使用CYP153烷烴羥化酶由烷烴或1-烷醇生產(chǎn)α,ω-二醇的方法
【專利說(shuō)明】使用CYP153烷烴羥化酶由烷烴或1 -烷醇生產(chǎn)α , ω - 二醇的方法
[0001]本發(fā)明涉及包括如下步驟的方法
a)提供燒徑或1-燒醇，
b)使所述烷烴或1-烷醇在水溶液中與來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶和氧氣接觸至少3小時(shí)。
[0002]取代的烷烴，例如醇、醛、酮、羧酸和胺，代表了一類在工業(yè)上受歡迎的化合物，這些化合物傳統(tǒng)是通過(guò)對(duì)由化石碳源制得的化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化來(lái)制備。在不可再生的礦物燃料的供應(yīng)日益受限的時(shí)代，從可再生資源(即可以容易地和(從地質(zhì)年代表的角度來(lái)看)快速地補(bǔ)充的材料)開(kāi)始生產(chǎn)烷烴及其衍生物的生物技術(shù)工藝受到廣泛關(guān)注。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道了多種將烷烴轉(zhuǎn)化為取代的烷烴，特別是氧化烷烴的方法。甲烷單加氧酶催化一個(gè)氧原子NADH-依賴性地插入甲烷的特別穩(wěn)定的C-H鍵，形成甲醇，這是通過(guò)甲燒氧化菌如發(fā)孢甲基彎菌{Methylosinus trichosporium)和莢膜甲基球菌{Methylococcus capsulatus)降解甲燒的第一步?？扇苄约谉龁渭友趺傅湫偷鼐哂袑挼牡孜锓秶?，包括至多達(dá)大約C8的飽和的和不飽和的、線性的、分枝的和環(huán)狀的烴，以及芳香的、雜環(huán)的、和含氯的化合物(Merkx M, Kopp DA, Sazinsky MH, Blazyk JL, MilllerJ, Lippard SJ (2001), Angew Chem Int Ed Engl 40:2782-2807; Higgins IJ, BestDJ, Hammond RC.1980)。在甲烷利用細(xì)菌中的新發(fā)現(xiàn)突出了它們?cè)谏锶Φ闹匾院退鼈兊纳虡I(yè)潛力。依賴于紅素氧還蛋白的燒徑單加氧酶如來(lái)自惡臭假單胞菌iPseudomoimsput I da) GPol的烷烴單加氧酶催化中等鏈長(zhǎng)度的烷烴的氧化，產(chǎn)生醇和羧酸的混合物
(Grant C., Woodley, J.M, and Baganz, F (2011) Enzyme and Microbial Technology48, 480-486)。
[0004]但是，具有兩個(gè)或更多個(gè)取代的烷基對(duì)于許多應(yīng)用來(lái)說(shuō)是必不可少的，例如在工業(yè)聚合物的生產(chǎn)中作為交聯(lián)劑，在這種情況下，通過(guò)這種生物技術(shù)方法可以獲得的取代度受到限制。已報(bào)道有許多系統(tǒng)將烷烴轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的1-烷醇，但是存在很少的可以用于生產(chǎn)相應(yīng)的α，ω-二醇的生物技術(shù)方法，α，ω - 二醇即其中兩個(gè)末端碳原子的每一個(gè)都攜帶一個(gè)羥基的烷基鏈。而且，許多氧化酶易于過(guò)度氧化烷烴底物，導(dǎo)致不希望的醛和羧酸污染所需的醇產(chǎn)物的效果。最后，氧化需要是有選擇性的，這意味著優(yōu)選除了末端碳原子之外的烷烴碳原子不應(yīng)被氧化。
[0005]因此，本發(fā)明的根本問(wèn)題提供了將烷烴或1-烷醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α，ω- 二醇的生物技術(shù)路線，其中過(guò)度氧化的程度受到限制，和/或反應(yīng)是足夠特異性的，優(yōu)選除末端碳原子之外的碳原子不被取代或者被取代的程度較低。
[0006]在第一方面，本發(fā)明的根本問(wèn)題通過(guò)包括下述步驟的方法來(lái)解決
a)提供燒徑或1-燒醇，
b)使所述烷烴或1-烷醇在水溶液中與來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶和氧氣接觸至少3小時(shí)。
[0007]在第二方面，本發(fā)明的根本問(wèn)題通過(guò)使用來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶使烷烴或1-烷醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α，ω - 二醇來(lái)解決。
[0008]在第一或第二方面的第一實(shí)施方案中，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中在存在來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶的條件下溫育烷烴或1_烷醇至少3、優(yōu)選16、最優(yōu)選24小時(shí)。
[0009]在第一或第二方面的第二實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中，除了來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶之外，還存在鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶，其中鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶兩者均能夠在功能上與所述來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶相互作用。
[0010]在第一或第二方面的第三實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第二實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶是來(lái)自泊庫(kù)島食燒菌iAlcrniivorax borkumensis)的CYP153家族的細(xì)胞色素P450燒烴羥化酶(登錄編碼YP_691921)或其變體，鐵氧還蛋白是來(lái)自泊庫(kù)島食烷菌的鐵氧還蛋白(登錄編碼ΥΡ_691921)或其變體，并且鐵氧還蛋白還原酶是來(lái)自泊庫(kù)島食烷菌的鐵氧還蛋白還原酶(登錄編碼ΥΡ_691923)或其變體。
[0011]在第一或第二方面的第四實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第三實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中烷烴或1-烷醇是具有1-7個(gè)，優(yōu)選1-4個(gè)碳原子的烷烴。
[0012]在第一或第二方面的第五實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第四實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中烷烴是丁烷或異丁烷。
[0013]在第一或第二方面的第六實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第五實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中烷烴或1-烷醇是具有1-7個(gè)碳原子的1-烷醇，優(yōu)選丁醇或異丁醇。
[0014]在第一或第二方面的第七實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第六實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中烷烴是以分壓1-50，優(yōu)選1-20，最優(yōu)選1-10 bar提供的氣態(tài)烷烴。
[0015]在第一或第二方面的第八實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第七實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中至少一種選自包含來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶的組的酶以表達(dá)所述一種酶(enzyme)或多種酶(enzymes)的全細(xì)胞催化劑的形式提供。
[0016]在第一或第二方面的第九實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第八實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中所有選自包含來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶的組的酶以表達(dá)所述酶的全細(xì)胞生物催化劑的形式提供。
[0017]在第一或第二方面的第十實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第九實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中至少一種，優(yōu)選所有選自包含來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶的組的酶是重組的和/或過(guò)表達(dá)的，優(yōu)選是過(guò)表達(dá)的。
[0018]在第一或第二方面的第十一實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第十實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中全細(xì)胞生物催化劑表達(dá)來(lái)自AlkL家族的多肽，優(yōu)選來(lái)自惡臭假單胞菌的AlkL (登錄編碼CAB69081)或其變體。
[0019]在一個(gè)或第二個(gè)方面的第十二實(shí)施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第十一實(shí)施方案的實(shí)施方案，通過(guò)方法或用途解決問(wèn)題，其中全細(xì)胞生物催化劑是原核細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌{E.coli)。
[0020]在第三方面，本發(fā)明的根本問(wèn)題通過(guò)使用根據(jù)第一或第二方面的方法或者第一或第二方面的任一實(shí)施方案使烷烴轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α，ω-二醇來(lái)解決。
[0021]本發(fā)明基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶可用于將烷烴不僅轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的1-烷醇，而且還轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α，ω-二醇。
[0022]本發(fā)明集中于方法或用途，其包括使烷烴或1-烷醇與來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶接觸的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語(yǔ)“來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶”指胞質(zhì)細(xì)胞色素氧化酶，其是3組分系統(tǒng)的天然部分，所述3組分系統(tǒng)不僅包括氧化酶，還包括鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶，其中氧化酶具有烷烴結(jié)合位點(diǎn)并能使烷烴羥基化。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自CYP153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶與來(lái)自泊庫(kù)島食烷菌SK2的細(xì)胞色素Ρ450氧化酶(登錄編碼ΥΡ_691921)具有至少80%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%以及最優(yōu)選99%的氨基酸序列同一性，此外還具有烷烴羥化酶活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶除了具有所述氨基酸序列同一性程度、所述結(jié)合位點(diǎn)和所述烷烴羥化酶活性之外，還具有氨基酸序列基序LL(I/L) (V/I)GGNDTTRN。本申請(qǐng)通篇引用的數(shù)據(jù)庫(kù)編碼指NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)2012年10月12日在線版本的編碼。
[0023]為了盡可能有效地從還原劑提供電子供應(yīng)，以維持細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶的羥化酶活性，優(yōu)選烷烴羥化酶與功能上與所述烷烴羥化酶相互作用的鐵氧還蛋白還原酶以及鐵氧還蛋白組合使用。在使用全細(xì)胞生物催化劑提供細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶的情況下，鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶可以是分離的多肽，或者可以是共表達(dá)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地通過(guò)在存在烷烴底物和三種多肽的條件下，監(jiān)測(cè)還原劑的氧化是否超出背景水平，來(lái)確定鐵氧還蛋白還原酶和/或鐵氧還蛋白是否與目標(biāo)細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶在功能上相互作用，所述三種多肽優(yōu)選是分離的多肽?；蛘?，在使用在功能上相互作用的多肽的情況下，可以使用 Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B.M, undHauer, B.(2011) Org.B1mo1.Chem., 9, 6727所述的酶測(cè)定來(lái)指示升高的反應(yīng)速率。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自CYP 153家族的細(xì)胞色素Ρ450烷烴羥化酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶來(lái)自相同生物體，優(yōu)選來(lái)自泊庫(kù)島食烷菌SK2，在這種情況下，登錄編碼分別是 ΥΡ_691921、ΥΡ_691923 和 ΥΡ_691920。
[0024]在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文使用的術(shù)語(yǔ)“接觸”是使烷烴或1-烷醇與氧化還原酶之間發(fā)生直接接觸，以使得后者能夠氧化前者。例如，細(xì)胞和烷烴或1-烷醇可能不處于由膜(例如對(duì)于目標(biāo)細(xì)胞和烷烴或1-烷醇來(lái)說(shuō)是不能滲透的無(wú)機(jī)膜)分隔開(kāi)的不同的空間中。如果烷烴或1-烷醇是固體的或是可溶的，可以簡(jiǎn)單地將其加入到水溶液中的氧化還原酶中。如果烷烴或1-烷醇是氣態(tài)的，包含細(xì)胞的水溶液可以與包含所述氣態(tài)烷烴或1-烷醇的