留塔三烷含量的方式處理植物的方法。本發(fā)明還涉及用溶劑從植物提取塔三烷的方法，其中粗塔三烷混合物存在于水性溶劑中。另外，本發(fā)明涉及用正相色譜純化粗塔三烷混合物中特指塔三烷的方法。
塔三烷是具有塔三烷環(huán)的生物堿，塔三烷核包括如下所示的三環(huán)結(jié)構(gòu)，其也被鑒定為4，8，12，15，15-五甲基-三環(huán)〔9.3。1.03，8〕十五烷。
至少56個(gè)不同的塔三烷已在文獻(xiàn)中鑒明。例如，于1980年，R.W.Miller所寫(xiě)的文章概述了已知紫杉生物堿和其它塔三烷衍生物并報(bào)道了這些化合物的結(jié)構(gòu)，HNMR，MS和X-射線數(shù)據(jù)。R.W.Miller發(fā)表在J.Nat.Prod.43(4)425-437(1980)上的文章在此插入作為參考。下面的出版物在此也插入作為鑒定和說(shuō)明塔三烷的參考文獻(xiàn)M.G.Begley，E.A.Freeknall，and G.Pattenden，Acta Crystallogr，40;1745(1984);D.P.Della Casa de Marcano and T.G.Halsall，Chem.Comm.1382(1970);D.G.I.Kingston，D.A.Hawkins，and L.Ovington，J.Nat.Prod.45;466(1982);F.Guéritte-Voeglein，D.Guénard，and P.Potter.J.Nat.Prod.50(1)9-11(1987);B.Lythgoe in"The Alkaloids"Ed.by R.H.F.Manske，Vol.10，Academic Press，New York 1968，pp.597-626;D.P.Della Casa de Marcano and T.G.Halsall，Chem.Commun.1381(1970);V.Senilh，S.Blechert，M.Colin，D.Guenard，F(xiàn).Picot，P.Potier，and P.Varenne，J.Nat.Prod.47(1)pp.131-137(1984);J.L.McLaughlin，R.W.Miller，R.G.Powell and C.R.Smith，Jr.，J.Nat.Prod.44312-19(1981);D.P.Della Casa de Marcano and T.G.Halsall，Chem.Comm.365(1975);C.H.Oliver Huang，David G.I.Kingston，Neal F.Magri，G.Samaranayake and F.E.Boetner，J.Nat.Prod.49(4)665-669(1986).
具有一系列分子的塔三烷具有強(qiáng)有力的抗腫瘤活性。已研究的具有抗腫瘤活性的塔三烷已發(fā)現(xiàn)一般可用于治療卵巢癌和白血病(W.P.MacGuire et al.Annals of InternalR.W.Miller所寫(xiě)的文章概述了已知紫杉生物堿和其它塔三烷衍生物并報(bào)道了這些化合物的結(jié)構(gòu)，HNMR，MS和X-射線數(shù)據(jù)。R.W.Miller發(fā)表在J.Nat.Prod.43(4)425-437(1980)上的文章在此插入作為參考。下面的出版物在此也插入作為鑒定和說(shuō)明塔三烷的參考文獻(xiàn)M.G.Begley，E.A.Freeknall，and G.Pattenden，Acta Crystallogr，40;1745(1984);D.P.Della Casa de Marcano and T.G.Halsall，Chem.Comm.1382(1970);D.G.I.Kingston，D.A.Hawkins，and L.Ovington，J.Nat.Prod.45;466(1982);F.Guéritte-Voeglein，D.Guénard，and P.Potter.J.Nat.Prod.50(1)9-11(1987);B.Lythgoe in"The Alkaloids"Ed.by R.H.F.Manske，Vol.10，Academic Press，New York 1968，pp.597-626;D.P.Della Casa de Marcano and T.G.Halsall，Chem.Commun.1381(1970);V.Senilh，S.Blechert，M.Colin，D.Guenard，F(xiàn).Picot，P.Potier，and P.Varenne，J.Nat.Prod.47(1)pp.131-137(1984);J.L.McLaughlin，R.W.Miller，R.G.Powell and C.R.Smith，Jr.，J.Nat.Prod.44312-19(1981);D.P.Della Casa de Marcano and T.G.Halsall，Chem.Comm.365(1975);C.H.Oliver Huang，David G.I.Kingston，Neal F.Magri，G.Samaranayake and F.E.Boetner，J.Nat.Prod.49(4)665-669(1986).
具有一系列分子的塔三烷具有強(qiáng)有力的抗腫瘤活性。已研究的具有抗腫瘤活性的塔三烷已發(fā)現(xiàn)一般可用于治療卵巢癌和白血病(W.P.MacGuire et al.Annals of InternalMedicine，Vol.111.Pg.273(1989))。據(jù)信塔三烷是通過(guò)誘發(fā)微管蛋白聚合并形成極穩(wěn)定的和無(wú)功能微管(其對(duì)塔三烷敏感細(xì)胞有抗增殖作用)顯示出抗腫瘤活性，見(jiàn)Eric K.Rowinsky et al.，Journal of the National Cancer Institute.Vol.82，NO.15，PP，1247-1259(1990)。在已研究的塔三烷分子中，最具有抗腫瘤活性的是紅豆杉醇，Cephalomannine，去乙酰Cephalomamine，漿果赤霉素Ⅲ，10-去乙酰漿果赤霉素Ⅲ和10-去乙酰紅豆杉醇。這些塔三烷結(jié)構(gòu)如下所示
R1＝AC 漿果赤霉素ⅢR1＝OH 10-去乙酰漿果赤霉素Ⅲ
R1＝AC，R2＝C6H5紅豆杉醇R1＝OH，R2＝C6H510-去乙酰紅豆杉醇R1＝Ac，R2＝CH3CH＝C(CH3) CephalomannineR1＝OH，R2＝CH3CH＝C(CH3) 10-去乙酰Cephalomannine
乙?；阎獮榧t豆杉醇的塔三烷化合物是第一個(gè)被報(bào)道由西部短葉紅豆杉(一種緩慢生長(zhǎng)的針葉樹(shù))的莖皮分離出的塔三烷化合物。其結(jié)構(gòu)已由M.C.Wani等在Journal of American ChemicalSociety Vol.93.pp.2325-2327(1971)中闡明。
塔三烷通常是從野外收集的短葉紅豆杉的樹(shù)皮中分離出來(lái)的。由于特指的塔三烷在短葉紅豆杉中濃度極低(例如，紅豆杉醇占樹(shù)皮干重的約0.004%至約0.02%)，因此，必須砍伐大量樹(shù)并加工以產(chǎn)生研究所需的適量塔三烷。進(jìn)一步講，在各種不同條件下生長(zhǎng)的野生樹(shù)會(huì)導(dǎo)致樹(shù)皮中產(chǎn)生的塔三烷濃度變化很大。另外，樹(shù)的野生群落是塔三烷的不可靠源，因?yàn)樗鼈兪茉S多不肯定因素和風(fēng)險(xiǎn)的威脅，如森林火災(zāi)，常年氣候變化和不同化學(xué)類型的野生群落樹(shù)中紅豆杉醇含量的自然變化。環(huán)境學(xué)家對(duì)砍伐野生植物的批評(píng)增長(zhǎng)也威脅著短葉紅豆杉作為塔三烷的適當(dāng)來(lái)源的可能性。因此，短葉紅豆杉是塔三烷非再生和不肯定的來(lái)源。
更關(guān)鍵的是廣泛砍伐野生樹(shù)群會(huì)冒短葉紅豆杉未來(lái)培養(yǎng)的種質(zhì)遭破壞的風(fēng)險(xiǎn)。這種砍伐會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的野生基因密碼丟失，該基因密碼能提供這樣的特性對(duì)疾病和害蟲(chóng)的抗性，耐寒性，高生長(zhǎng)率，對(duì)充足陽(yáng)光，極端的干旱和洪水的耐受性，及高紅豆杉醇/塔三烷含量。保留這些野生基團(tuán)對(duì)于有價(jià)值紅豆杉醇和其它塔三烷生產(chǎn)(無(wú)論是否由培養(yǎng)的植物，組織培養(yǎng)或基因改性微生物產(chǎn)生的)的長(zhǎng)期開(kāi)發(fā)是關(guān)鍵的。由于野生種質(zhì)在未來(lái)生產(chǎn)戰(zhàn)略中起關(guān)鍵作用，因此，保留野生群落應(yīng)被看作是紅豆杉?jí)A和其它塔三烷生產(chǎn)的開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略的基本成份。
由于砍伐短葉紅豆杉的野生群落對(duì)紅豆杉醇產(chǎn)生的是有限的供給，因此，紅豆杉醇的臨床試驗(yàn)已僅限為幾種特指的化療應(yīng)用。缺乏可斷定價(jià)值的穩(wěn)定而可靠的紅豆杉醇源也將明顯妨礙該藥物的臨床應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)和可靠的塔三烷源是迫切需要的。
紅豆杉醇作為有力的癌癥化療劑和紅豆杉醇分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性已促使人們朝著它的全合成做了大量努力。但是，紅豆杉醇的分子復(fù)雜性表明從易得到的粗原料全合成紅豆杉醇看起來(lái)在經(jīng)濟(jì)上是不合算的。
塔三烷環(huán)骨架的合成報(bào)道于R.A.Holton et al，Journal of the American Chemical Society，106 5731(1984)，和ibid，Vol.110，PP.6558-6560(1988)。但這些合成的不足在于最終產(chǎn)品缺乏作為有效抗腫瘤劑所需的足夠藥理活性。
用10-去乙酰漿果赤霉素(由歐洲紅豆杉的葉子分離出的更豐富前體，1g/kg新鮮葉子)對(duì)紅豆杉醇的半合成已由法國(guó)工作者報(bào)道。另外，由10-去乙酰漿果赤霉素進(jìn)行的紅豆杉醇半合成可參照V.Senilh et al.，C.R.Seances Acad.Sci Ser 2，Vol.299，PP.1039-1043(1984);F.Guerittee-Voegelin，Tetrahedron.Vol.42，PP.4451-4460(1986);Colin et al歐洲專利申請(qǐng)0 253 278和Colin et al.歐洲專利申請(qǐng)0 253 739。因此，用塔三烷衍生物作起始原料的這些方法存在著這樣的缺點(diǎn)即該方法需要分離和純化來(lái)源于植物源的塔三烷，隨后將純化的塔三烷轉(zhuǎn)變?yōu)榧t豆杉醇;該多階段制備紅豆杉醇比直接從植物原料中分離紅豆杉醇更昂貴。
人們現(xiàn)已努力去開(kāi)發(fā)從植物中分離塔三烷如紅豆杉醇的新技術(shù)。但到目前為止還沒(méi)見(jiàn)報(bào)道從可再生源適當(dāng)提取塔三烷的方法。例如，用正相柱色譜手段由短葉紅豆杉的莖皮純化塔三烷可參見(jiàn)M.C.Wani et al.，Journal of the American Chemical Society，Vol.93，PP.2325-2327(1971)。正相柱色譜需用極性柱來(lái)起分子分離作用。
國(guó)家癌癥研究所天然產(chǎn)物部論文NSC＃125973(1983，7.15)也談到純化來(lái)自短葉紅豆杉的樹(shù)皮，原木，而不是來(lái)自其莖皮、支叉、嫩枝、針狀物、種子/果實(shí)和根的紅豆杉醇。
在NSC＃125973文章和其它出版物中記載的分離紅豆杉醇的方法的缺點(diǎn)是在萃取過(guò)程中依靠使用二氯甲烷。二氯甲烷和其它氯代烴如氯仿被認(rèn)為是有毒的并且是強(qiáng)有力的致癌物。因此，從這些化合物要暴露給進(jìn)行這些加工步驟的人員及這些化合物會(huì)通過(guò)痕量(不會(huì)從塔三烷藥物的最終劑量中純化的塔三烷中除去)強(qiáng)烈地暴露給患者的觀點(diǎn)出發(fā)，希望避免在萃取和純化來(lái)自植物的塔三烷中使用這些溶劑。
V.Senilh et al，Journal of Natural Products Vol.46，No.1，PP131-137(1984)談到了純化來(lái)自歐洲紅豆杉樹(shù)干的紅豆杉醇和Cephalomannine。Senilh et al報(bào)道的純化方法的不足之處在于在各種正相色譜上進(jìn)行塔三烷的多步洗脫后，還需用HPLC和結(jié)晶對(duì)特指的塔三烷進(jìn)行再一步純化。
人們現(xiàn)已試圖用反相柱色譜手段從植物中分離塔三烷。例如見(jiàn)Keith M Witherup et al.，Journal of Nataral Products，Vol.53，№.5，PP.1249-1253(1990);Keith M.Witherup et al.，Journal ofLiquid Chromatography.Vol.12，№.11，PP.2117-2132(1989)。但這些試圖不合需要，其在于塔三烷僅以相對(duì)低的產(chǎn)率分離出，約占塔三烷理論產(chǎn)率的50%。
反相柱色譜需用非極性柱起分子分離作用。反相色譜的另一缺點(diǎn)是從水性洗脫介質(zhì)中分離塔三烷很困難。水性介質(zhì)的蒸發(fā)即花費(fèi)高又耗時(shí)。進(jìn)一步講，用水性介質(zhì)水解了不穩(wěn)定的鍵，由此降低了塔三烷產(chǎn)率。在反相色譜步驟中使用的水性介質(zhì)還會(huì)使C-7立體中心部分差向異構(gòu)化，由此產(chǎn)生的差向異構(gòu)體是不需要的，因?yàn)樗鼈儠?huì)消除藥理性質(zhì)。進(jìn)一步講，這些不需要的差向異構(gòu)體與藥理上有效的塔三烷分離還需額外的花費(fèi)并且是困難的。
由于所需塔三烷產(chǎn)物在反相色譜步驟中是共同洗脫的，因此分離進(jìn)一步變復(fù)雜。因此，必須采用其它色譜步驟以完全分離出塔三烷，這將導(dǎo)致增加花費(fèi)和工作量。
從植物分離塔三烷的已知方法的另一缺點(diǎn)是這些方法要求植物為干燥形式。干燥植物的方法會(huì)促使含在植物中的塔三烷降解。因此，干燥的植物會(huì)降低塔三烷產(chǎn)率。
本發(fā)明用種植紫杉屬植物而不是用野生植物提供可更新的塔三烷新原料，野生植物來(lái)源有限。待處理而進(jìn)行塔三烷提取的植物優(yōu)選作為未處理剪枝提供，其莖上還有大量葉。該植物剪枝可用一種或多種溶劑處理而得富塔三烷組合物。
本發(fā)明還提出用一種或多種栽培的觀賞紫杉植物制成的富塔三烷組合物，其制法是用一種或多種溶劑處理一種或多種栽培植物的未處理剪枝而得富塔三烷產(chǎn)品。溶劑處理前植物剪枝必要時(shí)可干燥或研磨。
另外，本發(fā)明提出可用于后續(xù)提取塔三烷的植物原料制法，其中保留塔三烷成分并提高其可提取性，該方法包括制作含塔三烷植物莖上還保留大量葉的未處理剪枝，干燥該剪枝以減少其中揮發(fā)性成分而得基本干燥的剪枝并回收該基本干燥的剪枝。該植物原料制法優(yōu)選在低于約70℃的溫度下進(jìn)行而不在無(wú)阻直射陽(yáng)光照射下進(jìn)行。
按本發(fā)明制成未處理剪枝并干燥以降低揮發(fā)性成分后回收基本上干燥的剪枝而得到的塔三烷植物原料也是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還提出用含塔三烷植物制取塔三烷混合物粗產(chǎn)品的方法，其中包括初步溶劑處理，步驟如下A.從植物原料中提取塔三烷，其中將植物原料與有機(jī)溶劑接觸而得基本上無(wú)溶劑的富塔三烷第一殘?jiān)?
B.在能溶解塔三烷的有機(jī)溶劑和不能大量溶解塔三烷的水溶劑之間分離第一殘?jiān)糜袡C(jī)相和水相;
C.有機(jī)相和水相分離后回收基本上無(wú)水相的有機(jī)相;和D.用第二有機(jī)相制成第二殘?jiān)?以及將該第二殘?jiān)腿ミM(jìn)行最終處理。
第二殘?jiān)械乃榻?jīng)最終處理而提純，最終處理選自處理工藝E或F。最終處理E中步驟包括將第二殘?jiān)苡诳墒顾榭赡娴馗接诠腆w載體上的溶劑中，將固體載體加入包括溶解第二殘?jiān)娜軇┲胁⑹沟诙堅(jiān)械乃楦接诠腆w載體上，將固體載體與溶劑分離，順序?qū)⒏接兴榈墓腆w載體與一系列塔三烷洗脫性能不同的溶劑接觸，和從固體載體上洗出富含塔三烷的成分而得塔三烷混合物粗產(chǎn)品。
最終處理F包括在含水混合物和非極性不相混有機(jī)溶劑之間分離第二殘?jiān)?，其中含水混合物包括單一水相和可與水相混的極性有機(jī)溶劑，該極性有機(jī)溶劑在含水混合物中的量足以使第二殘?jiān)械乃檫M(jìn)入含水混合物，然后從含水混合物中分出塔三烷混合物粗產(chǎn)品。
除制取塔三烷混合物粗產(chǎn)品之外，本發(fā)明還包括按本文所述方法制成的塔三烷混合物粗產(chǎn)品組合物。
本發(fā)明還提出兩種或多種塔三烷，包括紅豆杉醇和ceplalomannine的分離法，其步驟包括將包括兩種或多種塔三烷的混合物加入可附在正相色譜柱上的溶劑中，將含塔三烷的混合物加到填有處于流動(dòng)相溶劑中的固體載體的正相色譜柱上，和用極性足以分別洗出紅豆杉醇和ceplalomannine的流動(dòng)相洗脫正相色譜柱而分離塔三烷。
另外，本發(fā)明提出用正相色譜法分離紅豆杉醇和cephaIomannine的方法，其中用乙酸乙酯和二氯甲烷混合物作流動(dòng)相。
用含塔三烷的植物原料制取并分離塔三烷的方法也是本發(fā)明的一部分，其中包括制作未處理剪枝，其中大量葉附在含塔三烷植物莖上，將未處理剪枝干燥以降低其揮發(fā)性成份含量而得基本上干的剪枝并回收該基本上干的剪枝。
從該基本上干的剪枝中提取塔三烷，其步驟如下
A.將植物原料與有機(jī)溶劑接觸而得基本上無(wú)溶劑的富塔三烷第一殘?jiān)?
B.在能溶解塔三烷的有機(jī)溶劑和不能大量溶解塔三烷的水溶劑之間分離第一殘?jiān)糜袡C(jī)相和水相;
C.將有機(jī)相和水相分離而回收基本上無(wú)水相的有機(jī)相;
D.用第二有機(jī)相制成第二殘?jiān)?
將該有機(jī)相送去作最終處理，選自E.將第二殘?jiān)苡诳蓪⑺榭赡娴馗接诠腆w載體上的溶劑中，將固體載體加入包括溶解第二殘?jiān)娜軇┎⑹沟诙堅(jiān)械乃楦接诠腆w載體上，將固體載體與溶劑分離，順序?qū)⒏接兴榈墓腆w載體與一系列塔三烷洗脫性能不同的溶劑接觸，和從固體載體中分出富塔三烷成分而得塔三烷混合物粗產(chǎn)品，或F.在含水混合物和非極性不相混有機(jī)溶劑之間分離第二殘?jiān)?，其中含水混合物包括單一水相和極性并可與水相混的極性有機(jī)溶劑，該極性有機(jī)溶劑在該混合物中的量足以使第二殘?jiān)械乃檫M(jìn)入含水混合物，和從第二含水混合物中回收塔三烷混合物粗產(chǎn)物，將處理工藝E或F得到的包括兩種或多種塔三烷的塔三烷混合物粗產(chǎn)品加入宜于附于正相色譜柱的溶劑;
將包括塔三烷的混合物加到填有處于流動(dòng)相溶劑中的固體載體的正相色譜柱上;
用極性不同以分別洗出紅豆杉醇和ceplalomannine的流動(dòng)相洗脫正相色譜柱而分離塔三烷。
因此，本發(fā)明目的是提出恒定和可更新的塔三烷原料和有效分離塔三烷的方法。
本發(fā)明另一目的是提出從植物原料中分出塔三烷的方法，其中對(duì)大量正相色譜填料的多次洗脫的需要大為減少。
本發(fā)明另一目的是提出塔三烷分離法，其中可避免或盡可能減少采用某些氯代烴，如二氯甲烷和氯仿。
本發(fā)明另一目的是提出從植物原料中分出塔三烷的方法，其中塔三烷收率高。
本發(fā)明另一目的是提出含塔三烷植物原料干燥以盡可能減少塔三烷損失的方法。
本發(fā)明另一目的是提供可作為塔三烷來(lái)源的基本上干燥植物原料。
本發(fā)明另一目的是提出從植物原料中分離塔三烷的方法，其中可簡(jiǎn)單攪拌而從植物原料中去除有機(jī)成分。
本發(fā)明另一目的是提出從植物原料中分離塔三烷的方法，其中完全不需過(guò)濾步驟。
本發(fā)明另一目的是提出從植物原料中分離塔三烷的方法，其中無(wú)須用反相色譜法所用的含水洗脫介質(zhì)。
本發(fā)明另一目的是提出從植物原料中分離塔三烷的方法，其中可避免C-7立體中心的差向異構(gòu)。
本發(fā)明另一目的是提出從植物原料中分離塔三烷的方法，其中所有塔三烷在正相色譜操作中均具有各自特征的滯留時(shí)間。
本發(fā)明另一目的是提出塔三烷混合物粗產(chǎn)品制法。
本發(fā)明另一目的是提供包括塔三烷混合物粗產(chǎn)品的組合物。
含塔三烷的任何植物均可用于本發(fā)明的方法，而且所用植物可為純種植物，混合種或雜交植物或未知植物。從野生植物收取的植物原料可作塔三烷原料，例子包括T.brevifolia，T.baccata，T.Cuspidata和T.Watlachiana。優(yōu)選用紫杉屬栽培植物原料作塔三烷原料，尤其是用某些種植觀賞紫杉品種。本文所用“栽培植物”意指種植植物類稱，這一類的特征(形態(tài)，生理，細(xì)胞學(xué)，化學(xué)或其它特征)清楚可見(jiàn)，且繁殖(有性或無(wú)性)時(shí)保留其鑒別性特征，見(jiàn)Hortus ThirdA Concise Dictionary of Plants Cultivated in the United States，MacMillan Publishing Co.，Inc.，1976。
現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)幾種栽培觀賞紫杉鮮葉中證明含有紅豆杉醇，其含量等同或高于T.brevifolia干燥莖皮，已證實(shí)此種有T.X media"Henryi’，T.X media‘Runyan’，T.cuspidata，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Dark Green Spreader’和種植T.cuspidata‘Brevifolia’，T.cuspidata‘Spreader’.而其它干葉中紅豆杉醇含量可與T.brevifolia干莖皮相比的品種包括T.X media‘Wardii’，T.X media‘Brownii’，和T.X media‘Densiformis’.
優(yōu)選栽培植物選自T.X media‘Densiformis’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，T.X media‘Runyan’，T.X media Brownii’，T.X media‘Wardii’，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.cuspidata‘Brevifolia’，和T.cuspidata.但更優(yōu)選的是用其葉中塔三烷含量高于T.brevifolia干莖皮的栽培植物作塔三烷原料。更優(yōu)選的栽培植物選自T.cuspidata;T.X media‘Halloran’;T.X media‘Hatfield’;T.X media‘Nigra’;T.X media‘Tauntonii’;T.X media‘Dark Green Spreader’;和T.X media‘Hicksii’.上述栽培植物可從工業(yè)苗圃得到。
用于本發(fā)明方法的植物原料可為含塔三烷栽培植物的任何部分，包括葉，莖，枝，皮，根或其混合物。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中剝離前葉在未處理剪枝的小莖上干燥以保留其紅豆杉醇成分。本文中“未處理剪枝”包括原生葉仍大量保留在莖上的任何剪枝，而剪枝在本領(lǐng)域又稱為“修剪”。另外，帶葉小莖上的紅豆杉醇成分大致為葉中含量的60-70%。
按本發(fā)明待提取植物原料以新鮮或干燥態(tài)得以應(yīng)用。本文中“新鮮”包括基本上保留所有揮發(fā)性成分的植物體。優(yōu)選的是植物在低于70℃的溫度下干燥，在完全光照，遮陰處或暗室中進(jìn)行，因此干燥可不在無(wú)礙直接陽(yáng)光照射下進(jìn)行。本文中“完全光照”包括環(huán)境中可見(jiàn)光，如陽(yáng)光或溫室或人工光照設(shè)施內(nèi)光照基本上不受阻礙，不受反射或不受其它方式影響而能達(dá)到植物的任何條件。更優(yōu)選的是植物約65-約20℃下在遮陰或暗室條件下進(jìn)行干燥，且干燥優(yōu)選條件還包括用干空氣或低濕度，其中相對(duì)濕度優(yōu)選不超過(guò)約80%，更優(yōu)選不超過(guò)約50%。本文中“遮陰條件”包括外界無(wú)礙可見(jiàn)日光的約40-約70%得以受阻，反射或以其它方式而不能達(dá)到正在干燥的植物的任何環(huán)境。另外，應(yīng)避免讓植物暴露在光被植物吸收并轉(zhuǎn)化成熱而使植物溫度升高到約70℃以上的光照條件下。干燥優(yōu)選使植物減重至少25%，更優(yōu)選干燥失重約40-約70%。
盡管不想受到任何理論的束縛，但據(jù)信植物在本發(fā)明條件下干燥可基本保存其中的塔三烷成分，其中限制其分解。另外，雖然不想受到任何理論的束縛，但仍據(jù)信本發(fā)明植物干燥法可提高紅豆杉醇和其它塔三烷的可提取性。
本專業(yè)普遍技術(shù)人員可以看出干燥溫度和干燥時(shí)間的關(guān)系，如相對(duì)高溫下干燥要求的時(shí)間比相對(duì)低溫下干燥所需時(shí)間要短。上述使植物干燥而失重，但同時(shí)又基本上不損壞植物中的塔三烷成分的任何方法均在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中包括凍干和微波干燥法。
雖然植物干燥時(shí)的壓力據(jù)認(rèn)為并不關(guān)鍵，但應(yīng)當(dāng)看到低于大氣壓的壓力可使干燥在低溫下或短時(shí)間完成。因此，實(shí)踐時(shí)可根據(jù)本發(fā)明而在各種干燥溫度和大氣壓范圍內(nèi)作出選擇。
根據(jù)本發(fā)明方法制成的包括基本上干燥的未處理剪枝的植物提供了可作為塔三烷來(lái)源的植物原料，此仍為本發(fā)明的一部分。剪枝干燥后回收以后續(xù)用作塔三烷原料。
盡管待提取植物可以其基本上未處理狀態(tài)使用，但優(yōu)選將其加工以增大其表面積并因而提高塔三烷提取率。更優(yōu)選的是將植物切碎，搗爛或加工成粉，最好是手工或機(jī)械辦法將植物研細(xì)。適當(dāng)研磨方法包括用混煉機(jī)，球磨機(jī)，Wiley研磨機(jī)或Fritz研磨機(jī)，當(dāng)然本發(fā)明范圍內(nèi)還可采用其它研磨裝置和研磨方法。
植物優(yōu)選研磨至約40-80目粒徑，更優(yōu)選約60目。
為提取塔三烷，以上述任何物理狀態(tài)的待提取新鮮或干燥植物進(jìn)行一次或多次初步溶劑處理，其中包括將植物與有機(jī)溶劑接觸而制成提取物，再用其制成基本上無(wú)溶劑的第一殘?jiān)?，其中富含塔三烷。植物用溶劑多次提取可提高塔三烷提取物。植物重量與有機(jī)溶劑體積之比優(yōu)選約1∶8至1∶12，更優(yōu)選約1∶10;而植物重量與用來(lái)提取植物中塔三烷的有機(jī)溶劑總體積之比約1∶10至約1∶150，更優(yōu)選約1∶40。
優(yōu)選還用滲濾或索格利特萃取法來(lái)促進(jìn)植物與有機(jī)溶劑的接觸，更優(yōu)選的是搖蕩促進(jìn)接觸，最好是在植物浸入有機(jī)溶劑過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行攪拌而完成接觸。該步驟中基本上所有可提取有機(jī)物，包括塔三烷，均從植物中分離并被帶進(jìn)有機(jī)溶劑。
與植物接觸的有機(jī)溶劑優(yōu)選為常用來(lái)從植物中提取有機(jī)化學(xué)品的有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙醇，丙酮，乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，甲·乙酮，甲基·異丁基酮，甲基·叔丁基醚或其混合物，更優(yōu)選為乙醇。而且已發(fā)現(xiàn)，約3-約6份的約40-約200ml有機(jī)溶劑在約8-約48小時(shí)內(nèi)加入即足以從約10g植物中分出基本上100%的所有塔三烷，并且約3-約6份的約2-約5l有機(jī)溶劑在約4-48小時(shí)內(nèi)加入即足以從約1000g植物中分出基本上100%的所有塔三烷。
另一優(yōu)選實(shí)施方案中植物必要時(shí)先用己烷，己烷混合物，戊烷，石油醚，異辛烷或其混合物脫脂后再與有機(jī)溶劑接觸，例如已發(fā)現(xiàn)用2份的大約100ml己烷足以在約8小時(shí)-約2天內(nèi)使約10g研磨干植物脫脂。
更優(yōu)選實(shí)施方案中植物原料先用己烷脫脂后用有機(jī)溶劑乙醇、丙酮或乙酸乙酯搖蕩提取24小時(shí)，其中4次換溶劑。
本專業(yè)人員已知多次用相對(duì)少量的溶劑比一次應(yīng)用大量溶劑更有利于提取植物。因此，本發(fā)明實(shí)踐中可偏離每一步所用之溶劑體積，操作包括提取，分離或如本文所述分出有機(jī)材料以及重復(fù)提取次數(shù)，但這仍屬本發(fā)明范圍。
用有機(jī)溶劑從植物中提取的親水部分與塔三烷分離并去除，其中在適宜配對(duì)的有機(jī)和水溶劑之間分離由有機(jī)溶劑得到的提取植物質(zhì)以使塔三烷仍留在有機(jī)溶劑中，而親水部分則隨水溶劑去除?？捎孟嗷ゲ幌嗷烨姨崛〕煞址蛛x至一相的純度已基本上不被另一相所污染的程度后可相互分離的有機(jī)和水溶劑，只是塔三烷在有機(jī)溶劑中要有足夠的溶解度以保留在有機(jī)溶劑中，而且適宜的水溶劑不應(yīng)溶解大量塔三烷。因此，在包括于不同兩相間分離塔三烷或其進(jìn)一步提純的該步驟和任何后續(xù)步驟中，應(yīng)去除任何來(lái)自上一步驟的溶劑，其中塔三烷仍保留而作進(jìn)一步提純，因?yàn)樵撊軇?huì)干擾后續(xù)步驟中溶劑發(fā)揮作用，如來(lái)自可通過(guò)提高有機(jī)和水溶劑的可混性而干擾后一步驟中有機(jī)和水溶劑分離的步驟的溶劑在將塔三烷與待分離有機(jī)和水溶劑接觸之前應(yīng)去除。
優(yōu)選的是在用有機(jī)溶劑提取植物質(zhì)之后的提取液蒸發(fā)至干而形成第一殘?jiān)?，其中不加熱或加熱促進(jìn)溶劑蒸發(fā)。若加熱，則應(yīng)避免使塔三烷差向異構(gòu)的溫度，而優(yōu)選溫度應(yīng)不超過(guò)約35-約40℃。
一旦溶劑蒸發(fā)，將留下來(lái)的第一殘?jiān)苡谟袡C(jī)溶劑，如二氯甲烷或更優(yōu)選溶于乙酸乙酯中以形成第二殘?jiān)?，其中第一殘?jiān)c有機(jī)溶劑之重量∶體積之比優(yōu)選約1至約10-20，如1g殘?jiān)扇苡诩s10-20ml有機(jī)溶劑中。用不溶解大量塔三烷的含水溶劑成分分離而對(duì)第二提取物進(jìn)行洗滌以去除其中可能存留的任何親水成分，其中含水溶劑可用水，類似極性溶劑或其混合物，而優(yōu)選含水溶劑為水。含水溶劑體積達(dá)到有機(jī)溶劑體積之大約一半一般即足以洗滌第二提取物。然后將含水溶劑與第二殘?jiān)珠_(kāi)并棄去含水溶劑。
第二提取物含塔三烷，必要時(shí)可用干燥劑處理而去除其中的水份，然后分離干燥劑并蒸發(fā)溶劑而得第二殘?jiān)?。?yōu)選干燥劑為無(wú)水硫酸鎂，4
分子篩，氯化鈣或其混合物，更優(yōu)選無(wú)水硫酸鈉。實(shí)踐中可發(fā)現(xiàn)，在將含塔三烷第二提取物和干燥劑放在一起之前，向干燥劑中加少量有機(jī)溶劑是有利的。向干燥劑中加有機(jī)溶劑可防止塔三烷粘到干燥劑上，因此可提高收率。可經(jīng)重力過(guò)濾法，真空過(guò)濾法或從干燥劑中傾析溶劑的辦法去除干燥劑。另一種從第二提取物中去除剩余水的辦法是將第二提取物冷卻至其中水凍結(jié)而又不使有機(jī)溶劑凍結(jié)的溫度。液態(tài)無(wú)水物料可從含水物料中傾析分離。
按本發(fā)明將第二殘?jiān)M(jìn)行最終處理可進(jìn)一步提純塔三烷。最終處理方法之一中第二殘?jiān)苡诳墒顾榭赡娴馗接诠腆w載體上的溶劑中，然后將固體載體加入含溶解第二殘?jiān)娜軇┲胁⑹箒?lái)自第二殘?jiān)ㄋ榈某煞指皆诠腆w載體上。優(yōu)選將溶劑蒸發(fā)而將殘?jiān)粼贑鹽上使固體載體與溶劑分離，該殘?jiān)纬梢缓榈耐繉?，然后固體載體順序用一系列可制富塔三烷成分洗脫液的溶劑洗脫。適宜固體載體為C鹽，優(yōu)選C鹽涂有第二殘?jiān)幸讶苡诎状己鸵宜嵋阴セ旌衔锏挠袡C(jī)溶劑中并通過(guò)將溶劑從溶劑、第二殘?jiān)虲鹽混合物中蒸出而得到的成分，其中甲醇和乙酸乙酯體積-體積比優(yōu)選1∶3。
涂層C鹽優(yōu)選先用不會(huì)大量洗脫塔三烷但可洗脫其它極性不那么強(qiáng)的分子的己烷進(jìn)行洗脫。本發(fā)明塔三烷混合物粗產(chǎn)品然后可優(yōu)選用二氯甲烷或另一類似極性溶劑洗出來(lái)。
進(jìn)一步提純第二殘?jiān)兴榈牧硪环椒òㄔ诤旌衔锖头菢O性不相混有機(jī)溶劑之間分離第二殘?jiān)?，其中?yōu)選將第二殘?jiān)热苡诤旌衔镏校缓笤倥c非極性不相混有機(jī)溶劑合并。優(yōu)選非極性不相混有機(jī)溶劑如己烷，戊烷，石油醚，庚烷，異辛烷和其混合物，優(yōu)選己烷。而非極性不相混有機(jī)溶劑與含水混合物之比優(yōu)選2比1。含水混合物為包括水和可與水相混的極性有機(jī)溶劑的單相含水混合物，其中極性有機(jī)溶劑量足以使第二殘?jiān)械乃檫M(jìn)入含水混合物之中。優(yōu)選含水混合物包括約50%以上的極性有機(jī)溶劑，其余為水，而更優(yōu)選的是約9份極性有機(jī)溶劑加約1份水。優(yōu)選實(shí)施方案中極性有機(jī)溶劑為乙腈，更優(yōu)選為甲醇。
包括本發(fā)明塔三烷混合物粗產(chǎn)品的含水混合物與非極性不相混有機(jī)溶劑分離，而含水混合物可蒸發(fā)去除極性有機(jī)溶劑且塔三烷混合物粗產(chǎn)品可與有機(jī)溶劑合并而使塔三烷進(jìn)一步提純。因含水混合物組成中主要為乙腈或甲醇，所以優(yōu)選直接蒸發(fā)而形成包括塔三烷混合物粗產(chǎn)品的第三殘?jiān)??？杉訜?，抽真空和其組合應(yīng)用來(lái)促進(jìn)蒸發(fā)，只是含水混合物溫度應(yīng)不超過(guò)約40℃。含水混合物直接蒸發(fā)可排除在不必要的萃取步驟中喪失塔三烷的任何可能性。
可一次或多次重復(fù)上述工藝中制取塔三烷混合物粗產(chǎn)品的任何初步溶劑處理或最終處理步驟，如上述步驟中的任一步均可重復(fù)至少一，二，三或四次。
用本發(fā)明塔三烷混合物粗產(chǎn)品可提純特定的塔三烷，其中可用任何常用的提純工藝，如結(jié)晶或研制。塔三烷混合物粗產(chǎn)品中存在的并可按本發(fā)明方法進(jìn)一步提純的優(yōu)選塔三烷包括紅豆杉醇，Ceplalomannine，脫乙?；鵆eplalomannine，漿果赤霉素Ⅲ，10-脫乙酰基漿果赤霉素Ⅲ和10-脫乙?；t豆杉醇。在基本上飽和的塔三烷混合物粗產(chǎn)品溶液中形成晶體即可進(jìn)行結(jié)晶。另一方面，可在基本上飽和的塔三烷粗產(chǎn)品溶液中加所要塔三烷產(chǎn)品的晶種而使晶體生長(zhǎng)。理論上講，可用單一溶劑作結(jié)晶溶劑，當(dāng)然本發(fā)明也可用混合溶劑。結(jié)晶溶劑溫度并不關(guān)鍵，只要能形成基本上純的塔三烷即可。
本發(fā)明中也可用一系列正相色譜柱從塔三烷混合物粗產(chǎn)品中提純特定塔三烷，其中用漸增洗脫能力的溶劑混合物通過(guò)柱即可洗出特定塔三烷。一般來(lái)說(shuō)，正相柱色譜法中流動(dòng)相包括雙成分系統(tǒng)，其中第一成分為可控制化合物洗脫速度的非極性有機(jī)溶劑，而第二成分為可洗出待分離化合物的極性有機(jī)溶劑。增加流動(dòng)相中第二成分的量一般可縮短洗脫化合物與柱中填料的接觸時(shí)間。因此，較高濃度的第二成分可縮短洗脫時(shí)間。
采用具有增值洗脫能力梯度的流動(dòng)相可提高塔三烷的分離效果，當(dāng)然本發(fā)明也可采用等值洗脫。一根或多根正相色譜柱的填料可優(yōu)選自硅膠，合成硅酸鎂載體，氧化鋁和C鹽，特別優(yōu)選硅膠60，230-400目，由E.Merk公司制造并可從Brinkman Ins trument Co.，Westbury，N.Y.購(gòu)得。
為制成塔三烷混合物粗產(chǎn)品，第三殘?jiān)詡渖V柱用，第三殘?jiān)捎媚苋芙馑榈挠袡C(jī)溶劑重復(fù)(1-5次)研制(浸提)，其中有機(jī)溶劑選自醚，二氯甲烷，甲醇，氯仿，乙酸乙酯和丙酮，優(yōu)選有機(jī)溶劑為二氯甲烷。溶于有機(jī)溶劑的第三殘?jiān)c固體載體，如硅藻土或C鹽合并，蒸發(fā)至干，從而使塔三烷粘到固體載體上。
含塔三烷固體載體可直接附到填充正相色譜柱頂部。
一旦固體載體直接放在填料正相色譜柱頂上，就讓可使塔三烷相互分離并與其它植物成分分離的流動(dòng)相通過(guò)色譜柱。流動(dòng)相包括(1)非極性成分，選自己烷，石油醚，異辛烷和類似非極性溶劑和(2)極性成分，選自丙酮，乙酸乙酯，醚，甲基·叔丁基醚，氯仿和類似極性溶劑，優(yōu)選流動(dòng)相包括己烷和丙酮。
優(yōu)選實(shí)施方案中最初流動(dòng)相包括約60-85%己烷和約15-40%丙酮并遵循洗脫能力增值梯度。流動(dòng)相可達(dá)到任何最終組成，只要可完成塔三烷的有效分離即可。但更優(yōu)選的是流動(dòng)相最初濃度為約75%己烷和約25%丙酮，最終濃度為約10%己烷和約100%丙酮。在己烷/丙酮混合物情況下，己烷可控制洗脫速度，而丙酮可洗出塔三烷。將要求塔三烷從包括約60%己烷和約40%丙酮以及約0%己烷和約100%丙酮的成分中洗出。另一方面，可用極性類似于上述己烷/丙酮混合物的任何其它系列溶劑混合物將塔三烷分子從第一正相色譜柱中洗出。
正相色譜柱優(yōu)選加壓操作。對(duì)于含160g硅膠60的5×16Cm柱，流速優(yōu)選約100ml/5分鐘。
從柱中收集的成分中存在的塔三烷可經(jīng)用硅膠G UV254(Machery Nagel，Duren)的薄層色譜法(“TLC”)檢測(cè)，其中用5%甲醇/氯仿作展開(kāi)系統(tǒng)并用對(duì)甲氧基苯甲醛/硫酸作顯色試劑。紅豆杉醇和cephalomannine以藍(lán)灰點(diǎn)出現(xiàn)，Rf值0.62，用比例為60∶40和55∶45的己烷/丙酮洗出的成分測(cè)得。漿果赤霉素Ⅲ以藍(lán)點(diǎn)出現(xiàn)，Rf值0.55，用比例為50∶50和45∶55的己烷/丙酮洗出液測(cè)得。塔三烷10-脫乙酰基漿果赤霉素Ⅲ以紫點(diǎn)出現(xiàn)，Rf值0.28，用比例0∶100的己烷/丙酮洗出液測(cè)得。
己烷/丙酮溶劑從富塔三烷洗出液中蒸發(fā)至干而得富塔三烷產(chǎn)品。
塔三烷中紅豆杉醇和cephalomannine的進(jìn)一步提純是將包括紅豆杉醇和cephalomannine的富含塔三烷產(chǎn)品加到另一根正相色譜柱中，該柱中填有硅膠60或類似物料以及約1%甲醇和99%二氯甲烷。流動(dòng)相洗脫能力通過(guò)甲醇濃度以約0.5%的增值速度增加而得以提高，直至流動(dòng)相組成為約2.5%甲醇，97.5%二氯甲烷。經(jīng)過(guò)2Cm×40Cm柱的流動(dòng)相優(yōu)選流速為約8ml/分鐘。塔三烷中紅豆杉醇和cephalomannine從約2.5%甲醇和97.5%二氯甲烷洗出液中收集得到。另一方面，可用極性類似于上述甲醇/二氯甲烷溶劑混合物的任何其它系列的溶劑混合物來(lái)從第二正相色譜柱中洗出塔三烷。從甲醇/二氯甲烷柱中得到的富含紅豆杉醇-Cephalomennine的洗出液蒸發(fā)至干而得另一富含塔三烷的產(chǎn)品。
出人意料的是，紅豆杉醇可按本發(fā)明方法與Cephalomennine分開(kāi)，其中將包括兩種或多種塔三烷的混合物加入宜于使其附到正相色譜柱上的溶劑中。然后將含塔三烷混合物加入正相色譜柱中，其中填有處于宜作流動(dòng)相的溶劑中的固體載體。塔三烷，包括紅豆杉醇和Cephalomennine可用流動(dòng)相分別洗出，流動(dòng)相極性足以分別洗脫紅豆杉醇和Cephalomannine。優(yōu)選用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物作流動(dòng)相。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中第二富含塔三烷的產(chǎn)品溶于約20%乙酸乙酯和80%二氯甲烷的混合物后加入填有上述硅膠60或類似固體載體的正相色譜柱中，其中存在包括約20%乙酸乙酯和80%二氯甲烷的流動(dòng)相。以約5%的速度增加乙酸乙酯濃度可提高流動(dòng)相洗脫能力，直至流動(dòng)相組成達(dá)到約50%乙酸乙酯，50%二氯甲烷。1Cm×32Cm柱中優(yōu)選流速約8ml/分鐘。從約45%乙酸乙酯，55%二氯甲烷洗出液中可收集到基本上純的紅豆杉醇，而從約50%乙酸乙酯和50%二氯甲烷洗出液中可收集到基本上純的Cephalomannine。另一方面，可用極性類似于上述乙酸乙酯/二氯甲烷混合物的任何其它系列的溶劑混合物從正相色譜柱中洗出塔三烷分子，包括紅豆杉醇和Cephalomannine。
根據(jù)最初正相色譜步驟中達(dá)到的塔三烷混合物粗產(chǎn)品分離程度，用乙酸乙酯和二氯甲烷作流動(dòng)相另外進(jìn)行色譜分離塔三烷可出人意料地分離并提純塔三烷，包括紅豆杉醇與Cephalomannine分離，從而免除了中間用甲醇-二氯甲烷進(jìn)行色譜分離的要求。
上述色譜分離步驟中任一步均可重復(fù)一或多次，如一，二，三或四次，以在具體步驟中提純或分離塔三烷。
盡管柱色譜法為優(yōu)選法，但任何其它色譜結(jié)構(gòu)，如在chromatotron上進(jìn)行的徑向正相色譜可用于本發(fā)明方法。而且，本發(fā)明可用其它適宜的檢測(cè)裝置證實(shí)塔三烷的存在。
例1不同品種種植觀賞紫杉的紅豆杉醇定量分析分析各種栽培觀賞紫杉新鮮葉中紅豆杉醇含量，方法如下。
a.從剪枝中摘下的葉充分混合后稱重。
b.混合機(jī)中10g每種種植觀賞紫杉樣品與100ml95%乙醇混合后定量轉(zhuǎn)入250ml錐形瓶中。讓葉和乙醇滲濾提取24小時(shí)后沖洗過(guò)濾(1×25ml)，然后3次重復(fù)滲濾。
c.合并濾液后(500ml)不超過(guò)40℃真空蒸發(fā)至干并記下乙醇提取物或第一殘?jiān)亍?br>
制備乙醇提取物用于HPLC分析a.大約100mg提取物計(jì)量加入螺帽管瓶中，其中帽內(nèi)襯一塊鋁箔以阻止提取物分離時(shí)與蓋內(nèi)襯接觸。
b.提取物在水(1ml)和二氯甲烷(2ml×5)間分離直至二氯甲烷成為無(wú)色的。合并的二氯甲烷洗液移入25ml錐形瓶中蒸發(fā)至干而得第二殘?jiān)⒎Q重記錄。
c.第二殘?jiān)苡谝宜嵋阴?5ml)和甲醇(2ml)中(聲處理)。加入C鹽(200mg至650mg)并讓其涂上被提取物料。溶劑真空蒸發(fā)至干而得涂有第二殘?jiān)腃鹽物料。
d.涂殘?jiān)麮鹽定量轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中并將該平皿置于通風(fēng)櫥中直至去除最后剩下的微量溶劑(10分鐘)。最終產(chǎn)品研制直至得到能自由流動(dòng)的均勻粉并將其填入作為柱的巴斯德吸移管中。
e.柱用己烷洗滌(7ml或直至洗出液成為無(wú)色的)，然后用二氯甲烷洗脫(5-6ml)。
f.二氯甲烷洗出液真空蒸發(fā)后將殘?jiān)Q重記錄。
g.殘?jiān)?ml甲醇(HPLC級(jí))中聲處理溶解。溶液吸入1ml注射器中并經(jīng)Millex過(guò)濾裝置(0.45μ)濾入Wheaton管瓶中，然后封帽。
HPLC條件柱μBondapak C-18(10μ，WatersAssociates)流動(dòng)相甲醇/水(65∶35)流速1.2ml/分鐘檢測(cè)U.V.，227nmAUFS0.1注入量10μl分析結(jié)果示于表1。
表1某些栽培紫杉新鮮葉中紅豆杉醇含量栽培品種 %乙醇提 %紅豆杉醇平均值取物 +S. D.1T. X media 'Henryi' 17.63 0.00272T. X media 'Densiformis' 18.93 0.00342T. X media 'Hicksii' 15.43 0.01042T. X media 'Dark Green Spreader' 15.32 0.00962T. X media 'Runyan' 17.04 0.00572T. X media 'Brownii' 19.55 0.00272T. X media 'Wardii' 14.89 0.00522T. cuspidata'Brevifolia' 14.10±0.36 0.0097±0.0037C.V.=38%T. X media 'Brownii' 16.07±0.93 0.00465±0.00096C.V.=20.6%T. cuspidata514.73±0.46 0.0141±0.00226C.V.=16%T. X media 'Densiformis' 13.53±1.36 0.00594±0.00039C.V.=6.5%T. X media 'Halloran' 14.79±0.18 0.01183±0.00057C.V.=4.8%T. X media 'Hatfield' 12.83±0.29 0.0121±0.00042C.V.=3.5%T. X media 'Hicksii' 15.67±0.29 0.0152±0.0023C.V.=15%T. X media 'Nigra'415.13±0.23 0.0291±0.0057C.V.=19.6%T. baccata 'Repandens' 12.83±0.57 0.00178±0.00074C.V.=41.5%T. X media 'Tauntonii'316.47±0.92 0.0198±0.00245C.V.=12%1 n＝3，只是T.X media‘Hicksii’，‘Fairview，除外，C.V.＝偏離系數(shù)。
‘Wardii’和‘Spreader’的n-4。
2 基于一次測(cè)定的單一值。
3 同意詞＝‘Tautoni’，T.cuspidata‘Tauntonii’4 某些機(jī)構(gòu)稱作T.baccata‘Nigra’5 未命名的T.cuspidata。無(wú)性繁殖栽培品種。
T. X media 'Hicksii' 19.71±1.01 0.0093±0.0013C.V.=14%T. X media 'Fairview' 19.25±0.38 0.0013±0.0004C.V.±30.7%T. X media 'Wardii' 18.97±0.45 0.0084±0.0036C.V.=43%T. cuspidata'Spreader' 19.52±0.49 0.0032±0.00036C.V.=11%
例2葉干燥之前從莖上摘取葉對(duì)紅豆杉醇回收率的影響以從剪枝上摘下的新鮮葉(100g)作為某些大批栽培植物(3-6磅)的代表性樣品，用例1的方法分析其紅豆杉醇含量。表2中列出了從新鮮葉中提取的紅豆杉醇百分率并將其與干燥葉提取率比較。計(jì)算紅豆杉醇含量為干植物原料中期望%紅豆杉醇，基于新鮮物料測(cè)定的%紅豆杉醇含量和植物原料%濕含量，即%紅豆杉醇(計(jì)算)＝%新鮮紅豆杉醇/〔1-(%濕含量/100)〕，其中%濕含量是用植物原料干燥前后重量差值測(cè)定的。
然后計(jì)量實(shí)測(cè)干燥%紅豆杉醇含量與計(jì)算干燥%紅豆杉醇含量之比(F/C)。結(jié)果表明，小于1.00的值指在干燥過(guò)程中損失了紅豆杉醇(如0.90指損失10%)，而大于1.00的值指干燥方法產(chǎn)生了量大于新鮮剪枝提取所得值的紅豆杉醇(如1.20指20%增值)。
2(a)相同栽培植物的新鮮剪枝分成葉和小莖，其中每一種栽培植物一部分葉(10g)按例1提取并分析，結(jié)果示于表2(a)。每種栽培植物的另一部分葉可在室溫下干燥直至觀察不到進(jìn)一步的重量損失為止。干葉樣品在Wiley研磨機(jī)中磨細(xì)，其中10g按例1提取后分析，結(jié)果示于表2(a)。
2(b)另一方面，T.X media‘Dark Green Spreader’剪枝室溫下未處理(即葉莖未分開(kāi))干燥直至觀察不到進(jìn)一步的重量損失為止。然后將干葉從莖上摘下，在Wiley研磨機(jī)中磨細(xì)，其中10g按例1提取并分析，結(jié)果示于表2(b)。
表2(b)數(shù)據(jù)是用植物大樣品的10個(gè)再生樣品分析得到的。2(b)法中得到131%紅豆杉醇保持率，而2(a)法中僅得到平均33%紅豆杉醇保持率，證明2(b)中可再生。出人意料的是，剪枝保持不處理狀態(tài)的辦法進(jìn)行干燥與葉從莖上摘取后干燥并用乙醇浸取法相比，可提高紅豆杉醇回收率。與葉摘取后干燥的辦法相比，剪枝未處理狀態(tài)下干燥可使紅豆杉醇保持率提高近4倍。
例3 測(cè)定新鮮莖和剪取干莖的紅豆杉醇含量分析某些栽培植物剪枝新鮮莖(100g)的%紅豆杉醇含量并與例2(a)中所述干燥和研磨莖(10g)中%紅豆杉醇含量比較。新鮮和研磨莖均按例1提取并分析，結(jié)果示于表3。計(jì)算%紅豆杉醇按例2說(shuō)明得到，而且實(shí)例測(cè)干燥%紅豆杉醇含量與計(jì)算干燥%紅豆杉醇含量之比(F/C)也按例2說(shuō)明得到。
實(shí)施例4(a)測(cè)定在谷倉(cāng)中干燥的非剝離的剪枝的葉中紅豆杉醇含量將新鮮完整的T.X media“Densiformis”(表4(A))和T.X media“Dark Green Spreader”(表4(B))剪枝(莖和葉)置于附著在木框上的鋁絲布上(18×16英寸，0.010標(biāo)準(zhǔn)尺寸窗紗)。將木框放在干燥谷倉(cāng)中高出地面30″的支撐物上。無(wú)需加熱，使植物材料在暗處干燥。用風(fēng)扇提供氣流。所用的干燥器是“Roanoke”式7，5-1-G型Bulk Curing Barn(Gregory Manufacturing Compang，Inc.，Lewistown，Woodville，NC27849)。溫度的變化范圍是上午8∶0030℃到下午3∶30 40℃。一共干燥2天。據(jù)測(cè)定干燥前葉子含水量為64.5%(T.X media“Densiformis”)和66%(T.X media“Dark Green Spreader”)(以干燥前后的葉重差為基準(zhǔn))。在分析之前，從莖上剝下干葉(10g)，用Wiley磨粉碎，用乙醇、丙醇或乙酸乙酯滲濾提取。按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行分析。
將干葉的紅豆杉醇含量與同一品種的新鮮葉進(jìn)行比較，新鮮葉是在溶脫后與提取溶劑摻混立即加工處理的。結(jié)果示于表4。按照實(shí)施例2所述的方法確定紅豆杉醇含量的計(jì)算值(折干%)，然后按照實(shí)施例2所述的方法計(jì)算紅豆杉醇含量(折干%)的實(shí)測(cè)值與計(jì)算值之比(F/C)。
(b)測(cè)定在溫室中干燥的非剝離剪枝的葉中紅豆杉醇含量將新鮮完整的T.X media“Densiformis”和T.X media“Dark Green Spreader”的剪枝(莖和葉)置于附著在木框上的鋁絲布(18×16英寸，0.010標(biāo)準(zhǔn)尺寸窗紗)上。木框放在高于地面30″的支撐物上。使植物材料在聚乙烯覆蓋的溫室(長(zhǎng)60′，寬20′，高9′)中干燥，(用一塊遮光布)遮住大約55%光并用兩個(gè)Arvin空氣冷卻器通風(fēng)，只用風(fēng)扇，不向冷卻墊中加水。溫度的變化范圍是上午8∶00 15.5℃到下午3∶30 44℃。一共干燥6天。據(jù)測(cè)定干燥之前葉子含水量為62%(T.X media“Densiformis”)和66%(T.X media“Dark Green Spreader”)(以干燥前后葉重差為基準(zhǔn))。按實(shí)施例4(a)回收和處理干葉，并按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行分析。將結(jié)果與同品種新鮮葉作比較并示于表4。
(c)測(cè)定在陰暗環(huán)境下室外干燥的非剝離剪枝的葉中紅豆杉醇含量將新鮮完整的T.X media“Densiformis”和T.X media“Dark Green Spreader”的剪枝(莖和葉)置于附著在木框上的鋁絲布(18×16英寸，0.010標(biāo)準(zhǔn)尺寸窗紗)上。將木框放在室外陰暗建筑物下高于地面30″的支撐物上。使植物材料在將一塊遮光布置于-2″×6″框架上而構(gòu)建成的距地面7英尺的建筑物下干燥。遮光布使環(huán)境陽(yáng)光減少80%左右。不用風(fēng)扇。溫度的變化范圍是上午8∶00平均22℃到下午3∶00平均36℃。一共干燥10天。根據(jù)干燥前后的葉重差測(cè)得干燥前葉子的含水量為63.3%(T.X media“Densiformis”)和64%(T.X media“Dark Green Spreader”)。按實(shí)施例4(a)回收和處理干葉，并按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行分析。將結(jié)果與同品種的新鮮葉作比較并示于表4。
(d)測(cè)定在室溫下室內(nèi)干燥的非剝離剪枝的葉中紅豆杉醇含量將新鮮完整的T.X media“Densiformis”和T.X media“Dark Green Spreader”的剪枝(莖和葉)置于附著在木框上的鋁絲布(18×16英寸，0.010標(biāo)準(zhǔn)尺寸窗紗)上并按實(shí)施例2(b)所述的方法干燥。根據(jù)干燥前后葉重差測(cè)得干燥前葉子含水量為63.3%(T.X media“Densiformis”)和65%(T.X media“Dark Green Spreader”)。按照實(shí)施例4(a)所述的方法回收和處理干葉，并按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行分析。將結(jié)果與同品種的新鮮葉子作比較并示于表4。
實(shí)施例5提取的溶劑將新鮮的T.X media“Hicksii”剪枝剝離成葉子和小莖，然后在實(shí)施例2(a)所述的條件下使之在室溫干燥。為了分析，將一部分干葉(10g)粉碎，然后用實(shí)施例1的方法用幾種有機(jī)溶劑之一滲濾提取(4×100ml)。新鮮葉的含水量為63%。按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行分析。結(jié)果示于表5。
實(shí)施例6提取的方法比較三種提取方法，每種方法都實(shí)驗(yàn)兩次。從T.X media“Hicksii”新鮮的剪枝上剝下葉并在實(shí)施例2(a)所述的條件下使之在室溫干燥。然后將干葉(10g)粉碎并通過(guò)滲濾、在索格利特條件下成通過(guò)搖動(dòng)(攪動(dòng)下浸泡)用丙酮提取。滲濾提取是按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行的。在索格利特條件下提取是用1份(100ml)溶劑進(jìn)行12小時(shí)，接著每隔4小時(shí)更換一次新鮮溶劑，植物材料的每10g樣品在24小時(shí)的提取過(guò)程中總共用400ml溶劑。搖動(dòng)(攪動(dòng)下浸泡)提取是用與在索格利特條件下所述的相同的溶劑更換程序進(jìn)行的。然后按照實(shí)施例1所述的方法處理和分析提取物。合并得自滲濾提取法的提取物并進(jìn)行分析;在提取過(guò)程的每一步都分析得自其它兩種提取法的提取物。結(jié)果示于表6。
實(shí)施例7第一殘余物在水與二氯甲烷中的分配按照實(shí)施例4(a)所述的方法，將T.X media“Nigra”的新鮮剪枝在成批煙草處理倉(cāng)中干燥。用Wiley磨將一部分剪枝研碎，然后用一種選自乙醇、丙酮和乙酸乙酯的溶劑，按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行滲濾提取。將另一部分剪枝分離成葉和莖，并分別用Wiley磨將這兩部分研碎，然后用一種選自乙醇，丙酮和乙酸乙酯的溶劑，按實(shí)施例1所述的方法滲濾提取每一研碎的部分。
(a)乙醇提取物的第一殘余物在水與二氯甲烷中的分配將已知重量的乙醇提取物的殘余物在水(1ml)和二氯甲烷(2ml×5)之間進(jìn)行分配。然后制備二氯甲烷相并按實(shí)施例1所述的方法用HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果示于表7a。
(b)丙酮提取物的第一殘余物在水與二氯甲烷中的分配將已知重量的丙酮提取物的殘余物在水(1ml)和二氯甲烷(2ml×5)之間進(jìn)行分配。然后制備二氯甲烷相并按實(shí)施例1所述的方法用HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果示于表7b。
(c)乙酸乙酯提取物的第一殘余物在水與二氯甲烷之間的分配將已知重量的乙酸乙酯提取物的第一殘余物在水(1ml)和二氯甲烷(2ml×5)之間進(jìn)行分配。然后制備二氯甲烷相并按實(shí)施例1所述的方法用HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果示于表7c。
實(shí)施例8第一殘余物在水和乙酸乙酯之間的分配，隨后在己烷和含水混合物之間的第二殘余物分配按照實(shí)施例4(a)所述的方法，將T.X media“Nigra”的新鮮完整的剪枝在成批煙草處理倉(cāng)中干燥。用Wiley磨將一部分剪枝研碎，然后用一種選自乙醇、丙酮和乙酸乙酯的溶劑，按實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行滲濾提取。將另一部分剪枝分離成葉和莖，并分別用Wiley磨將這兩部分研碎。然后用選自乙醇，丙酮和乙酸乙酯的溶劑，按實(shí)施例1所述的方法滲濾提取每一研碎的部分。
(a)乙醇提取物的第一殘余物在水和乙酸乙酯之間的分配，隨后第二殘余物在己烷和含水混合物(甲醇∶水)之間的分配將已知量的乙醇提取物的殘余物在水(1ml)和乙酸乙酯(2ml×6)之間進(jìn)行分配。蒸發(fā)乙酸乙酯相，然后使第二殘余物在2份己烷和1份甲醇∶水(9∶1)之間分配。真空蒸發(fā)甲醇∶水相至干。通過(guò)聲波處理使殘余物溶于1ml甲醇(HPLC級(jí))并用一支1ml的注射器抽取溶液，通過(guò)一Millex過(guò)濾裝置(0.45u)濾到Wheaton小瓶中，并蓋上。然后如實(shí)施例1所述進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果示于表8a。
(b)丙酮提取物的第一殘余物在水和乙酸乙酯之間的分配，隨后第二殘余物在己烷和含水混合物(甲醇∶水)之間的分配將已知重量的丙酮提取物的殘余物在水(1ml)和乙酸乙酯(2ml×6)之間進(jìn)行分配。蒸發(fā)乙酸乙酯相，然后使第二殘余物在2份己烷和1份甲醇∶水(9∶1)之間分配。真空蒸發(fā)甲醇∶水相至干。通過(guò)聲波處理使殘余物溶于1ml甲醇(HPLC級(jí))并用一支1ml的注射器抽取溶液，通過(guò)一個(gè)Millex過(guò)濾裝置(0.45u)濾到Wheaton小瓶中，并蓋上。然后如實(shí)施例1所述進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果示于表8b。
(C)乙酸乙酯提取物的第一殘余物在水和乙酸乙酯之間的分配，隨后第二殘余物在己烷和含水混合物(甲醇∶水)之間的分配將已知重量的乙酸乙酯提取物的第一殘余物在水(1ml)和乙酸乙酯(2ml×6)之間進(jìn)行分配。蒸發(fā)乙酸乙酯相，然后使第二殘余物在2份己烷和1份甲醇∶水(9∶1)之間分配。真空蒸發(fā)甲醇∶水相至干。通過(guò)聲波處理使殘余物溶于1ml甲醇(HPLC級(jí))，用1ml的注射器抽取該溶液，通過(guò)Millex過(guò)濾裝置(0.45u)濾到Wheaton小瓶中，并蓋上。然后如實(shí)施例1所述進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果示于表8c。
比較表7和表8，可以看出經(jīng)分配進(jìn)行純化與用硅藻土進(jìn)行純化的較昂貴(在材料和人力方面)的方法相比，紅豆杉醇的產(chǎn)率是類似的。
實(shí)施例9用乙酸乙酯代替二氯甲烷洗脫硅藻土柱將T.X media“Hicksii”的新鮮剪枝分離成葉和莖并使之在室溫下干燥直到觀察不到進(jìn)一步的重量損失。然后用Wiley磨研碎干葉并用丙酮進(jìn)行滲濾提取。用10g葉一式兩份進(jìn)行分析。除用乙酸乙酯代替二氯甲烷之外，如實(shí)施例7(b)所述處理和分析丙酮提取物。結(jié)果示于表9。
實(shí)施例10(a)在用丙酮滲濾提取之前植物材料的脫脂用實(shí)施例9所述的方法干燥和研碎T.X media“Hicksii”葉子樣品，用己烷滲濾2天脫去干燥，研碎葉子的脂肪，每24小時(shí)換一次溶劑(2×100ml)。將合并的己烷提取物蒸發(fā)至干(殘余物平均重200mg，相當(dāng)于總己烷和丙酮提取物的21%)，將剩下的殘?jiān)哭D(zhuǎn)移到一250ml錐形瓶中并用丙酮滲濾提取4天，每24小時(shí)換一次溶劑(4×100ml)。將合并的丙酮提取物蒸發(fā)至干。使已知重量的丙酮?dú)堄辔镌谒?1ml)和二氯甲烷(2ml×5)之間分配。真空蒸發(fā)二氯甲烷相至干并將殘余物在甲醇(1ml)中再生。按照實(shí)施例1所述的方法，通過(guò)一Millex過(guò)濾裝置過(guò)濾甲醇溶液，用甲醇以1∶1進(jìn)行稀釋并用于HPLC分析，結(jié)果示于表10。
(b)在用丙酮攪動(dòng)浸泡(搖動(dòng))提取之前植物材料的脫脂將如(a)所述，干燥、研碎的葉子(10g)用己烷經(jīng)攪動(dòng)浸泡8小時(shí)脫脂，每4小時(shí)換一次溶劑(100ml×2)。平均己烷提取物為194mg或總己烷和丙酮提取物的12%。將殘?jiān)哭D(zhuǎn)移到一250ml錐形瓶中并用丙酮提取(4×100ml)，攪動(dòng)浸泡24小時(shí)，在12，16，20和24小時(shí)更換溶劑。合并在各時(shí)刻收集的提取物，真空蒸發(fā)至干并使已知量的所得殘余物在水(1ml)和二氯甲烷(2ml×5)之間分配。將二氯甲烷相蒸發(fā)至干并將殘余物在甲醇(1ml)中再生。通過(guò)Millex過(guò)濾裝置過(guò)濾甲醇溶液，用甲醇以1∶1進(jìn)行稀釋并用于HPLC分析。結(jié)果示于表10。
(c)在用丙酮進(jìn)行索格利特提取之前植物材料的脫脂將如(a)所述，干燥、研碎的葉子(10g)用乙烷通過(guò)索格利特提取8小時(shí)進(jìn)行脫脂，每4小時(shí)更換一次溶劑(100ml×2)。平均己烷提取物為297mg或總己烷和丙酮提取物的26%。按照實(shí)施例6所述的方法用丙酮進(jìn)一步提取索格利特提取的殘余物(4×100ml)。如實(shí)施例10(b)所述提取、分配和分析，結(jié)果示于表10。
實(shí)施例11脫脂植物材料的丙酮提取物在水和乙酸乙酯之間的分配用實(shí)施例9所述的方法干燥和研碎T.X media“Hicksii”葉子樣品。用實(shí)施例10(a)所述的方法，將干燥、研碎的葉子(10g)用己烷脫脂并用丙酮滲濾提取。使已知重量的丙酮?dú)堄辔镌谒?1ml)和乙酸乙酯(2ml×5)之間分配。真空蒸發(fā)乙酸乙酯相至干并將殘余物在甲醇(1ml)中再生。如實(shí)施例10(a)所述過(guò)濾、稀釋并分析甲醇溶液。結(jié)果示于表11。
實(shí)施例12用固相后處理測(cè)定T.X media“Nigra”中塔三烷濃度從T.X media“Nigra”(Rhode Isand Nurseries，Newport，Rhode Island)莖上剝下新鮮葉子，以下的試驗(yàn)程序重復(fù)進(jìn)行三次。將剝下的新鮮葉子(10g)與100ml95%乙醇一起放入Waring混合器中把葉子浸軟。研磨葉子2分鐘。
將研碎的葉子和乙醇定量轉(zhuǎn)移到一250ml錐形瓶中并浸泡葉子24小時(shí)。沖洗過(guò)濾乙醇(25ml乙醇，并將研碎的葉子再放入錐形瓶中，向錐形瓶中加入另100ml體積的85%乙醇。重復(fù)這一程序3次以上直到獲得500ml體積的乙醇提取物。
在不超過(guò)40℃的溫度下真空蒸發(fā)乙醇提取物至干留下殘余物(“第一殘余物”)。該殘余物的重量為1.47g±0.59(C.V＝4%)。
將約100mg第一殘余物轉(zhuǎn)移到4ml螺旋蓋小瓶中。小瓶蓋襯有鋁箔以防在隨后的分配步驟期間小瓶蓋與殘余物接觸。
使第一殘余物在約1ml水和約5份2ml體積的二氯甲烷之間分配。然后將二氯甲烷轉(zhuǎn)移到一個(gè)25ml的錐形瓶中并真空蒸發(fā)溶劑以形成第二殘余物。
然后將來(lái)自二氯甲烷層的殘余物溶于約5ml乙酸乙酯和約2ml甲醇。為了幫助殘余物溶解，聲波處理錐形瓶。當(dāng)殘余物完全溶解時(shí)，加入約650mg硅藻土。通過(guò)使溶劑在減壓下蒸發(fā)使殘余物附著于硅藻土上以生成一種涂覆硅藻土材料。
將涂覆硅藻土轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行研制直到獲得一種自由流動(dòng)的粉末。然后用研制過(guò)的粉末裝填巴斯德吸移管。
通過(guò)柱洗滌己烷直到洗脫液呈無(wú)色(7ml)。然后用二氯甲烷(5-6ml)洗脫塔三烷。真空蒸發(fā)二氯甲烷以生成粗塔三烷混合物。該混合物的重量為39.1mg±7.43(C.V＝19%)。
將粗塔三烷溶于1mlHPLC級(jí)的甲醇。用聲波處理以幫助粗塔三烷溶解。通過(guò)Millex過(guò)濾裝置(0.45u)過(guò)濾溶液并用燒瓶收集之。
用HPLC分析10g樣品測(cè)得特定塔三烷在溶液中的特性和含量。一個(gè)u Bondapak C-18(10u)柱(得自Waters Associates)被用于MPLC分析。
甲醇(65%)和水(35%)混合物(流速1.2ml/分鐘)用作流動(dòng)相。用設(shè)置在227nm波長(zhǎng)處的紫外檢測(cè)儀檢測(cè)塔三烷。
該溶液的保留時(shí)間和百分組成示于下表12。
表12、從T.X media“Nlgra”分離的特定塔三烷的Rt值和百分組成塔三烷 Rt值(分鐘) %組成紅豆杉醇 11.5 0.291Cephalomannine 10.5 -漿果赤霉素Ⅲ 4.7 -10-去乙酰紅豆杉醇 - -10-去乙酰Cephalomannine - -10-去乙酰漿果赤霉素Ⅲ 4.2 -
實(shí)施例13按照實(shí)施例12的方法得自谷倉(cāng)干燥的葉提取物的紅豆杉醇百分化將仍附著于莖上的T.X media“Nigra”葉的新鮮完整的剪枝置于附著在木框上的鋁絲布(18×16英寸，0.10標(biāo)準(zhǔn)尺寸的窗紗)上，內(nèi)有一“Roanoak”式干燥倉(cāng)，得自Gregory Manufacturing Conpany，Inc.of Woodville，North Carolina的7.5-1-G型Bulk Curmg Barn。將木框放在離地面30英寸的支撐物上。將植物材料在通風(fēng)倉(cāng)暗處干燥。
在干燥步驟期間，溫度的變化范圍是上午8∶00約30℃到下午3∶30約40℃。連續(xù)干燥2天。按照實(shí)施例12中所述的方法分析剪枝中塔三烷含量。檢測(cè)出下列塔三烷紅豆杉醇;Cephalomannine;漿果赤霉素Ⅲ;10-去乙酰紅豆杉醇;10-去乙酰Cephalomannine; ，10-去乙酰漿果赤霉素Ⅲ。存在于組合物中的百分紅豆杉醇為0.0034。
實(shí)施例14用固相后處理從T.X media“Dark Green Spreader”葉中分離紅豆杉醇按照實(shí)施例2(a)所述的方法將T.X media“Dark Green Spreader”的新鮮剪枝分離成葉子和小莖，然后使之在室溫下干燥。用Wiley磨將干葉(500g，用實(shí)施例1所述的方法測(cè)得紅豆杉醇含量為0.0074%)研磨成大約60篩目大小并用95%乙醇滲濾提取之，每24小時(shí)換一次溶劑(1.5L×5)。在Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于不超過(guò)約40℃的溫度下，減壓蒸發(fā)合并的乙醇提取物。
使乙醇?xì)堄辔?112g，殘余物A)在水(約500ml)和下列體積的二氯甲烷之間分配1體積約1升，3體積約500ml。分離二氯甲烷層，合并、用無(wú)水硫酸鈉干燥。利用真空過(guò)濾從二氯甲烷中除去干燥劑。用Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)二氯甲烷溶劑，得到第二殘余物(27.8g，殘余物B)。
將第二殘余物(27.8g)溶于乙酸乙酯/甲醇混合物(3∶1，600ml)并將得到的溶液分成兩份，每份300ml。如實(shí)施例1所述使每份溶液均勻地涂覆到約200g硅藻土545(Fisher)上。
將用第二殘余物(殘余物B)涂覆的硅藻土裝填到兩個(gè)柱中(每個(gè)柱都是5×32cm)并在加壓條件下相繼用己烷(2.2L)和二氯甲烷(1.2L)洗滌。真空蒸發(fā)己烷和二氯甲烷洗液，得到重量分別為19.25g(殘余物C)和6.35g(殘余物D)的合并殘余物。
按照實(shí)施例1所述的方法，將包括粗塔三烷混合物的殘余物D(6.35g)溶于250ml乙酸乙酯并吸附于硅藻土(50g)上。將得到的材料施加到硅膠60閃式柱(160g，5×16cm，230-400目，E.Merck，1柱體積＝500ml)上，流動(dòng)相為己烷/丙酮(75∶25)。通過(guò)以5%的增量提高丙酮的百分比使流動(dòng)相的極性逐漸增加到己烷/丙酮(55∶45)。在加壓條件下，以100ml/5分鐘的流速收集各部分。柱的洗脫如下進(jìn)行用一柱體積的己烷/丙酮(75∶25)洗脫，500ml餾分為一份進(jìn)行收集，然后以4份，每份250ml收集2柱體積己烷/丙酮(70∶30)，以4份，每份250ml收集2柱體積己烷/丙酮(65∶35)，以2份，每份250ml收集1柱體積己烷/丙酮(60∶40)，以10份，每份50ml收集1柱體積己烷/丙酮(55∶45)。通過(guò)在預(yù)涂硅膠GuV254(Machinery Nagel，Duren)上的薄層層析檢驗(yàn)所收集的餾分。將用己烷/丙酮(60∶40，500ml)和己烷/丙酮(55∶45，150ml)洗脫的餾分合并，真空蒸發(fā)至干(餾分E，0.427g)，在該餾分中，通過(guò)用5%甲醇(在氯仿中)作為展開(kāi)系統(tǒng)和對(duì)甲氧基苯甲醛/硫酸作為顯色劑的薄層層析鑒定出8個(gè)組分。紅豆杉醇-Cephalornannine混合物呈現(xiàn)為一淡藍(lán)灰色斑點(diǎn)，Rf值為0.62。
將餾分E在硅膠60閃式柱上進(jìn)一步分級(jí)分離。將該材料(427mg)溶于1%甲醇/二氯甲烷(2ml)并加到硅膠60柱(55g，2×40cm，230-400目，E.Merck，1柱體積＝120ml)上，流動(dòng)相為1%甲醇/二氯甲烷。在提供8ml/分鐘的流速的低壓下，相繼用1%甲醇/二氯甲烷(2柱體積，收集20份，每份12ml)，1.5%甲醇/二氯甲烷(1柱體積，收集10份，每份12ml)，2%甲醇/二氯甲烷(1柱體積，收集10份，每份12ml)和2.5%甲醇/二氯甲烷(3柱體積，收集74份，每份5ml)洗脫柱。通過(guò)用與上述的展開(kāi)和顯色劑系統(tǒng)的薄層層析監(jiān)測(cè)各餾分。在用2.5%甲醇/二氯甲烷洗脫的餾分78-86中鑒定了紅豆杉醇-Cephalomannine混合物。將這些餾分合并，真空蒸發(fā)至干，得到殘余物(40.35mg，餾分F)。當(dāng)用HPLC檢驗(yàn)這一餾分時(shí)表明紅豆杉醇與Cephalomannine同時(shí)存在。
通過(guò)將餾分F(40.35mg)溶于1ml20%乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶劑混合物并將溶解的餾分F加到硅膠60閃式柱(10g，1×32cm，230-400目，E.Merck，1柱體積＝21ml)上，流動(dòng)相為20%乙酸乙酯/二氯甲烷溶劑混合物。在提供8ml/分鐘的流速的低壓下，相繼用20%乙酸乙酯/二氯甲烷(2柱體積，收集4份，每份11ml)，25%乙酸乙酯/二氯甲烷(1柱體積，收集2份，每份10ml)，30%乙酸乙酯/二氯甲烷(1柱體積，收集5份，每份4ml)，35%乙酸乙酯/二氯甲烷(2柱體積，收集9份，每份4.5ml)，40%乙酸乙酯/二氯甲烷(1柱體積，收集7份，每份3ml)，和45%乙酸乙酯/二氯甲烷(2柱體積，收集20份，每份2ml)洗脫柱。通過(guò)用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶1)作為展開(kāi)溶劑和對(duì)甲氧基苯甲醛/硫酸作為顯色試劑在硅膠GUV254上的薄層層析監(jiān)測(cè)各餾分。如通過(guò)HPLC分析所測(cè)定的，在用45%乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫的餾分35-50中，得到了純的紅豆杉醇(26mg)。
實(shí)施例15用分配后處理步驟從T.X media“Nigra”葉中分離紅豆杉醇如實(shí)施例4(a)所述在谷倉(cāng)中干燥T.X media“Nigra”的完整剪枝。用Wiley磨將得自谷倉(cāng)干燥的完整剪枝(500g，按實(shí)施例1的方法測(cè)得紅豆杉醇含量為0.043%(干重))研磨成約60篩目大小并用95%乙醇(8L)滲濾處理。在Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在不超過(guò)40℃的溫度下減壓蒸發(fā)合并的乙醇提取物至干。
使乙醇?xì)堄辔?134.4g，第一殘余物，殘余物A)在水(約600ml)和下列體積的乙酸乙酯之間分配2體積約1.2L，和3體積約600ml。將乙酸乙酯層分離、合并，用無(wú)水硫酸鈉干燥。利用真空過(guò)濾從乙酸乙酯中除去干燥劑。用Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)乙酸乙酯溶劑，得到第二殘余物(44g，殘余物B)。
使殘余物B在約1份水，9份甲醇(500ml)的雙相混合物和2體積己烷(1000ml)之間分配。隨后，用相反的溶劑(100ml×5)洗滌各相并將洗液與它們各自的相合并。將合并的己烷層蒸發(fā)而干，得到殘余物(17.7g，殘余物C)，真空蒸發(fā)合并的水/甲醇層，得到粗塔三烷混合物的殘余物(31.1g，殘余物D)。
用二氯甲烷(300ml×4)聲波洗滌殘余物D(31.1g)。合并二氯甲烷洗液，真空蒸發(fā)，得到殘余物D的二氯甲烷可溶部分(17.3g，殘余物E，按實(shí)施例1的方法測(cè)得紅豆杉醇含量為167mg)。殘余物D的二氯甲烷不溶部分重量為13.8g，按實(shí)施例1的方法測(cè)得其紅豆杉醇含量為20mg。
將殘余物E(17.3g)溶于250ml乙酸乙酯并吸附于硅藻土(30g)上。將得到的材料加到硅膠60閃式柱(315g，5×32cm，230-400目，E.Merck，1柱體積＝600ml)上，流動(dòng)相為己烷/丙酮(70∶30)。通過(guò)以5%的增量提高丙酮含量使流動(dòng)相的極性逐漸增加到己烷/丙酮(45∶55)，然后用100%丙酮洗脫柱。在壓力條件下，以100ml/5分鐘的流速收集各餾分。柱的洗脫如下進(jìn)行以8份300ml，100ml，125ml，200ml，160ml，190ml和210ml收集2柱體積己烷/丙酮(70∶30)，然后以2份175ml和300ml收集1柱體積己烷/丙酮(65∶35)，以1份500ml收集1柱體積己烷/丙酮(60∶40)，以7份，每份100ml收集1柱體積己烷/丙酮(50∶50)，以6份，每份100ml收集1柱體積己烷/丙酮(45∶55)，和以4份，每份450ml收集3柱體積100%丙酮。通過(guò)用5%甲醇/氯仿作為展開(kāi)系統(tǒng)和對(duì)甲氧基苯甲醛/硫酸作為顯色試劑的在預(yù)涂硅膠GUV254(Machery Nagel，Duren)上的薄層層析檢驗(yàn)收集的餾分。
將用己烷/丙酮(55∶45，100ml)和己烷/丙酮(50∶50，450ml)洗脫的餾分合并，真空蒸發(fā)至干(餾分F，1.61g)。
在該餾分中，用5%甲醇/氯仿作為展開(kāi)系統(tǒng)和對(duì)甲氧基苯甲醛/硫酸作為顯色劑鑒定出8個(gè)組分。紅豆杉醇-Cephalomannine混合物呈現(xiàn)為一淡藍(lán)灰色斑點(diǎn)，Rf值為0.62。
盡管我們?cè)谏衔闹幸衙枋隽嗽S多本發(fā)明的實(shí)施方案，但顯然可改變基本結(jié)構(gòu)以提供可利用本發(fā)明方法的其它實(shí)施方案。因此，應(yīng)明確的是本發(fā)明是由待批權(quán)利要求所限定，而不是由上文中以實(shí)施例方式給出的具體實(shí)施方案所限定。
權(quán)利要求
1.由植物制取塔三烷的方法，該方法包括提供來(lái)自觀賞紫杉植物的一或多個(gè)栽培品種的植物可再生源，其中所述植物處于未受損的削剪形式，并且適量的葉與莖相接，用一或多種溶劑處理該植物以得富塔三烷產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中植物的可再生源是紫杉屬的栽培品種，該品種選自T.X media‘Henryi’，T.X media‘Densiformis’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，T.X media‘Runyan’，T.X media Brownii’，T.X media‘Wardii’，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Fairview’，T.cuspidata‘Brevifolia’，T.cuspidata，and T.cuspidata‘Spreader’.
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中植物的可再生源是紫杉屬的栽培品種，該品種選自T.X media‘Densiformis’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，T.X media‘Runyan’，T.X media‘Brownii’，T.X media‘Wardii’，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.cuspidata‘Brevifolia’，and T.cuspidata.
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中植物的可再生源是紫杉屬的栽培品種，該品種選自T.cuspidata，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Tauntonii’;T.X media‘Nigra’，T.X media‘Dark Green Spreader’，and T.X media‘Hicksii’.
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中植物在用溶劑處理前先進(jìn)行干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中干燥步驟不能在無(wú)礙的直射陽(yáng)光照射下進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中植物在溶劑處理前先碾碎。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)行溶劑處理的植物保留了大部其原揮發(fā)成份。
9.通過(guò)提供來(lái)自觀賞紫杉植物的一或多個(gè)栽培品種的植物可再生源制備富塔三烷組合物，其中所述植物處于未受損的削剪形式，并且適量葉與莖相接，用一或多種溶劑處理該植物得到所述的富塔三烷產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中植物可再生源是紫杉屬的一個(gè)栽培品種，其選自T.X media‘Henryi’，T.X media‘Densiformis’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，T.X media‘Runyan’，T.X media Brownii’，T.X media‘Wardii’，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Fairview’，T.cuspidata‘Brevifolia’，T.cuspidata，and T.cuspidata‘Spreader’.
11.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中植物可再生源是紫杉屬的一個(gè)栽培品種，其選自T.X media‘Densiformis’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，T.X media‘Runyan’，T.X media Brownii’，T.X media‘Wardii’，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.cuspidata‘Brevifolia’，and T.cuspidata.
12.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中植物可再生源是紫杉屬的一個(gè)栽培品種，其選自T.cuspidata，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Dark Green Spreader’，and T.X media‘Hicksii’.
13.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中植物在溶劑處理前先碾碎。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中進(jìn)行溶劑處理的植物保留了大部分其原揮發(fā)成份。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中植物在溶劑處理前先干燥。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中干燥不是在無(wú)礙直射陽(yáng)光下進(jìn)行的。
17.制備植物原料的方法，該原料可用作塔三烷源，該方法包括提供無(wú)受損的剪切物，其中適量葉與含塔三烷的植物莖相連，干燥該未受損剪切物以降低其揮發(fā)成份，生成干燥的剪切物，回收所述干燥的剪切物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中干燥步驟在低于70℃下進(jìn)行。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中干燥步驟在約70℃下進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中干燥步驟不能在無(wú)礙直射線下進(jìn)行。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中在干燥期間約40%至約80%可見(jiàn)光被阻止照到植物上。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中在干燥期間，植物的重量至少降低25%。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中干燥植物直到在干燥期間植物重量的丟失在約40%至約70%之間。
24.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中植物選自觀賞紫杉植物的一或多個(gè)栽培品種。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中植物選自一或多個(gè)紫杉種類，紫杉種類選自T.X media‘Henryi’，T.X media‘Densiformis’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，T.X media‘Runyan’，T.X media Brownii’，T.X media‘Wardii’，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Fairview’，T.cuspidata‘Brevifolia’，T.cuspidata，and T.cuspidata‘Spreader’.
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中植物選自一或多個(gè)紫杉種類，紫杉種類選自T.cuspidata，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，and T.X media‘Hicksii’.
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中植物在低約70℃下干燥，干燥不能在無(wú)礙直射光線下進(jìn)行。
28.可用作塔三烷源的植物原料，所述原料按下面方法制備，該方法包括提供未受損的剪切物，其中適量的葉子與含塔三烷的植物的莖相連，干燥未受損的剪切物以降低揮發(fā)含量，生成干燥的剪切物，回收該干燥的剪切物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的植物原料，其中干燥步驟是在低于約70℃下進(jìn)行的。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的植物原料，其中干燥步驟是在約20℃至65℃進(jìn)行的。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的植物原料，其中干燥步驟不能在無(wú)礙的直射光線下進(jìn)行。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的植物原料，其中在干燥步驟期間，約40%至約80%可見(jiàn)光被阻止照到植物上。
33.根據(jù)權(quán)利要求28的植物原料，其中在干燥步驟期間得到至少降低25%重量的植物。
34.根據(jù)權(quán)利要求28的植物原料，其中干燥植物直到在干燥步驟期間得到重量丟失約40%至約70%的植物。
35.根據(jù)權(quán)利要求28的植物原料，其中植物來(lái)自一或多種栽培的觀賞紫杉。
36.根據(jù)權(quán)利要求28的植物原料，其中植物選自一或多個(gè)紫杉種，紫杉種選自T.X media‘Henryi’，T.X media‘Densiformis’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，T.X media‘Runyan’，T.X media Brownii’，T.X media‘Wardii’，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Fairview’，T.cuspidata‘Brevifolia’，T.cuspidata，and T.cuspidata‘Spreader’.
37.根據(jù)權(quán)利要求36的植物原料，其中植物選自T.cuspidata，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，and T.X media‘Hicksii’.
38.根據(jù)權(quán)利要求37的植物原料，其中植物在低于70℃下干燥，并且干燥不是在無(wú)礙直射光線下進(jìn)行的。
39.由含塔三烷植物制取粗塔三烷混合物的方法，該方法包括初始溶劑處理包括下面步驟A.通過(guò)將植物與有機(jī)溶劑接觸，從植物中提取塔三烷，得到無(wú)溶劑的富塔三烷的第一殘?jiān)?B.在能溶解塔三烷的有機(jī)溶劑和不溶解顯著量塔三烷的水性溶劑之間分配第一殘?jiān)?，從而產(chǎn)生出有機(jī)相和水相;C.將有機(jī)相和水相分開(kāi)，回收基本上無(wú)水相的有機(jī)相;D.由第二有機(jī)相形成第二殘?jiān)?將第二殘?jiān)眠x自下面二者之一的方式進(jìn)行處理E.將第二殘?jiān)苡谌軇?，該溶劑可使塔三烷可逆地附到固體支持物上，將固體支持物加到該溶劑中，其中包括溶第二殘?jiān)?，并使第二殘?jiān)兴楦降剿龉腆w支持物上，將所述固體支持物與溶劑分開(kāi)，隨后將帶有所附塔三烷的固體支持物與具有不同塔三烷洗脫性質(zhì)的一系列溶劑接觸，和由固體支持物洗脫下的富塔三烷餾分作為粗塔三烷混合物，或F.在水性混合物和非極性不能溶和的有機(jī)溶劑間分離第二殘?jiān)?，其中水性混合物包括單相水和與水混溶的極性有機(jī)溶劑，極性有機(jī)溶劑在所述混合物中以使存在于第二殘?jiān)兴檫M(jìn)入水性混合物的足夠量存在，和從第二水性混合物中回收粗塔三烷混合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中任何A，B，C，D，E或F步驟都重復(fù)一或多次。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中步驟A中植物與有機(jī)溶劑接觸，有機(jī)溶劑選自乙醇，丙酮，乙酸乙酯，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，甲乙酮，甲基異丁基酮，甲基叔丁醚，甲醇或它們的混合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中步驟A中植物與有機(jī)溶劑接觸，有機(jī)溶劑選自丙酮，乙醇和乙酸乙酯。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中步驟A中植物與乙醇接觸。
44.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中步驟A中植物與溶劑的接觸是由選自下面的方法加速的浸漬，滲濾，索格利特萃取，攪拌，或?qū)⑺鼈兘Y(jié)合起來(lái)的方法。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中步驟A中植物與溶劑的接觸是通過(guò)振搖加速的。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中步驟A中植物與溶劑的接觸是通過(guò)浸漬和攪拌有機(jī)溶劑中植物加速的。
47.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中在步驟A中植物與有機(jī)溶劑接觸前，先將植物用選自己烷，己烷混合物，戊烷，石油醚，異辛烷或它們的混合物的溶劑脫脂。
48.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中步驟B的有機(jī)溶劑選自二氯甲烷和乙酸乙酯。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中步驟B的有機(jī)溶劑是乙酸乙酯。
50.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中步驟B的水性溶劑是水。
51.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中步驟C的有機(jī)溶劑用干燥劑處理或隨后將有機(jī)溶劑與水性溶劑分開(kāi)。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中干燥劑選自無(wú)水硫酸鎂，無(wú)水硫酸鈉，4°A分子篩，氯化鈣或它們的混合物，干燥方法包括將有機(jī)溶劑冷卻到水結(jié)冰的溫度或以下，然后將液體有機(jī)溶劑與結(jié)冰的水分開(kāi)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中干燥劑是無(wú)水硫酸鈉。
54.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中植物選自觀賞紫杉種的一或多個(gè)栽培品種。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中植物選自紫杉屬的栽培品種，紫杉屬選自T.X media‘Henryi’，T.X media‘Densiformis’，T.X media‘Hicksii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，T.X media‘Runyan’，T.X media Brownii’，T.X media‘Wardii’，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Fairview’，T.cuspidata‘Brevifolia’，T.cuspidata，and T.cuspidata‘Spreader’.
56.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中在萃取前，要萃取的植物先干燥。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中進(jìn)行干燥的植物是未受損的剪切物，其中大量葉子附在莖上。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中干燥步驟是在低于70℃下進(jìn)行的。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中干燥步驟是在約20℃至約65℃進(jìn)行的。
60.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中干燥步驟不是在無(wú)礙直射光線下進(jìn)行的。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中在干燥步驟中，約40%至80%可見(jiàn)光被阻止照到植物上。
62.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中在干燥步驟中得到重量至少降低25%的植物。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中干燥植物直到在干燥期間得到重量丟失約40%至約70%的植物。
64.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中粗塔三烷混合物包括選自紅豆杉醇，cephalomannine，去乙?；鵦ephalomannine，漿果赤霉素Ⅲ，10-去乙酰基漿果赤霉素Ⅲ和10-去乙?；t豆杉醇。
65.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中第二殘?jiān)M(jìn)行步驟E的處理。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的制取粗塔三烷混合物方法，其中用于溶解步驟D第二殘?jiān)牟襟EE溶劑是乙酸乙酯和甲醇的混合物。
67.根據(jù)權(quán)利要求65的制取粗塔三烷混合物方法，其中用于溶解步驟D第二殘?jiān)牟襟EE溶劑是乙酸乙酯。
68.根據(jù)權(quán)利要求65的制取粗塔三烷混合物方法，其中步驟E中固體支持物是硅藻土。
69.根據(jù)權(quán)利要求65的制取粗塔三烷混合物方法，其中通過(guò)加所述固體支持物到步驟E的溶劑中使塔三烷可逆地附著到固體支持物上，其中第二殘?jiān)驯蝗芙?，使所述溶劑蒸發(fā)，造成所述第二殘?jiān)谐煞莞街剿龉腆w支持物上。
70.根據(jù)權(quán)利要求65的制取粗塔三烷混合物方法，其中已附著第二殘?jiān)某煞莸牟襟EE的固體支持物先用不能從固體支持物上除去大量塔三烷的溶劑洗脫，然后用此第一次洗脫用的溶劑有更大極性的溶劑進(jìn)行第二次洗脫，更大極性的溶劑從固體支持物上洗脫出的富塔三烷餾分作為粗塔三烷混合物。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的制取粗塔三烷混合物的方法，其中用于第一次洗脫的溶劑是己烷。
72.根據(jù)權(quán)利要求70的制取粗塔三烷混合物的方法，其中用于從固體支持物上洗脫塔三烷的溶劑選自乙酸乙酯和二氯甲烷。
73.根據(jù)權(quán)利要求70的制取粗塔三烷混合物的方法，其中用于第一次洗脫的是己烷，用于洗脫塔三烷的是乙酸乙酯。
74.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中第二殘?jiān)M(jìn)行步驟F的處理。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中步驟F的水性混合物包括多于約50%的極性有機(jī)溶劑，其余為水。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中步驟F的水性混合物包括約9份極性有機(jī)溶劑和約1份水。
77.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中步驟F的水性混合物的極性有機(jī)溶劑選自乙腈和甲醇。
78.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中步驟F的水性混合物的極性有機(jī)溶劑是甲醇。
79.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中步驟F水性混合物包括多于約50%甲醇，其余為水。
80.根據(jù)權(quán)利要求79的方法，其中步驟F水性混合物包括約9份甲醇和約1份水。
81.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中步驟F有機(jī)溶劑選自己烷，戊烷，石油醚，庚烷，異辛烷和它們的混合物。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中步驟F有機(jī)溶劑是己烷。
83.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中第二殘?jiān)诎和榈姆菢O性不混溶的有機(jī)溶物與包括甲醇和水的水性混合物間分配。
84.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中第二殘?jiān)隗w積比水性混合物更大的非極性不混溶有機(jī)溶劑與水性混合物間分配。
85.根據(jù)權(quán)利要求84的方法，其中第二殘?jiān)诩s1份第二水性混合物和約2份非極性不混溶有機(jī)溶劑間分開(kāi)。
86.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中粗塔三烷混合物包括選自紅豆杉醇，cephalomannine，去乙?；鵦ephalomannine，漿果赤霉素Ⅲ，10-去乙酰漿果赤霉素Ⅲ和10-去乙酰基紅豆杉醇的塔三烷。
87.按下面的步驟從含塔三烷的植物中制備粗塔三烷混合物，其包括A.通過(guò)將植物與有機(jī)溶劑接觸從植物中提取塔三烷，得到無(wú)溶劑的豐塔三烷的第一殘?jiān)?B.將第一殘?jiān)谀苋芙馑榈挠袡C(jī)溶劑和不能溶解顯著量塔三烷的水性溶劑間分開(kāi)，生成有機(jī)相和水相;C.將有機(jī)相和水相分開(kāi)，回收基本上無(wú)水相的有機(jī)相;D.由第二有機(jī)相產(chǎn)生第二殘?jiān)?選擇下面二種方式之一對(duì)所述有機(jī)相進(jìn)行溶劑處理，E.將第二殘?jiān)茉诳墒顾榭赡娴馗街诠腆w支持物上的溶劑中，將固體支持物加到溶劑中，其包括溶解第二殘?jiān)?，并將第二殘?jiān)乃楦街剿龉腆w支持物上，將所述固體支持物與溶劑分開(kāi)，隨后將覆有塔三烷的固體支持物與具有不同塔三烷洗脫性質(zhì)的一系列溶劑接觸，然后，從固體支持物上洗脫出的富塔三烷餾分作為粗塔三烷混合物，或F.將第二殘?jiān)谒曰旌衔锖头菢O性不混溶有機(jī)溶劑間分配，其中水性混合物包括單相水和與水混溶的極性有機(jī)溶劑，其中極性有機(jī)溶劑在所述混合物中以使第二殘?jiān)兴槟苓M(jìn)入水性混合物的足夠量存在，然后從水性混合物中回收粗塔三烷混合物。
88.根據(jù)權(quán)利要求87的粗塔三烷混合物，其中植物是觀賞紫杉屬的一或多種栽培品種。
89.根據(jù)權(quán)利要求87的粗塔三烷混合物，其中要萃取的植物是未受損的剪切物，其中大量的葉子附著在莖上，并在萃取前先進(jìn)行干燥。
90.根據(jù)權(quán)利要求87的粗塔三烷混合物，其中第二殘?jiān)M(jìn)行步驟E的最終處理。
91.根據(jù)權(quán)利要求87的粗塔三烷混合物，其中第二殘?jiān)M(jìn)行步驟F的處理。
92.根據(jù)權(quán)利要求91的粗塔三烷混合物，其中步驟F的水性混合物包括多于50%的極性有機(jī)溶劑，其余為水。
93.根據(jù)權(quán)利要求92的粗塔三烷混合物，其中步驟F的水性混合物包括約9份極性有機(jī)溶劑和約1份水。
94.根據(jù)權(quán)利要求91的粗塔三烷混合物，其中步驟F水性混合物的極性有機(jī)溶劑選自乙腈和甲醇。
95.根據(jù)權(quán)利要求94的粗塔三烷混合物，其中步驟F中水性混合物的極性有機(jī)溶劑是甲醇。
96.根據(jù)權(quán)利要求91的粗塔三烷混合物，其中步驟F的水性混合物包括多于50%的甲醇，其余為水。
97.根據(jù)權(quán)利要求96的粗塔三烷混合物，其中步驟F的水性混合物包括約9份甲醇和約1份水。
98.根據(jù)權(quán)利要求91的粗塔三烷混合物，其中步驟F的有機(jī)溶劑選自己烷，戊烷，石油醚，庚烷，異辛烷和它們的混合物。
99.根據(jù)權(quán)利要求98的粗塔三烷混合物，其中步驟F的水性混合物的極性有機(jī)溶劑是己烷。
100.根據(jù)權(quán)利要求91的粗塔三烷混合物，其中第二殘?jiān)诤和榈姆菢O性不混合有機(jī)溶劑與含甲醇和水的水性混合物間分配。
101.根據(jù)權(quán)利要求91的粗塔三烷混合物，其中第二殘?jiān)隗w積上比水性混合物大的非極性不混溶有機(jī)溶劑與水性混合物間分配。
102.根據(jù)權(quán)利要求101的粗塔三烷混合物，其中第二殘?jiān)诩s1份第二水性混合物和約2份非極性不混溶有機(jī)溶劑間分配。
103.根據(jù)權(quán)利要求87的粗塔三烷混合物，其中粗塔三烷混合物包括選自紅豆杉醇，Cephalomannine，去乙酰基Cephalomannine，漿果赤霉素Ⅱ，10-去乙酰漿果赤霉素Ⅲ和10-去乙酰紅豆杉醇的塔三烷。
104.分離兩或多個(gè)包括紅豆杉醇和Cephalomannine的塔三烷的方法，其包括下面步驟提供一溶劑中含兩或多個(gè)塔三烷的混合物，該混合物適于將塔三烷栽到正相色譜柱上;將含塔三烷的混合物載到裝有固體支持物的正相色譜柱上，溶劑適用作流動(dòng)相;通過(guò)用具有顯著極性的流動(dòng)相洗脫正相色譜柱來(lái)分離塔三烷，從而分別洗脫出紅豆杉醇和Cephalomannine。
105.根據(jù)權(quán)利要求104的方法，其中流動(dòng)相是乙酸乙酯和二氯甲烷的混合物。
106.根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中塔三烷混合物被載到色譜柱上，在乙酸乙酯與二氯甲烷混合物中乙酸乙酯約為20%。
107.根據(jù)權(quán)利要求104的方法，其中從用約45%乙酸乙酯和約55%二氯甲烷洗脫出的餾分中收集純紅豆杉醇。
108.根據(jù)權(quán)利要求104的方法，其中從用約50%乙酸乙酯和約50%二氯甲烷洗脫出的餾分中收集純Cephalomannine。
109.從含塔三烷植物中制取和分離含紅豆杉醇和Cephalomannine的塔三烷的方法，其包括下面步驟提供未受損的剪切物，其中適量的葉子附著在含塔三烷植物的莖上，干燥未受損的剪切物以降低其揮發(fā)成份含量，從而產(chǎn)生干燥的剪切物，回收所述的干燥剪切物，按下面的步驟從所述的干燥剪切物中提取塔三烷，其包括A.將植物與有機(jī)溶劑接觸，得到無(wú)溶劑的富塔三烷的第一殘?jiān)?B.將第一殘?jiān)谀苋芙馑榈挠袡C(jī)溶劑和不能溶解明顯量塔三烷的水性溶劑間分配，生成有機(jī)相和水相;C.分開(kāi)有機(jī)相和水相，回收基本上無(wú)水相的有機(jī)相;D.由第二有機(jī)相產(chǎn)生第二殘?jiān)?由下面兩方式之一處理所述有機(jī)相E.溶第二殘?jiān)诳墒顾榭赡娓街焦腆w支持物上的溶劑中，加固體支持物到溶劑中，其包括溶解第二殘?jiān)⒌诙堅(jiān)兴楦街焦腆w支持物上，將所述固體支持物與溶劑分開(kāi)，隨后將附有塔三烷的固體支持物與具有不同塔三烷洗脫性質(zhì)的一系列溶劑接觸，然后從固體支持物上洗脫出的富塔三烷餾分作為粗塔三烷混合物，或F.將第二殘?jiān)谒曰旌衔锖头菢O性不混合有機(jī)溶劑間分配，其中水性混合物包括單相水和與水混溶的極性溶劑，極性溶劑在所述混合物中以使存在于第二殘?jiān)械乃檫M(jìn)入水性混合物的足夠量存在，然后，從第二水性混合物中回收粗塔三烷混合物，提供由處理E或F得到的粗塔三烷混合物，所述粗塔三烷混合物包括于溶劑中的兩或多個(gè)塔三烷，該溶劑適于將塔三烷載到己相色譜柱上;將含塔三烷的混合物載到裝有固體支持物的正相色譜柱上，溶劑適用作流動(dòng)相;通過(guò)用具有顯著極性的流動(dòng)相洗脫正相色譜柱來(lái)分離塔三烷，從而分別洗脫出紅豆杉醇和Cephalomannine。
110.根據(jù)權(quán)利要求109的方法，其中干燥是在低于70℃下進(jìn)行的。
111.根據(jù)權(quán)利要求110的方法，其中干燥是在約20℃-約65℃進(jìn)行的。
112.根據(jù)權(quán)利要求109的方法，其中干燥不是在無(wú)礙直射光線下進(jìn)行的。
113.根據(jù)權(quán)利要求112的方法，其中在干燥期間有約40%至約80%可見(jiàn)光線被阻止照到植物上。
114.根據(jù)權(quán)利要求109的方法，其中在干燥期間得到至少降低了25%重量的植物。
115.根據(jù)權(quán)利要求114的方法，其中干燥植物直到在干燥期間得到失重約40%至70%的植物。
116.根據(jù)權(quán)利要求109的方法，其中植物選自T.cuspidata，T.X media‘Halloran’，T.X media‘Hatfield’，T.X media‘Nigra’，T.X media‘Tauntonii’，T.X media‘Dark Green Spreader’，and T.X media‘Hicksii’.
117.根據(jù)權(quán)利要求109的方法，其中第二殘?jiān)M(jìn)行步驟F處理。
118.根據(jù)權(quán)利要求117的方法，其中步驟F的水性混合物包括多于50%的極性有機(jī)溶劑和平衡的水。
119.根據(jù)權(quán)利要求118的方法，其中步驟F的水性混合物包括約9份極性有機(jī)溶劑和約1份水。
120.根據(jù)權(quán)利要求117的方法，其中步驟F中水性混合物的極性有機(jī)溶劑選自乙腈和甲醇。
121.根據(jù)權(quán)利要求120的方法，其中步驟F中水性混合物的極性有機(jī)溶劑是甲醇。
122.根據(jù)權(quán)利要求117的方法，其中步驟F的水性混合物包括多于50%的甲醇，其余為水。
123.根據(jù)權(quán)利要求122的方法，其中步驟F的水性混合物包括約9份甲醇和約1份水。
124.根據(jù)權(quán)利要求117的方法，其中步驟F的有機(jī)溶劑選自己烷，戊烷，石油酸，庚烷，異辛烷和它們的混合物。
125.根據(jù)權(quán)利要求124的方法，其中步驟F的有機(jī)溶劑是己烷。
126.根據(jù)權(quán)利要求117的粗塔三烷混合物，其中第二殘?jiān)诎和榈姆菢O性不混溶有機(jī)溶劑與含甲醇和水的水性混合物間分配。
127.根據(jù)權(quán)利要求117的粗塔三烷混合物，其中第二殘?jiān)隗w積上比水性混合物更大的非極性不混溶的有機(jī)溶劑與水性混合物間分配。
128.根據(jù)權(quán)利要求127的方法，其中第二殘?jiān)诩s1份第二水性混合物和約2份非極性不混溶的有機(jī)溶劑間分配。
129.根據(jù)權(quán)利要求117的方法，其中粗塔三烷混合物包括選自紅豆杉醇，Cephalomannine，去乙酰Cephalomannine漿果赤霉素Ⅲ，10-去乙酰漿果赤霉素Ⅲ和10-去乙酰紅豆杉醇的塔三烷。
130.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中得到并分離出的塔三烷是紅豆杉醇。
131.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中任何步驟A B，C，D，E或F都被重復(fù)一，二，三或四次，
132.根據(jù)權(quán)利要求104的方法，其中任何分離兩或多個(gè)塔三烷的步驟都被重復(fù)一或多次。
133.根據(jù)權(quán)利要求132的方法，其中任何步驟都被重復(fù)一二，三或四次。
全文摘要
本發(fā)明提供了得到含紅豆杉醇的塔三烷的可再生源的方法。本發(fā)明還披露了含塔三烷的組合物，其可用作塔三烷進(jìn)一步純化的原料來(lái)源。更具體講，本發(fā)明披露了干燥植物以保留塔三烷含量并使其萃取變?nèi)菀椎姆椒?。另外，本發(fā)明還披露了用一系列有機(jī)和水性溶劑及正相色譜柱提取和純化來(lái)自觀賞栽培品種的紅豆杉醇和其它塔三烷的方法。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1069965SQ92102718
公開(kāi)日1993年3月17日 申請(qǐng)日期1992年4月18日 優(yōu)先權(quán)日1991年4月19日
發(fā)明者H·N·艾爾索利, M·A·艾爾索利, E·M·克羅穆, J·D·馬克斯尼 申請(qǐng)人:密西西比大學(xué)