通過使用AlkB烷烴1-單加氧酶氧化烷烴的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及氧化烷烴的方法，其包括使烷烴與AlkB型氧化還原酶接觸，和使用AlkB型氧化還原酶制備烷烴的氧化產(chǎn)物的混合物，其中氧化產(chǎn)物中羧酸與醇的比例優(yōu)選大于1:1。
【專利說明】通過使用AIkB烷烴1-單加氧酶氧化烷烴的方法
[0001]本發(fā)明涉及氧化烷烴的方法，其包括使烷烴與AlkB型氧化還原酶接觸，和使用AlkB型氧化還原酶制備烷烴的氧化產(chǎn)物的混合物，其中氧化產(chǎn)物中羧酸與醇的比例優(yōu)選大于 1:1 ο
[0002]烷烴是化學(xué)工業(yè)中最重要的基礎(chǔ)材料?；牧贤ǔＪ谦@得它們的起點，然而，同時，從可再生原材料獲得烷烴的方法也是已知的。盡管烷烴對于公眾是已知的，尤其是由于它們作為能源的有用性，例如，以氣體形式的短鏈烷烴或液體的更長鏈烷烴，但它們在工業(yè)中尤其是在它們作為用于多種合成的反應(yīng)物或溶劑的作用中是不可或缺的，所述合成產(chǎn)生日常生活中重要的產(chǎn)品，諸如塑料制品或藥物制品。
[0003]使用烷烴用于此類目的的一個基本條件是氧化引入含雜原子的官能到烷烴碳鏈中，例如羥基、酮和羧基官能，這是由于烷烴本身由于它們的化學(xué)飽和性而可以表征為相對惰性的。然而，這必須不能導(dǎo)致烷烴向二氧化碳的完全氧化，除了當(dāng)使用烷烴作為燃料之外，而是含雜原子的官能必須被選擇性地且以可控的方式引入。
[0004]已知用于合成制備取代有含雜原子的官能的烷烴的許多反應(yīng)，例如在UV光的影響下烷烴的鹵化，其產(chǎn)物可以用作合成許多化合物的反應(yīng)物。例如，醇可以通過鹵素取代烷烴的親核取代來獲得。然而，此類反應(yīng)常常需要使用有毒的和/或環(huán)境有害的物質(zhì)，例如氯氣，其由于它的工業(yè)價格低而常常用于鹵化。
[0005]一系列用于將含雜原 子尤其是含氧的官能引入烷烴的生物技術(shù)方法也是已知的。例如，通過嗜石油節(jié)桿菌(Arthrobacter petroleophagus)和其他野生型菌株轉(zhuǎn)化丙烷為丙酮描述于Exxon的專利(EP 98137)中。Grant等(2011)使用重組大腸桿菌細胞來氧化長鏈燒烴。
[0006]針對這一背景，本發(fā)明的目標是開發(fā)氧化烷烴的生物技術(shù)方法，其適合用于選擇性氧化烷烴的末端碳原子，直至氧化為羧酸。
[0007]此外，本發(fā)明的目標是開發(fā)這樣的方法，其適合于制備在末端碳原子處選擇性氧化的烷烴的多種產(chǎn)物，其中可以改變產(chǎn)物的量和比例。
[0008]此外，本發(fā)明的目標是提供氧化還原酶系統(tǒng)，其能夠催化末端碳原子的氧化至選自醇、醛和羧酸的所有氧化水平，其中僅單一的催化活性多肽與底物烷烴或其中間產(chǎn)物接觸。
[0009]此外，本發(fā)明的目標是提供獨立于脂肪酸代謝且通過單獨的氧化系統(tǒng)的過表達而表征的系統(tǒng)，其用于烷烴的選擇性末端氧化。
[0010]本發(fā)明的進一步的目標是提供用于氧化烷烴，優(yōu)選氣態(tài)烷烴的方法，其適合于主要地或以改進的產(chǎn)率氧化烷烴為羧酸，而非僅僅主要氧化為醇。
[0011]這些和其他目的通過本發(fā)明的主題和尤其還通過所附的獨立權(quán)利要求的主題來實現(xiàn)，其中從屬權(quán)利要求中產(chǎn)生具體實施方案。
[0012]在第一方面，本發(fā)明的目標通過氧化烷烴的方法來實現(xiàn)，所述方法包括使烷烴與AlkB型氧化還原酶在氧存在的情況下接觸。
[0013]在第一方面的第一個實施方案中，所述烷烴是具有1-5個碳原子的烷烴。[0014]在第一方面的第二個實施方案中，其還是第一方面的第一個實施方案的一個實施方案，所述烷烴是具有1-4個碳原子的烷烴，優(yōu)選丁烷。
[0015]在第一方面的第三個實施方案中，其還是第一方面的第一個和第二個實施方案的一個實施方案，所述烷烴是支化的烷烴，優(yōu)選具有4個或5個碳原子的烷烴，更優(yōu)選異丁烷。
[0016]在第一方面的第四個實施方案中，其是第一方面的第一個至第三個實施方案的一個實施方案，所述AlkB型氧化還原酶是來自惡臭假單胞菌iPseudomonas putida) GPOl的AlkB或其變體。
[0017]在第一方面的第五個實施方案中，其還是第一方面的第一個至第四個實施方案的一個實施方案，所述AlkB型氧化還原酶以全細胞催化劑的形式提供。
[0018]在第一方面的第六個實施方案中，其還是第一方面的第一個至第五個實施方案的一個實施方案，所述AlkB型氧化還原酶以純化的多肽的形式提供。
[0019]在第二方面，本發(fā)明的目標通過使用AlkB型氧化還原酶在氧存在的情況下制備烷烴的氧化產(chǎn)物的混合物來實現(xiàn)，其中氧化產(chǎn)物中羧酸與醇的比例優(yōu)選大于1:1。
[0020]在第二方面的第一個實施方案中，所述烷烴是具有1-5個碳原子的烷烴。
[0021]在第二方面的第二個實施方案中，其還是第二方面的第一個實施方案的一個實施方案，所述烷烴是具有1-4個碳原子的烷烴，優(yōu)選丁烷。
[0022]在第二方面的第三個實施方案中，其還是第二方面的第一個和第二個實施方案的一個實施方案，所述烷烴是支化的烷烴，優(yōu)選具有4個或5個碳原子的烷烴，更優(yōu)選異丁烷。
[0023]在第二方面的第四個實施方案中，其是第二方面的第一個至第三個實施方案的一個實施方案，所述AlkB型氧化還原酶是來自惡臭假單胞菌iPseudomonas putida) GPOl的AlkB或其變體。
[0024]在第二方面的第五個實施方案中，其還是第二方面的第一個至第四個實施方案的一個實施方案，所述AlkB型氧化還原酶以全細胞催化劑的形式提供。
[0025]在第二方面的第六個實施方案中，其還是第二方面的第一個至第四個實施方案的一個實施方案，所述AlkB型氧化還原酶以純化的多肽的形式提供。
[0026]在第二方面的第七個實施方案中，其還是第二方面的第一個至第六個實施方案的一個實施方案，氧化產(chǎn)物中羧酸與醇的比例大于5:1，優(yōu)選大于12:1，更優(yōu)選大于20:1，最優(yōu)選大于40:1。
[0027]本發(fā)明的發(fā)明人已確定AlkB型氧化還原酶(其在參考文獻中也已知為用于制備主要氧化強度更低的產(chǎn)物的催化劑)可以令人驚奇地用于從烷烴制備主要更高氧化水平的產(chǎn)物，尤其從氣態(tài)烷烴來制備，尤其是從烷烴開始產(chǎn)生羧酸。尤其是，產(chǎn)生的羧酸與產(chǎn)生的醇的比例令人驚奇地高。此外，本發(fā)明人已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)此類氧化還原酶能夠選擇性氧化烷烴，并且產(chǎn)生可預(yù)期的副產(chǎn)物，尤其是在除末端碳原子之外的碳原子上氧化的烷烴僅僅以出人意料低的含量或以根本無法檢測到的量存在。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，烷烴優(yōu)選氣態(tài)烷烴，使用AlkB型氧化還原酶在氧存在的情況下氧化。AlkB代表最初從惡臭假單胞菌Gpol的 lkBGT系統(tǒng)中已知的氧化還原酶，其依賴于另兩種多肽AlkG和AlkT。將AlkT表征為FAD依賴性紅素氧還蛋白還原酶，其從NADH向AlkG轉(zhuǎn)移電子。AlkG是紅素氧還蛋白，一種含鐵的氧化還原蛋白，其功能為AlkB的直接電子供體。在一個優(yōu)選的實施方案中，同一術(shù)語“AlkB型的氧化還原酶”為與具有氧化烷烴的能力的惡臭假單胞菌Gpol的AlkB序列(數(shù)據(jù)庫代碼:CAB54050.1 ;該數(shù)據(jù)庫代碼如用于本申請中的現(xiàn)有技術(shù)的所有其他代碼一樣起源，即來自NCBI數(shù)據(jù)庫，更準確地是在2011年11月15日在線可用地發(fā)布)具有至少75、80、85、90、92、94、96、98或99% (遞增優(yōu)選地)的序列同源性的多肽。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，AlkB型氧化還原酶是具有來自惡臭假單胞菌Gpol的AlkG (CAB54052.1)和AlkT (CAB54063.1)多肽的功能上相互作用的、氧化烷烴的氧化還原酶。在一個最優(yōu)選的實施方案中，AlkB型氧化還原酶是來自惡臭假單胞菌Gpol的AlkBGT系統(tǒng)的AlkB或其變體。
[0029]本發(fā)明的教導(dǎo)不僅僅可以通過使用本文描述的生物大分子的準確的氨基酸或核酸序列來實現(xiàn)，還可以通過使用此類大分子的變體(其可以通過缺失、添加或取代一個或多于一個的氨基酸或核酸來獲得)來實現(xiàn)。在一個優(yōu)選的實施方案中，如本文所用的核酸序列或氨基酸序列的術(shù)語“變體”(下文中與術(shù)語“同源物”同義地且可互換使用)表示另一條核酸序列或氨基酸序列，其具有與對應(yīng)的原始野生型核酸或氨基酸序列70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性(此處可同義使用同一性)，其中優(yōu)選除形成催化活性中心的或?qū)τ诮Y(jié)構(gòu)或折疊必需的氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代，或后者僅被保守取代，例如谷氨酸代替天冬氨酸，或亮氨酸代替纈氨酸。序列在其整個長度上具有相應(yīng)的高同源性并不是必需的；根據(jù)本發(fā)明還可以使用融合蛋白或編碼其的核酸，其具有部分相應(yīng)的同源性和/或活性?，F(xiàn)有技術(shù)描述了可用于計算兩條序列同源性程度的算法，例如ArthurLesk (2008), Introduction to Bioinformatics,第 3 版。在本發(fā)明進一步更優(yōu)選的實施方案中，氨基酸或核酸序列的變體，優(yōu)選除上述序列同源性之外，具有與野生型分子或原始分子基本上相同的酶活性。例如，有酶活性的多肽蛋白酶的變體具有與多肽酶相同或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽鍵水解的能力。在一個具體的實施方案中，術(shù)語“基本上相同的酶活性”表示這樣的活性，其對于野生型多肽的底物而言，明確地在本底活性之上或/和在Km和/或kMt值上與野生型多肽對于相同底物展示出的不同，相差少于3個、優(yōu)選2個、更優(yōu)選I個數(shù)量 級。在進一步優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語核酸或氨基酸序列的“變體”包括核酸或氨基酸序列的至少一個活性部分/或片段。在進一步優(yōu)選的實施方案中，如本文所用的術(shù)語“活性部分”表示氨基酸序列或核酸序列，其具有少于氨基酸序列全長的序列和/或編碼少于氨基酸序列全長的序列，其中比野生型氨基酸序列長度短的氨基酸序列或編碼的氨基酸序列基本上具有與野生型多肽或其變體相同的酶活性，例如醇脫氫酶、單加氧酶或氨基轉(zhuǎn)移酶。在一個具體的實施方案中，術(shù)語核酸的“變體”包括這樣的核酸，其互補鏈優(yōu)選在嚴格條件下與野生型核酸結(jié)合。雜交反應(yīng)的嚴格性可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，并通常依賴于探針的長度、洗滌溫度和鹽濃度。通常，更長的探針需要更高的雜交溫度，而更短的樣品在更低的溫度下操作。雜交是否發(fā)生通常依賴于變性DNA與其環(huán)境(SP低于解鏈溫度)中存在的互補鏈退火(annellieren)的能力。雜交反應(yīng)的嚴格性和相應(yīng)的條件更詳細地描述于Ausubel等(1995)。在一個優(yōu)選的實施方案中，如本文所用，術(shù)語核酸的“變體”包含編碼與原始核酸相同的氨基酸序列的或在根據(jù)遺傳密碼簡并性的情況下編碼該氨基酸序列的變體的任何核酸序列。
[0030]對于許多應(yīng)用，作為全細胞催化劑的部分所用的AlkB型氧化還原酶正在成為選擇的實施方案，這是由于它不需要氧化還原酶或其活性的任何純化，或者至少不需要完全純化。在一個優(yōu)選的實施方案中，將如本文所用的術(shù)語“全細胞催化劑”理解為表示具有目標酶活性的代謝活躍的細胞，優(yōu)選具有AlkB型氧化還原酶，優(yōu)選為相對于它的野生型升高的程度，其可以有利地通過過表達在質(zhì)粒上的或整合入基因組中的重組的AlkB型氧化還原酶來實現(xiàn)。許多用于制備全細胞催化劑的系統(tǒng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，例如來自DE 60216245的。在一個優(yōu)選的實施方案中，用作全細胞催化劑或用作表達系統(tǒng)的細胞是原核細胞，優(yōu)選細菌細胞。在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是哺乳動物細胞。在進一步優(yōu)選的實施方案中，它是低等真核細胞，優(yōu)選酵母細胞。原核細胞的實例包括埃希氏菌屬尤其是大腸桿菌{Escherichia coli)，和屬假單胞菌屬和棒桿菌屬的菌株。低等真核細胞的實例包括屬酵母屬(SaccAaro焊ces)、假絲酵母屬(Cafli/ii/a)、畢赤酵母屬(/7ZcAia)、耶羅維亞酵母屬(Yarrowia)、裂殖酵母屬iSchizosaccharomyces \尤其是菌株熱帶假絲酵母、Candida iropica/is)、粟酒裂殖酵母 iSchizosacchaxomyces pombe)>巴斯德畢赤酵母(/7ZcAia解脂耶羅維亞酵母ijarrowia lipolytica)和釀酒酵
^iSaccharomyces cerivisiae、。細胞可以包含一個、或多于一個在質(zhì)粒上的或整合入其基因組中的編碼根據(jù)本發(fā)明使用的酶的核酸序列。用于制備此類質(zhì)?；蚣毎姆椒梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)實施。這些方面描述于分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)和微生物學(xué)的教科書和實驗方案集合中,例如在Sambrook等(1989)。
[0031]在進一步優(yōu)選的實施方案中，AlkB型氧化還原酶卻是純化的酶。在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明使用的所有的有酶活性的多肽可以是包含有酶活性的多肽的細胞或其裂解產(chǎn)物或在所有純化步驟中的多肽制備物(從粗裂解產(chǎn)物直至純的多肽)。在一個優(yōu)選的實施方案中，將如本文所用的術(shù) 語“純化的”酶理解為表示在一個優(yōu)選的實施方案中，不將全細胞或其未處理的提取物用于催化，而是酶是部分或完全純化的。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，如本文所用的術(shù)語“純化的”酶表示將酶純化直到在制備物的SDS凝膠上它具有至少約80、85、95、98或優(yōu)選99% (遞增優(yōu)選地)的可見蛋白。在一個更優(yōu)選的實施方案中，將酶純化直到它是對應(yīng)制備物的SDS凝膠上唯一可識別的多肽。多種方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，使用所述方法可以在合適細胞中過表達酶活性多肽并可以純化或分離。因此，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲的用于表達多肽的所有表達系統(tǒng)，例如PET型或pGEX型載體。層析方法適合于純化，例如通過使用固定配體通過親和層析純化提供有標簽的重組蛋白，例如，在組氨酸標簽的情況下的鎳離子，在與目的蛋白融合的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的情況下的固定的谷胱甘肽，或在含麥芽糖結(jié)合蛋白的標簽的情況下的固定的麥芽糖。
[0032]純化的酶活性的多肽可以以可溶形式或固定地來使用。合適的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，通過所述方法可以將多肽共價地或非共價地固定在有機或無機固相上，例如通過巰基偶聯(lián)化學(xué)(例如來自Pierce的試劑盒)。
[0033]本發(fā)明的教導(dǎo)可以用于多種烷烴。在一個優(yōu)選的實施方案中，如本文所用的術(shù)語“烷烴”是選自以下的飽和的烴:分子式CnH2n+2的直鏈或支化的烴和分子式CnH2n的環(huán)化烴，其中 η可以具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和更多的值，優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4。具有1-4個碳原子的烷烴包括例如化合物甲烷、乙烷、丙烷、丁烷和異丁烷。烷烴包括直鏈烷烴，例如包含甲烷、乙烷、丙烷和丁烷的組。在一個優(yōu)選的實施方案中，烷烴是支化的烷烴，優(yōu)選選自異丁烷、2-甲基丁烷和新戊烷。在進一步尤其優(yōu)選的實施方案中，烷烴是選自丁烷和異丁烷的烷烴。在進一步尤其優(yōu)選的實施方案中，所述烷烴是甲基環(huán)丁烷。[0034]為了進行本發(fā)明的方法，多種條件是合適的。作為氧化劑的分子氧的存在是必需的。氧可以以氧源的形式諸如過氧化氫或高錳酸鉀存在，并且可以從這些中原位形成，但尤其優(yōu)選的是引入氧氣，更優(yōu)選以空氣的形式，進入含有氧化還原酶的液體反應(yīng)培養(yǎng)基中。在這種情況下溫度可以高于2o°c、3o°c、4(rc、5(rc、6(rc、7(rc或高于so°c，優(yōu)選直至100°c，只要在使用活細胞或合適的酶制劑的情況下，所選的細胞或所選的酶分別是活的或顯示出活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知哪些生物在哪些溫度下是活的，例如從教科書諸如Fuchs/Schlegel, 2007中。在活酵母細胞的情況下，溫度可以是5_45°C，優(yōu)選15_42°C，更優(yōu)選20-30 V。在革蘭氏陰性細菌的情況下，優(yōu)選來自腸桿菌科iEnterobacteriaceae)的細菌，最優(yōu)選大腸桿菌，溫度可以是5-45 °C，優(yōu)選15-42 °C，更優(yōu)選20_30°C，最優(yōu)選35-400C。pH必須是這樣的，從而使AlkB型氧化還原酶的活性至少保持足夠長的時間。在使用全細胞催化劑的情況下，細胞必須足夠長的時間保持完整。例如，PH可以是3-12，優(yōu)選5-9，更優(yōu)選6-8。
[0035]優(yōu)選使烷烴以這樣的方式與AlkB型氧化還原酶接觸，從而使以純化形式或以全細胞催化劑形式存在的AlkB型氧化還原酶以足夠穩(wěn)定形式存在于水溶液中，并且邊輕柔攪拌邊將烷烴(在固體或液體烷烴的情況下)與氧一起加入到溶液中，或者如果它是氣態(tài)烷烴的話，則將它以氣體形式引入到水溶液中。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有在常規(guī)實驗背景中提供酶或全細胞催化劑的穩(wěn)定形式的能力。待觀察的因素，諸如合適的緩沖系統(tǒng)的使用、合適的溫度、pH和鹽濃度的設(shè)定值，均描述于參考文獻中，例如在Cornish-Bowden, 1995中。
[0036]對于培養(yǎng)本發(fā)明的細胞，多種培養(yǎng)基是合適的，在使用酵母細胞的情況下，例如YPD、YPN和YNB，其可以 添加有氨基酸，例如具有0.01g/Ι的色氨酸、或添加有葡萄糖，例如以1% (w/v)的濃度。在使用來自腸桿菌科的細菌，優(yōu)選大腸桿菌的情況下，培養(yǎng)可以在完全培養(yǎng)基中，諸如LB培養(yǎng)基或高細胞密度培養(yǎng)基(HCD培養(yǎng)基)，其每升由NH4SO4 1.76 g、K2HPO4 19.08 g、KH2PO4 12.5 g、酵母提取物 6.66 g、檸檬酸三鈉 1.96 g、檸檬酸 NH4Fe (I%) 17 ml、微量元素溶液US3 5 ml、給料溶液(葡萄糖50 % w/v, MgSO4 [x 7 H2O 0.5 %w/v, NH4Cl 2.2 % w/v) 30 ml 組成。
[0037]在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的細胞在用于烷烴氧化的培養(yǎng)基之外的另一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基并且用于烷烴氧化的培養(yǎng)基是基本培養(yǎng)基。如果本發(fā)明的方法使用活細胞進行，則在細胞培養(yǎng)后優(yōu)選在轉(zhuǎn)化緩沖液中進行，其每升含有(NH4)H2PO4 8 g、NaCl 0.5 g, MgSO4X 7 H2O 0.48 g、微量元素溶液US3 15 ml。I升微量元素溶液US3由HCl 37 % 36.5 g、MnCl2 X 4H20 1.91 g、ZnSO4 x 7H20 1.87 g, Na-EDTA x 2H20 0.8 g、H3BO3 0.3 g、Na2MoO4X 2H20 0.25 g、CaCl2 x 2H20 4.7 g,FeSO4 x 7 H2O 17.8 g、CuCl2 x 2H20 0.15 g 構(gòu)成，并將它的pH調(diào)節(jié)至5.4。在進一步的實施方案中，烷烴氧化在M9培養(yǎng)基(在1000 ml搖瓶中15 g 葡萄糖、6.79 g Na2PO4,3 g KH2PO4'0.5 g NaCl,2 g NH4Cl'15 g 酵母提取物、0.49 gMgS04*7H20、l ml TE，并接有50 Pg卡那霉素，其中微量元素溶液(TE)每升由以下構(gòu)成:36.5g HCl 37 %、1.91 g MnCl2*4H20、l.87 g ZnS04*7H20、0.84 g Na_EDTA*2H20、0.3 g H3BO3>
0.25 g Na2Mo04*2H20、4.7 g CaCl2*2H20、17.3 g FeS04*7H20和 0.15 g CuC12*2H20)中進行。
[0038]本發(fā)明的方法在大氣壓下進行。然而，在使用氣態(tài)烷烴反應(yīng)物的情況下，在氣體混合物(主要包含烷烴和氧氣的混合物，并且氧氣以體積計多于50、60、70或80% (遞增優(yōu)選地))的存在的情況下，允許AlkB型氧化還原酶以更高的壓力催化反應(yīng)可能是有利的。在一個優(yōu)選的實施方案中，壓力大于1.5、2、3或4 bar。在進一步的實施方案中,壓力為0.5-4,優(yōu)選1-3,最優(yōu)選1-1.5 bar。
[0039]本發(fā)明的方法的一個具體的優(yōu)點在于可以獲得用作反應(yīng)物的烷烴的氧化產(chǎn)物的特定比例。原則上，烷烴可以由AlkB型氧化還原酶在末端碳原子(即最多直接共價連接僅一個另外的碳原子的碳原子)上被氧化至三個氧化水平，即醇、醛和羧酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，表述“氧化產(chǎn)物中羧酸與醇的比例優(yōu)選大于1:1”表示羧酸與醇的物質(zhì)的量的比，優(yōu)選通過末端碳原子氧化形成的羧酸與通過末端碳原子氧化形成的醇的物質(zhì)的量的比大于1: 1，即比通過末端碳原子氧化形成的醇分子更多的通過末端碳原子氧化形成的羧酸分子存在于產(chǎn)物混合物中。
[0040]在一個優(yōu)選的實施方案中，AlkB型氧化還原酶，優(yōu)選來自惡臭假單胞菌Gpol的AlkB，可以用于在氧存在的情況下從烷烴制備氧化產(chǎn)物，所述烷烴為優(yōu)選具有1-5個，更優(yōu)選1-4個碳原子，最優(yōu)選4個碳原子的烷烴，其中羧酸與醇的比例優(yōu)選大于1:1、1.5:1、2: 1、5:1、10:1、15:1或20:1 (遞增優(yōu)選地)。
[0041]在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包含:氧化非環(huán)狀烷烴的末端碳原子至相應(yīng)的醛和/或相應(yīng)的末端單羧酸的方法，所述方法包括在氧化劑存在的情況下，使烷烴與包含有催化活性的氧化還原酶的生物制劑接觸，其中所述烷烴是丁烷或異丁烷，并且其中所述氧化還原酶是AlkB型氧化還原酶,更優(yōu)選是來自惡臭假單胞菌GPOl的AlkB單加氧酶或其同源物，并且所述氧化劑是氧JPAlkB型氧化還原酶，優(yōu)選來自惡臭假單胞菌GPOl的AlkB單加氧酶或其同源物用于氧化非環(huán)狀烷烴的末端碳原子至相應(yīng)的醛和/或相應(yīng)的末端單羧酸的用途，其中所述烷烴是丁烷或異丁烷。
[0042]本發(fā)明通過以 附圖和非限定性實施例進一步說明，從中可以獲得本發(fā)明的進一步的特征、實施方案、方面和優(yōu)點。
[0043]圖la)、b)、c)和d)顯示了通過惡臭假單胞菌GPOl的AlkBGT單加氧酶系統(tǒng)以500 - 800或900 rpm的攪拌速度，在與氧轉(zhuǎn)化丁烷的過程中，隨時間過程的1-丁醇(a))、2-丁醇(b))、丁醛(c))和丁酸(d))的濃度。顯示了在發(fā)酵罐(F)和在洗瓶(WB)中的濃度。
[0044]圖2 a)和b)顯示了生物量濃度對通過大腸桿菌由惡臭假單胞菌GPOl的AlkBGT單加氧酶系統(tǒng)氧化丁烷的影響，更準確地為隨時間過程的1-丁醇(a))和丁酸(b))的濃度。
[0045]圖3a)、b)、c)和d)顯示了微量元素(TE)溶液的濃度對通過大腸桿菌由惡臭假單胞菌GPOl的AlkBGT單加氧酶系統(tǒng)氧化丁烷的影響，更準確地為隨時間過程的1-丁醇(a))、2-丁醇(b))、丁醛(c))和丁酸(d))的濃度。
[0046]圖4a)、b)、c)和d)顯示了由惡臭假單胞菌GPOl的AlkBGT單加氧酶系統(tǒng)的菌株大腸桿菌BL21和大腸桿菌W3110的比較，以及其對通過大腸桿菌用惡臭假單胞菌GPOl的單加氧酶(AlkBGT)氧化丁烷的影響，更準確地為隨時間過程的1-丁醇(a))、2-丁醇(b))、丁醛(C))和丁酸(d))的濃度。
[0047]圖5a)、b)、c)顯示了通過大腸桿菌由惡臭假單胞菌GPOl的AlkBGT單加氧酶系統(tǒng)氧化異丁烷，更準確地為隨時間過程的2-甲基-1-丁醇(a))、異丁醛(b))和異丁酸(C))的濃度。
[0048]圖6圖示了實施例7的克隆的p-LL-30載體。
[0049]圖7顯示了通過大腸桿菌由Alcanivorax borkumensis的AlkBG單加氧酶系統(tǒng)氧化丁烷，如實施例7中進行的。
[0050]實施例1:通過大腸桿菌由惡臭假單胞菌GPOl的AlkBGT單加氧酶系統(tǒng)氧化丁烷 將100μΙ的大腸桿菌BL21 pCOMIO (空質(zhì)粒)和大腸桿菌BL21 pBTIO (W0
2009/077461)的甘油冷凍培養(yǎng)物鋪在含有50 μL卡那霉素的LB瓊脂板上，并在37°C下孵育24小時。LB平板由酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 0.5 g、瓊脂瓊脂15 g和卡那霉素50 μg的I升溶液制備。高壓滅菌前用5% NH4OH將pH調(diào)節(jié)為7.4。
[0051]從這些平板(對于一個轉(zhuǎn)化批次)，用接種環(huán)滿滿一環(huán)(容量10 μL)接種在100 ml具有擋板(Schikanen)的搖瓶中含50 μL卡那霉素的2 χ 25 ml的LB培養(yǎng)基(不具有瓊脂瓊脂的上述溶液)。將培養(yǎng)物在37°C和200rpm (振幅2.5 cm)下孵育24小時。
[0052]將每一 25 ml的培養(yǎng)基隨后用作在75 ml未改良的M9培養(yǎng)基(無菌過濾的)中的接種物，所述培養(yǎng)基每升有以下組成:在1000 ml搖瓶中15 g葡萄糖、6.79 g Na2PO4,3 gKH2P04、0.5 g NaCl,2 g NH4Cl,15 g酵母提取物、0.49 g MgS04*7H20、l ml TE 和 50 yg 卡那霉素。微量元素溶液(TE)每升如下構(gòu)成:36.5 g HCl 37 %、1.91 g MnCl2*4H20、1.87 gZnS04*7H20、0.84 g Na_EDTA*2H20、0.3 g H3BO3>0.25 g Na2Mo04*2H20、4.7 g CaCl2*2H20、17.3 g FeS04*7H20 和 0.15 g CuC12*2H20。用 5% NH4OH 將 pH 調(diào)節(jié)為 7.4。此外，每瓶加入3滴高壓滅菌的消泡劑(Delamex)。
[0053]將瓶在37°C和180rpm (振幅2.5 cm)下孵育2小時。隨后將溫度降低到25°C。在25°C下0.5小時后用0.4 mM DCPK誘導(dǎo)。將培養(yǎng)物在25°C和180 rpm下再振蕩16小時。隨后進行Monosepsis的顯微鏡檢查。
[0054]將培養(yǎng)物組合，加入到50 ml Falcon管中并在25°C下以10 000 g離心10分鐘。丟棄上清液。將來自200 ml的培養(yǎng)物的沉淀重懸于10 ml的轉(zhuǎn)化緩沖液中。轉(zhuǎn)化緩沖液由70 mM NaVK+磷酸鹽緩沖液組成，其用I M NaOH調(diào)節(jié)為pH 7，含有6.79 g Na2PO4,3 gKH2P04、0.5 g NaCl.0.49 g MgS04*7H20、l ml TE和 50 gg卡那霉素，或由 70 mM (NH4)H2PO4緩沖液(pH 7)組成，其每升含有 8 g (NH4)H2PO4、0.5 g NaCU0.49 g MgS04*7H20、l ml TE和50 卡那霉素。在這種情況下用5% NH4OH調(diào)節(jié)pH。
[0055]將170 ml加有約3滴高壓滅菌的消泡劑(Delamex)的緩沖液置于300 ml發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐用25%丁烷和75%合成空氣的氣體混合物充氣，其來自貯氣瓶以5 bar的初始壓力經(jīng)具有0.2 Mm孔徑的燒結(jié)玻璃充氣器，并以25升/小時的流速。將發(fā)酵罐在水浴中調(diào)溫到25°C并且通過磁力攪拌器以500 rpm攪拌2小時，隨后以800 rpm。將廢氣經(jīng)過含有150 ml水的洗瓶導(dǎo)出。
[0056]用10 ml重懸的沉淀接種發(fā)酵罐。兩種培養(yǎng)物的OD約為10。反應(yīng)通過加入I體積％的葡萄糖來開始。在實驗的時間過程中選擇性地可以調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)pH。在10、45、135和240分鐘后從發(fā)酵罐和洗瓶中分別取 出10 ml樣品。用2 ml HCl終止來自發(fā)酵罐的樣品中的反應(yīng)。將發(fā)酵罐樣品在室溫下以10 000 g離心10分鐘，并將上清液經(jīng)0.2 Mm注射器式濾器單元過濾。將樣品裝載到HPLC管中用于分析。層析分析在Agilent Technologies1200 裝置上通過 HPLC-RID 進行。使用 Aminex HPX-87H 柱(300 mm x 7.8 mm)。使用 10 mMH2SO4作為洗脫液 以0.6 ml/min的流速和40°C的柱溫操作裝置。待分析的所有物質(zhì)的標準品在超純水中制備，并在相同條件下測量。通過比較保留時間進行評價。此外，在每次取樣時間點從發(fā)酵罐中取出2 ml樣品用于測定pH、0D和葡萄糖濃度。pH通過外部pH計測量，OD在600 nm處用分光光度計測量,并且葡萄糖含量用生物化學(xué)分析儀(來自Kreienbaum的YSI Select 2700)測定。
[0057]結(jié)果
結(jié)果顯示于圖1 a) - d)中。在用大腸桿菌BL21 pCOMIO (空質(zhì)粒)的實驗中，沒有發(fā)生丁烷或1-丁醇的氧化。相反，大腸桿菌BL21pBT10的更多應(yīng)用被發(fā)現(xiàn)為正丁烷的氧化產(chǎn)物:1- 丁醇、丁酸、2- 丁醇、丁醛、1，4- 丁二醇(不可定量的)和丁內(nèi)酯(痕量的)。
[0058]所有氧化產(chǎn)物的濃度隨總體實驗時期而增加。消耗了約I g/lh的葡萄糖，pH從7降低至約5。
[0059]實施例2:攪拌速度(物質(zhì)運輸限制)對通過大腸桿菌用惡臭假單胞菌GPOl的單加氧酶(AlkBGT)的正丁烷的氧化的影響
實驗與實施例1類似地進行。將攪拌速度在第二批中從開始設(shè)定為恒定的900 rpm。相比于實施例1，OD為兩倍。TE濃度為15倍。最終取樣在200分鐘后。
[0060]結(jié)果
在恒定的更高攪拌速度下，1- 丁醇在發(fā)酵罐(F)中更迅速地形成，并且更快地達到最大值。在洗瓶(WF)中的1-丁醇的濃度處于大概同樣低的水平。發(fā)酵罐(F)中2-丁醇的濃度在整個實驗時間過程中在任意攪拌速度下增加，但保持是低的。直至實驗時間結(jié)束，2-丁醇在洗瓶中才可檢測到。丁醛濃度隨更高的攪拌速度更迅速地增加，但由于蒸氣壓為113hPa (20°C )，也更迅速地排出。丁醛僅僅是可以定性地而非可定量地檢測到。
[0061]在更低的攪拌速度下，直至實驗時期結(jié)束時，正丁酸才形成。在高的攪拌速度下，濃度持續(xù)增加。在洗瓶中不能檢測到正丁酸。
[0062]實施例3:生物量濃度對通過大腸桿菌用惡臭假單胞菌GPOl的單加氧酶(AlkBGT)的正丁烷的氧化的影響
實驗與實施例1類似地進行。攪拌速度為恒定900 rpm，TE濃度分別為15倍。Ix表示約10的0D，2x對應(yīng)于20。
[0063]結(jié)果
結(jié)果顯示于圖2 a)和b)中。最大濃度在兩倍OD時在更早的實驗時刻達到。1-丁醇也更迅速地轉(zhuǎn)化。
[0064]丁酸僅可以在發(fā)酵罐(F)中檢測到，而非在洗瓶中。在兩倍OD時，丁酸的形成已經(jīng)在轉(zhuǎn)化開始時開始了。在一倍OD時，丁酸在這些條件下直至240分鐘后才能被檢測到。在兩倍OD時，濃度大約是最大濃度的18%。
[0065]實施例4:TE濃度對通過大腸桿菌用惡臭假單胞菌GPOl的單加氧酶(AlkBGT)的正丁烷的氧化的影響
實驗與實施例1類似地進行。攪拌速度恒定為900 rpm。所用的菌株為大腸桿菌W3110PBTlO0 TE濃度為I ml/1的緩沖液(Ix)或15 ml/1的緩沖液(15x)。在用15倍濃度的實驗中，加入額外的30 mg/1 MOPS。
[0066]結(jié)果結(jié)果顯示于圖3 a) - d)。在15倍TE濃度下，所有氧化產(chǎn)物更迅速地且以更高濃度形成。
[0067]實施例5:具有惡臭假單胞菌GPOl的單加氧酶(AlkBGT)的菌株大腸桿菌BL21和大腸桿菌W3110的比較
實驗與實施例1類似地用固定攪拌速度900 rpm進行。TE濃度為15 ml/1的轉(zhuǎn)化緩沖液。
[0068]結(jié)果
結(jié)果顯示于圖4 a) - d)。大腸桿菌W3110 pBTIO菌株比大腸桿菌BL21 pBTIO菌株更迅速地且以更高濃度形成所有氧化產(chǎn)物。
[0069]實施例6:通過具有惡臭假單胞菌GPOl的單加氧酶(AlkBGT)的大腸桿菌氧化異丁燒
工作流程與實施例1類似地進行。僅使用大腸桿菌W3110 pBTIO菌株。轉(zhuǎn)化緩沖液由70 mM NaVK+磷酸鹽緩沖液組成，其用5% NH4OH調(diào)節(jié)為pH7，每升含有6.79 g Na2PO4,3 gKH2P04、0.5 g NaCl.0.49 g MgS04*7H20、15 ml TE 和 50 Pg 卡那霉素。
[0070]充氣如實施例1中進行，僅用25%異丁烷和75%合成空氣的混合物。
[0071]結(jié)果
結(jié)果顯示于圖5 a) - c)中。發(fā)現(xiàn)的異丁烷的氧化產(chǎn)物為異丁醇、異丁酸、叔丁醇和異丁醛。
[0072]實施例7:用具有borkumensis的AlkBG單加氧酶系統(tǒng)的大腸桿菌氧化丁烷
用于氧化的菌株包含具有來自Alcani vorax borkumensis SK2 (數(shù)據(jù)庫代碼CAL18155.1和CAL18156.1)的AlkBG單加氧酶的遺傳信息的質(zhì)粒。AlkST,AlkL以及AlkS和AlkB啟動子的遺傳信息來源于惡臭假單胞菌GPol。
[0073]靶載體的克隆
對于倍增，根據(jù)制造商說明書使用來自New England Biolabs (NEB, M0531S)的2xPhusion HF Master Mix。根據(jù)純度的程度，載體和PCR產(chǎn)物直接在柱(^ia以/? PCRPurification Kit, Qiagen, Hilden)上純化,或在瓊脂糖凝膠上純化并提取(^ia以/?Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden) QPCR、瓊脂糖凝膠電泳、DNA的溴化乙唳染色和PCR片段大小的確定均以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式進行。在兩種情況下還可以提供期望大小的PCR片段。對于PCR，使用具有所述序列SEQ ID N01、2、3和4的引物。
[0074]在凝膠純化后,將純化的PCR產(chǎn)物使用In-Fusion HD Cloning Kit按照制造商說明書(Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA)通過重組克隆/v5boRI_HF+ Acll切割的載體pBT10_AlkL中。以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DHlOP (New England Biolabs, Frankfurt)。通過限制性分析檢驗?zāi)繕诵蛄械恼_插入,并通過DNA測序確定引入序列的可靠性。所獲的載體稱為p-LL-30 (圖7)。載體序列示于SEQ ID NO 5下的序列方案中。
[0075]供體生物和提供的基因:
?惡臭假單胞菌GPol 檢索號AJ245436AlkB基因
完整的膜無血紅素鐵單加氧酶 蛋白 _id=〃CAB54050.1 AlkF基因 紅素氧還蛋白I 蛋白 id=〃CAB54051.1 AlkQ基因 紅素氧還蛋白2 蛋白 id=〃CAB54052.1 AlkYi基因 醛脫氫酶 檢索號AJ245436 Am基因 紅素氧還蛋白還原酶 蛋白 id=〃CAB54063.1 Alkh基因 外膜蛋白
蛋白 _id=〃CAB54056.1
Am基因 表達調(diào)節(jié)子
蛋白 _id=〃CAB54064.1''
? Alcanivorax borkumensis I
AlkBJh基因
烷烴1-單加氧酶
CAL18155.1
AlkGJh基因
紅素氧還蛋白
CAL18156.1
將靶載體以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式克隆入大腸桿菌W3110中。所獲的菌株稱為大腸桿菌 W3110 AN-S-LL-16 ο
[0076]細胞培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化
將100μΙ的大腸桿菌W3110 EN-S_LL_16的甘油冷凍培養(yǎng)物鋪在含有50 μL卡那霉素的LB瓊脂板上，并在37°C下孵育24小時。LB平板由酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 0.5g、瓊脂瓊脂15 g和卡那霉素50 Pg的I升溶液制備。
[0077]從這些平板，用來自平板的單一菌落接種在100 ml具有擋板的搖瓶中含50 μL卡那霉素的3 X 25 ml的LB培養(yǎng)基(不具有瓊脂瓊脂的上述溶液)。將培養(yǎng)物在37°C和200rpm(振幅2.5 cm)下孵育24小時。
[0078]將每一 25 ml的培養(yǎng)基隨后用作在175 ml未改良的M9培養(yǎng)基中的接種物，所述培養(yǎng)基每升有以下組成:在1000 ml搖瓶中15 g葡萄糖、6.79 g Na2PO4,3 g KH2P04、0.5 gNaCl,2 g NH4Cl,15 g酵母提取物、0.49 g MgS04*7H20、l ml TE和50 μ g卡那霉素。微量元素溶液(TE)每升如下構(gòu)成:36.5 g HCl 37 %、1.91 g MnCl2*4H20、1.87 g ZnS04*7H20、0.84g Na-EDTA*2H20、0.3 g H3BO3、0.25 g Na2Mo04*2H20、4.7 g CaCl2*2H20、17.3 g FeS04*7H20和0.15 g CuC12*2H20。用5% NH4OH將pH調(diào)節(jié)為7.4。此外，每瓶加入3滴高壓滅菌的消泡劑(Delamex)。
[0079]將瓶在37°C和180rpm (振幅2.5 cm)下孵育2小時。隨后將溫度降低到25°C。在25°C下0.5小時后，用0.4 mM DCPK進行誘導(dǎo)。將培養(yǎng)物在25°C和180 rpm下再振蕩16小時。
[0080]將培養(yǎng)物組合，加入到50 ml Falcon管中并在25°C下以10 000 g離心10分鐘。丟棄上清液。將來自600 ml的培養(yǎng)物的沉淀重懸于30 ml的轉(zhuǎn)化緩沖液中。轉(zhuǎn)化緩沖液由70 mM磷酸銨緩沖液(pH 7)組成，其每升含有8 g (NH4)H2PO4、0.5 g NaCU0.49 gMgS04*7H20、l ml TE和50 Pg卡那霉素。用25%的氨溶液調(diào)節(jié)pH。
[0081]將150 ml加有約3滴高壓滅菌的消泡劑(Delamex)的緩沖液置于300 ml發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐用25%丁烷和75%合成空氣的氣體混合物充氣，其經(jīng)具有0.2 Mm孔徑的燒結(jié)玻璃充氣器并以6.5 In/小時的流速。將發(fā)酵罐在水浴中調(diào)溫到30°C并且通過磁力攪拌器以900 rpm攪拌。將廢氣經(jīng)過含有150 ml水的洗瓶導(dǎo)出。
[0082]用重懸的預(yù)培養(yǎng)物沉淀接種發(fā)酵罐。0D600約為15。用5%氨溶液將pH調(diào)節(jié)為7.0。葡萄糖補料速率為I g/lh。在不同時間點從發(fā)酵罐和洗瓶中分別取出5 ml樣品。將發(fā)酵罐樣品在室溫下以10 000 g離心10分鐘，并將上清液經(jīng)0.2 Mffl注射器式濾器單元過濾。將樣品裝載到HPLC管中用于分析。層析分析在Agilent Technologies 1200裝置上通過 HPLC-RID 進行。使用 Aminex HPX-87H 柱(300 mm x 7.8mm)。使用 10 mM H2SO4 作為洗脫液以0.6 ml/min的流速 和40°C的柱溫操作裝置。待分析的所有物質(zhì)的標準品在超純水中制備，并在相同條件下測量。通過比較保留時間進行評價。此外，在每次取樣時間點從發(fā)酵罐中取出2 ml樣品用于測定pH、0D和葡萄糖濃度。pH通過外部pH計測量，OD在600 nm處用分光光度計測量，并且葡萄糖含量用生物化學(xué)分析儀(來自Kreienbaum的YSI Select2700)測定。結(jié)果概述于圖7中。
【權(quán)利要求】
1.AlkB型氧化還原酶在氧存在的情況下用于制備烷烴的氧化產(chǎn)物的混合物的用途，其中所述氧化產(chǎn)物中羧酸與醇的比例大于1:1。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述烷烴是具有1-5個碳原子的烷烴。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述烷烴是具有1-4個碳原子的烷烴，優(yōu)選丁烷。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的用途，其中所述烷烴是支化的烷烴，優(yōu)選具有4個或5個碳原子，更優(yōu)選為異丁烷。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的用途,其中所述AlkB型氧化還原酶是來自惡臭假單胞菌{Pseudomonas putida ) GPOl 的 AlkB 或其變體。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的用途，其中所述AlkB型氧化還原酶以全細胞催化劑的形式提供。
7.權(quán)利要求1-5中任一項的用途，其中所述AlkB型氧化還原酶以純化的多肽的形式提供。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的用途，其中所述氧化產(chǎn)物中羧酸與醇的比例大于5:1，優(yōu)選大于12:1,更優(yōu)選大于20:1，最優(yōu)選大于40:1。
【文檔編號】C12P7/52GK103975069SQ201280059816
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月5日
【發(fā)明者】J.C.普費弗, T.哈斯, O.圖姆, F.埃爾哈特, E.M.維特曼, C.格林, S.哈夫克邁爾, T.許勒 申請人:贏創(chuàng)工業(yè)集團股份有限公司