專利名稱：脒基苯丙氨酸衍生物，它們的制備方法，它們的應(yīng)用和含有它們的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脒基苯丙氨酸衍生物，它們的制備方法，它們的應(yīng)用和含有這些化合物的藥物組合物。
已知許多病理生理學(xué)狀況會導(dǎo)致血漿中最重要的凝血酶抑制劑-抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)的消耗。AT Ⅲ的減少可異致血栓形成的危險增加也是已知的，特別是從先天性缺乏AT Ⅲ的病例中可以得知。AT Ⅲ減少到低于正常值的75%將導(dǎo)致血栓栓塞并發(fā)癥。這些并發(fā)癥常常在手術(shù)后和在休克狀態(tài)下以彌漫性血管內(nèi)凝血形式出現(xiàn)。在許多病例中，會出現(xiàn)威脅生命的血凝塊。為了治療和預(yù)防血栓形成性疾病，到目前為止已將具有不同作用方式的抗凝血劑用于臨床。為了緊急控制血栓形成的危險，像AT Ⅲ，肝素以及最近開發(fā)的水蛭素等物質(zhì)已被使用。已使用香豆素和2，3-二氫-1，3-茚二酮衍生物進(jìn)行長期預(yù)防。但所說的抗凝血劑在某些情況下受很多不利條件影響。
例如肝素由于它的多糖結(jié)構(gòu)故只能經(jīng)腸胃道外途徑使用，而且它的作用尚須依賴于功能性抗凝血酶Ⅲ的水平。香豆素直接阻礙蛋白質(zhì)的生物合成，這樣便不再能得到足夠的維生素K依賴性凝血因子Ⅱ，Ⅶ，Ⅸ和Ⅹ，因而使凝血潛力降低。由此造成其作用的短暫延緩。已知的副作用有出血性皮膚壞死、惡心及毛發(fā)脫落。
相比之下，低分子量凝血酶抑制劑的優(yōu)點(diǎn)在于它們以不依賴于輔助因子的方式通過直接與活性中心結(jié)合而直接作用于凝血酶。從而暫時封閉酶。由于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些物質(zhì)口服給藥并可立刻發(fā)揮其作用。
基于精氨酸或脒基苯丙氨酸的氨基酸衍生物已受到特殊的關(guān)注。第一組中包括D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-精氨酸醛和(2R，4R)-4-甲基-1-〔N2-(3-甲基-1，2，3，4-四氫-8-喹啉磺酰-L-精氨?！?4-哌啶羧酸-水合物(“MD805”)等化合物。MD805是一種已在治療上使用的特異競爭性凝血酶抑制劑。另一種已知的脒基苯丙氨酸衍生物是β-萘磺酰-甘氨酰-R，S-4-脒基苯丙氨酰哌啶(NAPAP)。EP0，236，163和EP0，236，164中描述了NAPAP衍生物。在這些衍生物中，甘氨酸被一個結(jié)構(gòu)為NH2-CHR1-COOH的氨基酸所取代，其中R1是低級烷基，低級羥烷基，苯基或4-羥基苯基。4-脒基苯丙氨酸(Aph)可被N-甲基化，得到N-甲基-Aph。另外，描述了在芳磺?；?、“橋接”甘氨酸和哌啶環(huán)上NAPAP的各種衍生作用。因此，最合適的是N-末端上為α-或β-萘磺?；?，而相反雜芳磺?；?-喹啉磺?；圈?或β-萘磺?；顢?shù)十倍。天然氨基酸作為疏水性萘基與Aph之間的橋接成員的缺點(diǎn)是連接Aph的酰胺鍵可受酶的作用而斷裂。這個缺點(diǎn)在口服給藥情況下特別有影響。然而，用另一種橋接成員如β-丙氨酸代替甘氨酸會異致凝血酶抑制活性的明顯喪失。即使是用亞氨基酸如脯氨酸進(jìn)行取代也會使其作用喪失。
因此，本發(fā)明的目的是提供基于脒基苯丙氨酸的新化合物，它們在抗血栓形成活性上優(yōu)于已知的化合物，同時對酶促裂群作用具有高度抗性，從而提高了可耐受性。
本發(fā)明涉及下示通式Ⅰ的化合物
其中R′是可被1-3個至多含有3個碳原子的烷氧基或被至多5個含有1-2個碳原子的烷基衍化的萘基或苯基，或可被至多5個甲基衍化的苯并二氫呋喃基，R1是氫、至多有4個碳原子的低級烷基、羥烷基、至多有7個碳原子的芳烷基或至多有4個碳原子的羧烷基，R2和R3相同或不同，各自代表至多有4個碳原子的烷基、R2和R3與氮原子一起可形成一個環(huán)，該環(huán)可被至多有3個碳原子的羧基、羥基或羥烷基基團(tuán)衍化，＊以R或S構(gòu)型存在，但最好以R構(gòu)型存在。
與已知結(jié)構(gòu)的實(shí)質(zhì)性區(qū)別在于與其R鍵合的原子是氮原子，而不是碳原子。
NAPAP具有下列結(jié)構(gòu)
令人驚奇的是，用氮雜氨基酸殘基代替NAPAP中的甘氨酸可能大大增強(qiáng)抗血栓形成活性。氮雜氨基酸殘基是可由下式表示的已知化合物
氮雜氨基酸的結(jié)構(gòu)要素可形成如上述式Ⅰ所代表的結(jié)構(gòu)。
令人驚奇的是，β-萘磺酰氮雜甘氨酰-D-脒基苯丙氨酰-哌啶的活性超過甘氨酸化合物的活性達(dá)5倍。氮雜氨基酸與式Ⅰ中的疏水殘基R′結(jié)合可生成KI和IC50值在微微摩爾范圍內(nèi)的化合物。而且，含有氮雜氨基酸的化合物顯示出對酶促降解作用的抗性，因此本發(fā)明的化合物特征在于除了作用顯著增強(qiáng)以外還提高了穩(wěn)定性。
本發(fā)明的化合物可用已知的方法制備，例如在Houben-Weyl，“Methoden der organischen chemie”(Methods of Organic Chemistry)，Volume 15(1+2)，Georg Thieme Verlag Stuttgart，1974，by Erich Wiinsch或在Pharmazie 39，228(1984)中所述的方法。
最好首先使Boc-氰基苯丙氨基與“胺成分”偶聯(lián)。所用的胺成分最好是環(huán)狀胺例如哌啶，甲基哌啶或羥甲基哌啶。用普通的標(biāo)準(zhǔn)方法形成肽鍵，最好在羥苯并三唑存在下，在二甲基甲酰胺或類似溶劑中與碳化二亞胺反應(yīng)。分離N-α-保護(hù)的化合物后，通過酸解脫去保護(hù)基，在此情況下是借助酸解作用脫去Boc基團(tuán)。為此，最好用三氟乙酸，并根據(jù)需要可在溶劑如二氯甲烷中或在HCl/乙酸中進(jìn)行裂解。
也可使用已知的方法，例如活性酯法偶聯(lián)氮雜氨基酸，其中被保護(hù)的肼衍生物與氯甲酸酯反應(yīng)得到活性酯。具體地說，所使用的活性酯是對位硝基苯酯。作為進(jìn)一步的可能性，可活化氰苯基殘基上的氨基以得到異氰酸酯，然后便有可能與肼衍生物進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)過程中可用已知的保護(hù)基封閉肼的Nβ官能團(tuán)，為此目的可使用芐氧羰基，特別是叔丁氧羰基。酸解脫去保護(hù)基之后，加入堿如N-甲基嗎啉、三乙胺或二異丙基乙胺，使芳香、雜芳香或雜環(huán)磺酰氯在溶劑如四氫呋喃、二噁烷、二氯甲烷或DMF中偶聯(lián)。然而常見的是，先使磺酰氯衍生物與肼衍生物偶聯(lián)更為有利。這樣可避免保護(hù)基的引入。可用已知的反應(yīng)方法使氰基轉(zhuǎn)變?yōu)殡呋倌軋F(tuán)。最好在幾天之內(nèi)用硫化氫處理溶于三乙胺/吡啶中的相應(yīng)的氰基苯丙氨酸衍生物。分離以這種方法形成的硫代酰胺并使用甲基化劑如甲基碘將其轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼鷣啺彼峒柞セ衔?。通過用銨化合物例如乙酸銨，最好在用甲酸作為溶劑情況下進(jìn)行處理，可得到所需的酰氨基苯丙氨酸化合物。
用常規(guī)的方法純化這些化合物。最好是使用凝膠滲透層析法(在諸如RSephadex LH-20等材料上)或離子交換層析法(在諸如羧甲基纖維素等材料上)，且最好使用乙酸鹽緩沖液。用薄層層析法和HPLC檢驗(yàn)本發(fā)明所述化合物的純度。借助元素分析和NMR檢驗(yàn)其特性。
按照各種標(biāo)準(zhǔn)檢測本發(fā)明所述抑制劑的活性，最好是在體內(nèi)和體外測定KI值、IC50值或部分組織促凝血酶原激酶時間(PTT)。由此可知本發(fā)明要求專利保護(hù)的化合物是特異的、并且是有顯著抗血栓形成能力的高活性凝血酶抑制劑，其活性明顯地超過了此前已知的低分子量抑制劑。
本發(fā)明還涉及具有抗血栓形成作用，含有所述的抑制劑的診斷組合物或治療組合物，和這些化合物作為診斷劑或在制備具有抗血栓形成作用的藥物中的應(yīng)用。
下列實(shí)施例將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
實(shí)施例1β-萘磺?；?氮雜甘氨酰-D-對位脒基苯丙氨酰-哌啶1.Boc-D-對位氰基苯丙氨酰-哌啶將50g(255mmol)對位氰基芐基溴、55g(255mmol)乙酰胺基丙二酸二乙酯和2g碘化鉀在250ml無水二噁烷中加熱至沸騰。在3小時內(nèi)將新鮮配制的6g(260mmol)鈉在乙醇中的溶液滴加到該混合物中。在回流下再沸騰3小時之后，將混合物冷卻至80℃并在3小時內(nèi)加入170ml氫氧化鈉溶液。將混合物加熱至95℃保持4小時。冷卻后，用6N HCl將其pH調(diào)到1并蒸發(fā)除去二噁烷。濾除所沉積的任何沉淀物。用氫氧化鈉溶液將混合物的pH調(diào)到9并用乙酸乙酯萃取兩次。再用鹽酸將水相pH調(diào)到1，從而結(jié)晶出N-乙酰氰基苯丙氨酸。收集結(jié)晶，用水洗數(shù)次并在高真空下干燥之。
產(chǎn)率47g(理論值的79.2%)純度檢驗(yàn)TLC Rf＝0.5(氯仿/甲醇/冰乙酸體積比為50∶10∶2.5)。
加入3N氫氧化鈉溶液使24g該產(chǎn)物溶于3升水中并調(diào)節(jié)pH至6-6.5。將500mg?；D(zhuǎn)移酶加到該混合物中并將其在37℃下保溫4天。此后，通過超濾除去溶液中的?；D(zhuǎn)移酶。然后濃縮至1升。調(diào)節(jié)pH至1之后，用乙酸乙酯萃取混合物數(shù)次。用不太濃的氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相并用硫酸鈉干燥之，蒸發(fā)除去溶劑后得到8.2gN-乙酰-D-氰基苯丙氨酸(理論值的82%)。
將含在40ml水中的22ml冰乙酸和4.3ml濃鹽酸加到8g該化合物中并將混合物加熱煮沸24小時。蒸發(fā)解離溶液后，用甲醇夾帶走附著的痕量酸，然后用甲醇/二乙醚溶解并重新沉淀該產(chǎn)物。
產(chǎn)率6.6g(理論值的85%)加入7.5ml二異丙基乙胺使5gD-氰基苯丙氨酸鹽酸鹽溶于14ml水中。將6g叔丁氧基羰基-肟基-2-苯基乙腈在17ml二噁烷中的溶液加到該混合物中并攪拌過夜。加入40ml水和50ml乙酸乙酯。分離出水相并用1M碳酸氫鉀再次萃取有機(jī)相。合并水相，再用10ml二乙醚洗滌，然后用鹽酸將pH調(diào)到3。用乙酸乙酯萃取3次，并用氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相，然后用硫酸鈉干燥之。蒸發(fā)溶劑后，得到5.6g(78%)Boc-D-氰基苯丙氨酸。
將3.26g(10mmol)Boc-D-氰基苯丙氨酸，1.49g(11mmol)HOBt和2.42g(12mmol)DCCI溶解于50mlDMF中并將該溶液攪拌1小時。加入1ml吡啶并將混合物攪拌過夜。濾出沉淀的二環(huán)己基脲，蒸餾除去DMF并用乙酸乙酯浸溶殘余物。分別用碳酸氫鉀、1M硫酸氫鉀和飽和氯化鈉溶液將該溶液各洗3次。用硫酸鈉干燥有機(jī)相并蒸餾除去溶劑之后，得到3.16g(80%)Boc-D-氰基苯丙氨酰-哌啶。
純度檢驗(yàn)TLCRf＝0.27(氯仿)2.D-氰基苯丙氨酰-哌啶鹽酸鹽將3gBoc-保護(hù)的化合物溶解于50ml加在冰醋酸中的1.2NHCl中并在室溫下將混合物攪拌30分鐘。真空蒸餾除去解離試劑，然后用甲苯夾帶走溶劑并用少量二乙醚研制殘余物。收集結(jié)晶并真空干燥之。
產(chǎn)率2.2g。
3.Boc-氮雜甘氨酰-D-氰基苯丙氨酰-哌啶將2.08g(7mmol)Boc-氮雜甘氨酰-對位硝基苯基酯和2.06g(7mmol)氰基苯丙氨酰-哌啶溶于50mlDMF中。加入2.4ml(14mmol)二異丙基乙胺后，在室溫下暗處攪拌混合物1天。真空蒸餾除去溶劑，用乙酸乙酯浸溶殘余物并用1M硫酸氫鉀溶液洗滌該溶液3次、用碳酸氫鉀溶液洗滌3次、用濃氯化鈉溶液洗滌兩次。用硫酸鈉干燥有機(jī)相并蒸發(fā)掉溶劑。將殘余物與二異丙醚一起攪拌，收集并干燥結(jié)晶，得到2.29gBoc-氮雜甘氨酰-D-氰基苯丙氨酰-哌啶。
4.β-萘磺酰-氮雜甘氨酰-D-氰基苯丙氨酰-哌啶將2.08g(5mmol)Boc-氮雜甘氨酰-D-氰基苯丙氨酰-哌啶溶于50ml加在冰醋酸內(nèi)的1.2NHCl中并在室溫下將混合物攪拌30分鐘。蒸發(fā)解離試劑并在真空下用甲苯夾帶除去之，然后用乙醚研制殘余物并收集結(jié)晶。將結(jié)晶溶于50ml二氯甲烷并加入1.7ml(10mmol)二異丙基乙胺。將1.134gβ-萘磺酰氯加到該混合物中并在室溫下攪拌過夜。蒸餾除去溶劑，用乙酸乙酯浸溶殘余物，用1M硫酸氫鉀溶液洗滌該溶液3次、用碳酸氫鉀溶液洗滌3次并用濃氯化鈉溶液洗滌兩次。用硫酸鈉干燥有機(jī)相并蒸發(fā)除去溶劑，得到1.75gβ-萘磺酰-氮雜甘氨酰-D-氰基苯丙氨酰-哌啶。
5.β-萘磺酰-氮雜甘氨酰-D-脒基-苯丙氨酰哌啶將1g在步驟4中制得的化合物溶于30ml無水吡啶中，加入1ml三乙胺后，通入硫化氫氣體3小時。室溫下放置3天之后，將溶液倒在100g冰和50ml濃鹽酸的混合物上。抽濾并用水洗滌沉淀物。干燥后，用50ml丙酮浸溶硫代酰胺，并用1.5ml甲基碘處理該溶液。將它在回流下煮沸30分鐘。冷卻后，用二乙醚進(jìn)行沉淀。將沉淀物溶于二氯甲烷并用水洗滌兩次。用硫酸鈉干燥有機(jī)相并除去溶劑之后，用30ml無水甲醇浸溶殘余物并加入200mg乙酸銨。將混合物加熱至60℃保持3小時。真空蒸發(fā)溶劑。在加有甲醇的RSephadex LH-20上對產(chǎn)物進(jìn)行層析純化。
產(chǎn)率590mg純度檢驗(yàn)熔點(diǎn)182℃TLCRf＝0.48〔氯仿50/甲醇10/冰乙酸2.5(體積比)〕特性檢驗(yàn)分子量測定(快原子轟擊)MH+523實(shí)施例2Pmc-氮雜甘氨酰-D-對位脒基苯丙氨酰哌啶步驟1-3與前面的實(shí)施例相同。
4.Pmc-氮雜甘氨酰-D-氰基苯丙氨酰哌啶將1.67g(4mmol)Boc-氮雜甘氨酰-D-氰基苯丙氨酰-哌啶溶于50ml加在冰醋酸內(nèi)的1.2NHCl中并將混合物在室溫下攪拌30分鐘。蒸發(fā)解離劑并在真空下用甲苯夾帶除去之后，用乙醚研制殘余物并收集結(jié)晶。將結(jié)晶溶于加入了1.36ml(8mmol)二異丙基乙胺的50ml二氯甲烷中。將1.35gPmc氯化物加到該混合物中并在室溫下攪拌過夜。蒸餾除去溶劑之后，用乙酸乙酯浸溶殘余物并用1M硫酸氫鉀溶液洗滌該溶液3次，用碳酸氫鉀溶液洗滌3次，再用濃氯化鈉溶液洗滌兩次。用硫酸鈉干燥有機(jī)相并蒸發(fā)除去溶劑，得到1.95gPmc-氮雜甘氨酰-D-氰基苯丙氨酰哌啶。
5.Pmc-氮雜甘氨酰-D-脒基苯丙氨酰哌啶將1.5g在步驟4中制得的化合物溶于30ml無水吡啶，加入1ml三乙胺之后，通入硫化氫氣體3小時。在室溫下放置3天后，將溶液倒在100g冰和50ml濃鹽酸的混合物上。抽濾并用水洗滌沉淀物。干燥后，用50ml丙酮浸溶硫代酰胺并用1.5ml甲基碘處理之。將混合物在回流下煮沸30分鐘。冷卻后，用二乙醚進(jìn)行沉淀之。將沉淀物溶解于二氯甲烷中并用水洗兩次。用硫酸鈉干燥有機(jī)相并除去溶劑之后，用30ml無水甲醇浸溶殘余物并加入300mg乙酸銨。將混合物加熱至60°保持3小時。真空蒸發(fā)溶劑。在加有甲醇的RSephadex LH-20上對產(chǎn)物進(jìn)行層析純化。產(chǎn)率990mg。
純度檢驗(yàn)熔點(diǎn)149-155℃(燒結(jié)，乙酸鹽)TLCRf＝0.52〔氯仿50/甲醇10/冰乙酸2.5(體積比)〕凝血酶抑制劑IC50值的測定在0.1MTris-HCl緩沖液/0.15MNaCl(pH8.2)中以遞增的濃度將這些化合物與人凝血酶一起保溫。1小時后，通過加入底物Chromozym TH(Tos-Gly-Pro-Arg-pNA，5×10 M/l)開始酶促反應(yīng)。1小時后用光度計在405nm處測定pNA的釋放，檢測結(jié)果以光密度的增加表示。將導(dǎo)致50%酶活性抑制的抑制劑濃度定為ID50值(100%相當(dāng)于不受抑制的酶反應(yīng))。
凝血酶K值的測定用上述凝血酶溶液測定所研究之化合物的KI值。為此目的，將凝血酶與抑制劑一起保溫，其中抑制劑的濃度大致相當(dāng)于在上述試驗(yàn)中所測得的IC50值。加入各種不同濃度的底物ChromozymRTH(0.7-45×10-5mol/l)后開始反應(yīng)。按照Lin eweaver和Burk所述的方法(J.Amer.Chem.Soc.，56658-666，1934)測定抑制的類型和KI值。
表Ⅰ化合物 凝血酶抑制作用IC50(mol/l) KI(mol/l)Pmc-Gly- 1.4×10-91.3×10-9Aph-PipNas-AGly- 1.3×10-92.6×10-9
Aph-PipPmc-AGly- 1.6×10-129.2×10-11Aph-PipNAPAP 2.8×10-91.4×10-9縮寫B(tài)OC叔丁氧基羰基TLC薄層層析法Rf滯留因子HOBt羥基苯并三唑DCCI二環(huán)己基碳化二亞胺DMF二甲基甲酰胺Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰。
權(quán)利要求
1.制備式(Ⅰ)所示化合物的方法
其中R′是可被1-3個至多含有3個碳原子的烷氧基或被至多5個含有1-2個碳原子的烷基衍化的萘基或苯基，或可被至多5個甲基衍化的苯并二氫呋喃基，R1是氫、至多有4個碳原子的低級烷基、羥烷基、至多有7個碳原子的芳烷基或至多有4個碳原子的羥烷基，R2和R3相同或不同，各自代表至多有4個碳原子的烷基、R2和R3與氮原子一起可形成一個環(huán)，該環(huán)可被至多有3個碳原子的羥基、羥基或羥烷基基團(tuán)衍化，*以R或S構(gòu)型存在，但最好以R構(gòu)型存在，該方法包括使式R′-SO2-NH-NHR1的肼衍生物，其中R′和R1具有在式Ⅰ中所示的含意一與羰基化劑在溶液中進(jìn)行反應(yīng)并使反應(yīng)產(chǎn)物與對-脒基苯基二烷基酰胺反應(yīng)，其中烷基基團(tuán)具有式Ⅰ中指出的R2和R3的含意。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所用的羰基化劑是對位硝基苯基氯甲酸酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中制得的化合物中R′是β-萘基，R1是氫，R2和R3一起形成哌啶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃，R1是氫，R2和R3一起形成哌啶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是β-萘基，R1是-CH2-COOH，R2和R3一起形成哌啶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是β-萘基，R1是甲基，R2和R3一起形成哌啶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是6，7-二甲氧基-β-萘基，R1是H，R2和R3一起形成哌啶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是5-甲氧基-α-萘基，R1是甲基，R2和R3一起形成哌啶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是β-萘基，R1是H，R2和R3一起形成哌啶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是5，6，7，8-四氫-β-萘基，R1是CH2-COOH，R2和R3一起形成哌啶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是甲氧基三苯甲基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中R′是五甲基苯基，R1是H，R2和R3一起形成哌啶。
全文摘要
本發(fā)明描述了脒基苯丙氨酸衍生物、它們的制備方法、它們的應(yīng)用和含有這些化合物的藥物組合物。
文檔編號A61K38/00GK1067431SQ9210244
公開日1992年12月30日 申請日期1992年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1991年4月9日
發(fā)明者W·斯圖泊, G·迪克乃特 申請人:柏林魏克股份公司