專利名稱：Cyp79家族的p450單加氧酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶的DNA。本發(fā)明的具體實(shí)施方案是催化L-纈氨酸和L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)變、屬于新的P450單加氧酶亞家族CYP79D的酶，諸如兩種木薯酶CYP79D1和CYP79D2；催化酪氨酸轉(zhuǎn)變成對(duì)羥基苯乙醛肟、屬于新的P450單加氧酶亞家族CYP79E的酶，諸如兩種海韭菜(Triglochin maritima)酶CYP79E1和CYP79E2；催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成苯乙醛肟、屬于新的P450單加氧酶亞家族CYP79A的酶，諸如擬南芥(Arabidopsis thaliana)酶CYP79A2；催化色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-乙醛肟(IAOX)(參與吲哚芥子油苷的生物合成，還可能參與植物激素吲哚乙酸(IAA)的生物合成)、屬于新的P450單加氧酶亞家族CYP79B的酶，諸如擬南芥酶CYP79B2和蔓菁(Brassica napus)酶CYP79B5；和催化脂肪族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)醛肟、屬于新的亞家族CYP79F的酶，諸如擬南芥酶CYP79F1和CYP79F2。所述DNA或其部分在植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可用于操作相應(yīng)芥子油苷或含氰苷的生物合成。
細(xì)胞色素P450酶是構(gòu)成超基因家族的含血紅素酶。在植物中，它們分成截然不同的兩組(Durst等人，Drug Metabolism and DrugInteract，12189-206，1995)。A組可能衍生自共同祖先，并參與次級(jí)植物產(chǎn)物諸如芥子油苷和含氰苷的生物合成。非A組是接近動(dòng)物、真菌、和微生物細(xì)胞色素P450的異質(zhì)簇。將氨基酸序列同一性超過40％的細(xì)胞色素P450分在相同家族內(nèi)(Nelson等人，DNA Cell Biol，121-51，1993)，而同一性超過55％的細(xì)胞色素P450則屬于相同亞家族。
芥子油苷是由氨基酸衍生的次級(jí)植物產(chǎn)物，包含硫酸和硫代葡萄糖部分。芥子油苷的發(fā)生限于白花菜目(Capparales)和核果木屬(Drypetes)(大戟目(Euphorbiales))。C.papaya是植物中包含芥子油苷和含氰苷二者的唯一已知范例。白花菜目包括農(nóng)業(yè)上重要的蕓苔科(Brassicaceae)作物，諸如油料種子油菜和蕓苔屬(Brassica)飼料和蔬菜，以及模型植物擬南芥。組織受損后，芥子油苷迅速水解成具有生物學(xué)活性的降解產(chǎn)物。芥子油苷或其降解產(chǎn)物保護(hù)植物免于昆蟲和真菌的攻擊，且擔(dān)當(dāng)專以蕓苔科為食的昆蟲的引誘劑。除了保護(hù)效果，降解產(chǎn)物在高等動(dòng)物和人中還具有毒性。由消耗大量油菜種子膳食引起的抗?fàn)I養(yǎng)效果(諸如生長(zhǎng)遲緩)具有經(jīng)濟(jì)影響，因?yàn)樗鼈兿拗屏诉@種富含蛋白質(zhì)的動(dòng)物飼料的使用。關(guān)于芥子油苷的幾種降解產(chǎn)物(例如菜菔硫烷即1-異硫氰基-4R-[甲基亞硫?；鵠丁烷，來(lái)自嫩莖花椰菜籽苗的4-甲基亞硫?；』孀佑蛙盏慕到猱a(chǎn)物)的藥理學(xué)研究證明了抗致癌活性。芥子油苷生物合成途徑的代謝工程能夠組織特異性調(diào)控和優(yōu)化個(gè)別芥子油苷的水平以改進(jìn)指定作物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。除了發(fā)生于擬南芥，這些芥子油苷還是蕓苔屬作物和蔬菜的重要成份。例如，蔓菁中的主要芥子油苷即致甲狀腺腫的2-羥基-3-丁烯基芥子油苷是由側(cè)鏈修飾4-甲基硫代丁基芥子油苷而形成的。2-羥基-3-丁烯基芥子油苷在蔓菁中的發(fā)生限制了其富含蛋白質(zhì)的油餅作為動(dòng)物飼料的使用。因此，生物合成基因的有效性對(duì)于開發(fā)非期望芥子油苷水平降低同時(shí)保留具有期望效果(如害蟲抗性)的芥子油苷的作物具有極大潛力。
迄今為止，已經(jīng)鑒定了超過100種不同芥子油苷。根據(jù)它們是否衍生自脂肪族氨基酸、苯丙氨酸和酪氨酸、或色氨酸，將它們分成脂肪族、芳香族、和吲哚基芥子油苷。在進(jìn)入生物合成途徑前，氨基酸通常經(jīng)歷一系列鏈延長(zhǎng)，且芥子油苷產(chǎn)物通常進(jìn)行次級(jí)修飾(諸如羥化、甲基化、和氧化)而產(chǎn)生芥子油苷的結(jié)構(gòu)多樣性。據(jù)顯示，擬南芥Columbia載培品種包含衍生自色氨酸、長(zhǎng)鏈苯丙氨酸同源物(高苯丙氨酸)、和幾種長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物(諸如二高甲硫氨酸(dihomomethionine)、三高甲硫氨酸、和四高甲硫氨酸)的23種不同芥子油苷。
在本發(fā)明中，除了別的以外，我們還由擬南芥鑒定了CYP79同源物CYP79B2，它催化色氨酸轉(zhuǎn)變成IAOX，后者是吲哚芥子油苷和植物激素IAA二者的生物合成前體。CYP79B2在擬南芥中的過度表達(dá)導(dǎo)致吲哚芥子油苷水平升高，這說(shuō)明CYP79B2參與吲哚芥子油苷的生物合成，而且吲哚芥子油苷的進(jìn)化是以“生氰”誘因?yàn)榛A(chǔ)的。
對(duì)于芥子油苷生物合成途徑，尚未鑒定很多基因。對(duì)催化氨基酸轉(zhuǎn)變成醛肟的酶的性質(zhì)行了許多討論。獨(dú)立的生化研究指出三種不同酶系統(tǒng)參與這個(gè)步驟，即依賴細(xì)胞色素P450的單加氧酶、含黃素的單加氧酶、和過氧化物酶。先前有人根據(jù)來(lái)自蕓苔科物種的微粒體酶制劑提出，二高甲硫氨酸、三高甲硫氨酸、和四高甲硫氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的醛肟是由含黃素的單加氧酶催化的。
在含氰苷的生物合成中，CYP79家族的細(xì)胞色素P450催化由氨基酸形成醛肟。例如，芳香族氨基酸前體L-酪氨酸被酶CYP79A1(P450TYR)羥化兩次而形成(Z)-對(duì)羥基苯基乙醛肟(WO 95/16041)，隨后由酶CYP71E1(P450OX)轉(zhuǎn)變成羥腈即對(duì)羥基扁桃腈(WO 98/40470)，對(duì)羥基扁桃腈最后由UDP-葡萄糖苷元葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶綴合葡萄糖。上述酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可用于修飾、重建、或新建含氰苷的生物合成途徑，或者用于更改植物中的芥子油苷生成。已經(jīng)在芥子油苷生成植物中鑒定了幾種CYP79同源物，但是尚未測(cè)定它們的功能。本發(fā)明公開了擬南芥的細(xì)胞色素P450 CYP79A2、CYP79B2、和CYP79F1的克隆和功能性表達(dá)，以及蔓菁的細(xì)胞色素P450 CYP79B5的克隆。本發(fā)明顯示，CYP79A2催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成苯乙醛肟，CYP79B2催化色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-乙醛肟，而CYP79F1催化長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物(諸如高甲硫氨酸、二高甲硫氨酸、三高甲硫氨酸、四高甲硫氨酸、五高甲硫氨酸、和六高甲硫氨酸)轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的醛肟。本發(fā)明還顯示，在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下表達(dá)CYP79A2或CYP79B2的轉(zhuǎn)基因擬南芥分別積累高水平的苯甲基芥子油苷或吲哚芥子油苷，而表達(dá)CYPF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠顯示CYPF1的共遏制，伴隨衍生自長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物的芥子油苷含量降低和長(zhǎng)鏈甲硫氨酸(諸如二高甲硫氨酸和三高甲硫氨酸)水平的高度升高。這些數(shù)據(jù)與CYP79A2、CYP79B2、和CYP79F1在擬南芥中參與芥子油苷生物合成是一致的。出乎意料的是在吲哚芥子油苷生物合成中存在生成IAOX的CYP79，因?yàn)闆]有鑒定到由色氨酸衍生的含氰苷，而且在文獻(xiàn)中描述了過氧化物酶活性參與吲哚芥子油苷生物合成。另外，吲哚芥子油苷是最近進(jìn)化事件的產(chǎn)物，而且只存在于白花菜目的四個(gè)科中，即蕓苔科(Brassicaceae)、木犀草科(Resedaceae)、金線草科(Tovariaceae)、和白花菜科(Capparaceae)。因此，IAOX可能參與IAA和吲哚芥子油苷二者生物合成的可能性說(shuō)明，催化色氨酸轉(zhuǎn)變成IAOX的酶的性質(zhì)與CYP79 N-羥化酶是不同的。CYP79B2在植物中和在體外的表征證明，芥子油苷生物合成中由CYP79蛋白質(zhì)進(jìn)行的肟生成不限于那些同樣作為含氰苷生物合成前體的芳香族氨基酸。這說(shuō)明在與含氰苷分化之后，CYP79蛋白質(zhì)形成新的底物特異性。因此，預(yù)計(jì)芥子油苷生成植物中屬于CYP79家族的許多細(xì)胞色素P450將在芥子油苷生物合成中由多種前體氨基酸催化肟生成。
木薯(最重要的熱帶塊根農(nóng)作物)在植物的所有部分中包含兩種含氰苷，即亞麻苦苷和百脈根苷。在組織受損后，所述葡萄糖苷發(fā)生降解，并伴隨氰化氫的釋放。還沒有發(fā)現(xiàn)不生氰的木薯植物，試圖通過育種完全消除含氰苷的嘗試也尚未獲得成功。因此，木薯產(chǎn)品作為主糧的使用需要小心加工以除去氰化物。然而，加工是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，同時(shí)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、維生素、和礦物質(zhì)的損失。參與亞麻苦苷和百脈根苷生物合成途徑的酶的鑒定將為遏制所述含氰苷生物合成的分子生物學(xué)方法(諸如有義或反義遏制)打開方便之門。
海韭菜(海邊水麥冬植物)在植物的大多數(shù)部分中包含兩種含氰苷，即taxiphyllin和海韭菜苷。在組織受損后，所述葡萄糖苷發(fā)生降解，并伴隨氰化氫的釋放。還沒有發(fā)現(xiàn)不生氰的海邊水麥冬植物。參與taxiphyllin(蜀黍苷的表異構(gòu)物)和海韭菜苷生物合成途徑的酶及相應(yīng)cDNA或基因組克隆的鑒定使得可利用分子生物學(xué)方法遏制所述含氰苷生物合成(諸如有義或反義遏制)或選擇期望改變(使用標(biāo)記輔助選擇)。雖然正在試圖由許多不同植物物種中含氰苷生物合成的共同生物合成路徑來(lái)推斷類似多功能細(xì)胞色素P450酶的參與，但是海韭菜可能并非如此，因?yàn)樵谶@種植物中對(duì)羥基苯基乙醛肟無(wú)需平衡。細(xì)胞色素P450催化醛肟轉(zhuǎn)變成腈是脫水反應(yīng)，而且是如此不尋常。在海韭菜中，可以由與第一種多功能細(xì)胞色素P450酶相關(guān)的額外酶活性進(jìn)行，而非由所涉及的第二種細(xì)胞色素P450催化的第一個(gè)催化事件。如果是這樣的話，海韭菜中的第二種細(xì)胞色素P450將構(gòu)成尋常的C-羥化酶。
基因指編碼序列及相關(guān)調(diào)控序列，其中編碼序列轉(zhuǎn)錄成RNA，諸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA、或反義RNA。調(diào)控序列的范例是啟動(dòng)子序列、5’和3’非翻譯序列、和終止序列。還可以存在其它元件，諸如內(nèi)含子。
表達(dá)通常指內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因在植物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。然而，對(duì)于不編碼蛋白質(zhì)的基因(諸如反義構(gòu)建物)，術(shù)語(yǔ)表達(dá)僅指轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明提供了下列解決方案●編碼將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物(諸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、環(huán)戊烯基甘氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸、色氨酸、二高甲硫氨酸、三高甲硫氨酸、或四高甲硫氨酸)轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶的DNA；●編碼P450單加氧酶的所述DNA，其中所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的整體比對(duì)與得自SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或二者；SEQ IDNO39；SEQ ID NO54或SEQ ID NO70或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示至少40％同一性，或者與得自SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或二者；SEQ ID NO74或SEQ ID NO84或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示至少50％同一性；●編碼具有通式R1-R2-R3的P450單加氧酶的所述DNA，其中-R1、R2、和R3稱為成份序列，且-R2由150-175個(gè)或更多氨基酸殘基組成，其序列與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3；SEQ ID NO9或SEQ ID NO11；SEQ ID NO54或SEQ ID NO70；SEQ ID NO74或SEQ ID NO84中的經(jīng)比對(duì)成份序列至少60％同一；或者與SEQ ID NO39中的經(jīng)比對(duì)成份序列至少65％同一；
●將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶；●用于分離編碼P450單加氧酶的cDNA的方法，所述酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟；●用于生成純化的重組P450單加氧酶的方法，所述酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟；●標(biāo)記輔助育種方法，其中使用長(zhǎng)度為至少15-20個(gè)核苷酸、構(gòu)成依照本發(fā)明的DNA的成份序列的至少一種寡核苷酸；和●獲取轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將包含至少部分P450單加氧酶開放讀碼框的DNA穩(wěn)定整合到其基因組中，所述酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟。根據(jù)所用構(gòu)建物，得到的植物顯示含氰苷或芥子油苷的含量或特性得到改變。
人們認(rèn)為含氰苷的生物合成是依照一般途徑進(jìn)行的，即涉及所有植物中相同類型的中間物。這已經(jīng)由涉及氨基酸轉(zhuǎn)變成肟的途徑部分得到了清楚的證明。在所有測(cè)試植物中，所述途徑部分是由屬于CYP79家族的一種或多種細(xì)胞色素P450酶催化的。該家族的成員是在氨基酸水平顯示40％序列同一性的蛋白質(zhì)，而將顯示低于55％序列同一性的成員分成不同亞家族。例如，催化芳香族氨基酸L-酪氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的高粱酶屬于亞家族CYP79A，稱為CYP79A1。taxiphyllin和海韭菜苷生物合成途徑也由芳香族氨基酸L-酪氨酸轉(zhuǎn)變成對(duì)羥基苯乙醛肟開始。認(rèn)為亞麻苦苷和百脈根苷生物合成途徑由脂肪族氨基酸L-纈氨酸或L-異亮氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟開始。
本發(fā)明的目的是提供編碼將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶的DNA，以及根據(jù)在木薯、海韭菜、擬南芥、或蔓菁中表達(dá)的酶的氨基酸序列和相應(yīng)基因序列確定它們的一般結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)催化脂肪族氨基酸的轉(zhuǎn)變的酶構(gòu)成新的P450酶亞家族，稱為CYP79D；催化芳香族氨基酸的轉(zhuǎn)變的酶構(gòu)成新的P450酶亞家族，稱為CYP79E；催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成苯乙醛肟的酶屬于CYP79A亞家族；催化色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-乙醛肟的酶屬于CYP79B亞家族；催化脂肪族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物的轉(zhuǎn)變的酶屬于CYP79F亞家族。
如此，本發(fā)明公開了將脂肪族氨基酸(諸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、或環(huán)戊烯基甘氨酸)轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶。酶對(duì)L-氨基酸是特異的。它是由獨(dú)立選自下組的氨基酸殘基組成的GlY、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His，并與得自SEQ ID NO1(CYP79D1)或SEQ ID NO3(CYP79D2)或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示至少40％、優(yōu)選55％、甚至更優(yōu)選70％同一性，這些序列代表了在木薯中天然表達(dá)的所述序列的本發(fā)明具體實(shí)施方案。
本發(fā)明還公開了將芳香族氨基酸諸如酪氨酸或苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶。該酶對(duì)L-氨基酸是特異的。它是由獨(dú)立選自下組的氨基酸殘基組成的Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His，并與得自SEQ ID NO9(CYP79E1)或SEQ ID NO11(CYP79E2)或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示至少50％、優(yōu)選55％、甚至更優(yōu)選70％同一性，所述序列代表了在海韭菜中天然表達(dá)的本發(fā)明的具體實(shí)施方案。
本發(fā)明還公開了將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成苯乙醛肟的P450單加氧酶。它是由獨(dú)立選自下組的氨基酸殘基組成的Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His，并與得自SEQ ID NO39(CYP79A2)整體比對(duì)的氨基酸序列顯示至少40％、優(yōu)選55％、甚至更優(yōu)選70％同一性，所述序列代表了在擬南芥中天然表達(dá)的本發(fā)明的具體實(shí)施方案。
本發(fā)明還公開了將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-乙醛肟的P450單加氧酶。它是由獨(dú)立選自下組的氨基酸殘基組成的Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His，并與得自SEQ ID NO54(CYP79B2)或SEQ ID NO70(CYP79B5)整體比對(duì)的氨基酸序列顯示至少40％、優(yōu)選55％、甚至更優(yōu)選70％同一性，二者分別代表了在擬南芥和蔓菁中天然表達(dá)的本本發(fā)明還公開了將脂肪族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)醛肟的P450單加氧酶。它是由獨(dú)立選自下組的氨基酸殘基組成的Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His，并與得自SEQ ID NO74(CYP79F1)或SEQ ID NO84(CYP79F2)整體比對(duì)的氨基酸序列顯示至少50％、優(yōu)選55％、甚至更優(yōu)選70％同一性，二者代表了在擬南芥中天然表達(dá)的本發(fā)明的具體實(shí)施方案。
可能因存活細(xì)胞內(nèi)翻譯后修飾而產(chǎn)生的氨基酸殘基的范例是上述氨基酸的糖基化殘基以及Aad、bAad、bAla、Abu、4Abu、Acp、Ahe、Aib、bAib、Apm、Dbu、Des、Dpm、Dpr、EtGly、EtAsn、Hyl、aHyl、3Hyp、4Hyp、Ide、alle、MeGly、MeIle、MeLys、MeVal、Nva、Nle、或Orn。
依照本發(fā)明的酶的氨基酸序列可以由通式R1-R2-R3進(jìn)一步定義，其中-R1、R2、和R3稱為成份序列，且-R2由150、175、200個(gè)或更多氨基酸殘基組成，其序列與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3；SEQ ID NO9或SEQ ID NO11；SEQ ID NO39；SEQ ID NO54或SEQ ID NO70；SEQ ID NO74或SEQ ID NO84中的經(jīng)比對(duì)成份序列至少60-65％、優(yōu)選至少70％、甚至更優(yōu)選至少75％同一。
R2通常由150-175個(gè)或更多氨基酸殘基組成。R2的具體實(shí)施方案有SEQ ID NO1的第334-484位氨基酸和SEQ ID NO3的第333-483位氨基酸；SEQ ID NO9的第339-489位氨基酸和SEQ ID NO11的第332-482位氨基酸；SEQ ID NO39的第308-487位氨基酸；SEQ ID NO54的第196-345位氨基酸和SEQ ID NO70的第192-341位氨基酸；以及SEQID NO74的第334-483位氨基酸和SEQ ID NO84的第332-481位氨基酸。
由所述DNA編碼的單加氧酶通常由450-600個(gè)氨基酸殘基組成。因而，具體實(shí)施方案CYP79D1(SEQ ID NO1)、CYP79D2(SEQ ID NO3)、CYP79E1(SEQ ID NO9)、CYP79E2(SEQ ID NO11)、CYP79A2(SEQID NO39)、CYP79B2(SEQ ID NO54)、CYP79B5(SEQ ID NO70)、CYP79F1(SEQ ID NO74)、和CYP79F2(SEQ ID NO84)的大小分別是541、542、540、533、523、541、540、537、和535個(gè)氨基酸殘基。
一般而言，存在兩種方法可用于序列比對(duì)。由Needleman和Wunsch提出的及由Sellers提出的動(dòng)力學(xué)編程算法比對(duì)兩種序列的完整長(zhǎng)度，從而提供序列的整體比對(duì)。另一方面，Smith-Waterman算法產(chǎn)生局部比對(duì)。局部比對(duì)是比對(duì)序列內(nèi)在選定評(píng)分矩陣和缺口罰分下最相似的成對(duì)區(qū)域。這容許數(shù)據(jù)庫(kù)搜索而聚焦于序列中最高度保守的區(qū)域。它還容許鑒定序列內(nèi)相似結(jié)構(gòu)域。為了加快使用Smith-Waterman算法的比對(duì)，諸如BLAST(基本局部算法搜索工具)和FASTA等程序?qū)Ρ葘?duì)設(shè)置了額外約束。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，整體序列比對(duì)是方便的使用程序PILEUP(Genetic Computer Group即遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，麥迪遜，威斯康星州)進(jìn)行的。局部比對(duì)是方便的使用BLAST進(jìn)行的，即設(shè)計(jì)用于探測(cè)所有可獲得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)而不論檢索條目是蛋白質(zhì)或DNA的一組相似性搜索程序。這種搜索工具的2.0版BLAST(Gapped BLAST)已經(jīng)可以在因特網(wǎng)上公開獲得(當(dāng)前網(wǎng)址是http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。它使用啟發(fā)式算法，尋找局部而非整體比對(duì)，從而能夠檢測(cè)只分享分離區(qū)域的序列之間的關(guān)系。在BLAST搜索中獲得的評(píng)分具有明確的統(tǒng)計(jì)學(xué)解釋。在本發(fā)明范圍內(nèi)特別有用的是容許在局部序列比對(duì)中導(dǎo)入缺口的blastp程序和PSI-BLAST程序(這兩種程序都將氨基酸檢索序列對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較)，以及只容許兩種序列的局部比對(duì)的blastp變體程序。優(yōu)選將任選參數(shù)設(shè)成缺省值來(lái)運(yùn)行所述程序。
另外，使用BLAST的序列比對(duì)能夠考慮用一種氨基酸替代另一種是否有可能保留維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能所必需的物理和化學(xué)特性或者是否更有可能破壞基本結(jié)構(gòu)和功能特性。這種序列相似性以“陽(yáng)性”氨基酸百分比進(jìn)行了量化(相對(duì)于同一氨基酸百分比而言)，而且在邊界的情況中可能有助于將蛋白質(zhì)歸入正確的蛋白質(zhì)家族。
可以如WO 95/16041的實(shí)施例3中關(guān)于P450TYR所述，由表達(dá)將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶的植物純化上述酶。
可以通過包括在諸如甲基營(yíng)養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)等酵母中表達(dá)cDNA克隆的方法，而獲得純化的重組P450單加氧酶，所述酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟。為了優(yōu)化表達(dá)條件，可能希望在插入表達(dá)載體前除去5’和3’非翻譯區(qū)?？梢酝ㄟ^像高表達(dá)的巴斯德畢赤酵母AOX1基因的起始ATG那樣正確安置起始ATG而獲得最佳翻譯起始區(qū)?？梢栽谕暾?xì)胞中測(cè)量代謝活性，因?yàn)榘退沟庐叧嘟湍竷?nèi)源還原酶系統(tǒng)能夠支持將電子供給許多植物細(xì)胞色素P450。為了進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)和酶活性水平，可以測(cè)試許多不同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和生長(zhǎng)周期，包括但不限于使用豐富培養(yǎng)基并于OD600大約0.5保溫24-30小時(shí)?？梢酝ㄟ^去污劑像TritonX-114的初步溶解及隨后由溫度誘導(dǎo)的相分配，而由巴斯德畢赤酵母微粒體分離生成的細(xì)胞色素P450。可以使用離子交換層析或染料柱層析來(lái)實(shí)現(xiàn)最終純化。適用于離子交換層析的柱子是DEAE-Sepharose FF。適用于染料層析的柱子是Reactive Red 120瓊脂糖、Reactive Yellow3A瓊脂糖、或Cibachron Blue瓊脂糖。染料柱可以方便的用KCl梯度進(jìn)行洗脫?？梢酝ㄟ^一氧化碳差異光譜學(xué)、底物結(jié)合光譜、或活性測(cè)量(使用脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物作為底物及重建的細(xì)胞色素P450酶)來(lái)鑒定包含活性細(xì)胞色素P450酶的級(jí)分。
若巴斯德畢赤酵母內(nèi)源還原酶不能支持電子供給，則可以依照標(biāo)準(zhǔn)流程(Sibbesen等人，J Biol Chem，2703506-3511，1995)在攜有由提供細(xì)胞色素P450酶來(lái)源的高粱或相同植物物種分離的NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的人造脂質(zhì)微團(tuán)(Sibbesen等人，J BiolChem，2703506-3511，1995；Halkier等人，Arch Biochem Biophys，322369-377，1995；Kahn等人，Plant Physiol，1151661-1670，1997)中分離并重建重組蛋白。
或者，可以將細(xì)菌像大腸桿菌用于屬于CYP79家族的細(xì)胞色素P450酶的重組表達(dá)。得到的蛋白質(zhì)是未糖基化的。根據(jù)具體研究的酶，可以優(yōu)選包含編碼天然或各種截短、延長(zhǎng)、或修飾氨基末端序列的插入片段的載體構(gòu)建物(Halkier等人，Arch Biochem Biophys，322369-377，1995；Barnes等人，Proc Natl Acad Sci USA，885597-5601，1991；Gillem等人，Arch Biochem Biophys，31259-66，1994)。特別優(yōu)選的大腸桿菌菌株是菌株C43(DE3)，已知它可以在以阻滯常用菌株的量表達(dá)異源膜蛋白時(shí)生長(zhǎng)良好。因而，CYP79B2在常用大腸桿菌菌株JM109中生成的表達(dá)不足由菌株C43(DE3)生成的CYP79B2活性的0.5％。也有可能在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
利用在存在大量脂質(zhì)時(shí)用高粱NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶重建的大腸桿菌原生質(zhì)球進(jìn)行了對(duì)CYP79D1、CYP79D2、CYP79E1、CYP79E2、CYP79A2、CYP79B2、CYP79B5、和CYP79F1的底物特異性的研究。L-α-二油酰磷脂酰膽堿和L-α-二肉桂酰磷脂酰膽堿是優(yōu)選用于重建的脂質(zhì)。發(fā)現(xiàn)CYP79D1和CYP79D2二者均可將L-纈氨酸及L-異亮氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟。發(fā)現(xiàn)CYP79E1和CYP79E2二者均可將L-酪氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟。發(fā)現(xiàn)CYP79A2可將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成苯乙醛肟。發(fā)現(xiàn)CYP79B2可將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-乙醛肟。發(fā)現(xiàn)CYP79F1可將長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的醛肟。L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、和L-酪氨酸都不能由CYP79D1或CYP79D2進(jìn)行代謝。L-甲硫氨酸、L-色氨酸、和L-酪氨酸都不能由CYP79A2進(jìn)行代謝。苯丙氨酸和酪氨酸都不能由CYP79B2進(jìn)行代謝。L-色氨酸、L-苯丙氨酸、和L-酪氨酸都不能由CYP79F1進(jìn)行代謝。D-氨基酸不能由CYP79D1、CYP79D2、CYP79E1、和CYP79E2轉(zhuǎn)變成肟。根據(jù)底物的性質(zhì)，還可以使用完整巴斯德畢赤酵母細(xì)胞或完整大腸桿菌細(xì)胞來(lái)測(cè)定底物特異性。
可以在包括下列步驟的測(cè)定法(參閱實(shí)施例5)中測(cè)試P450單加氧酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的能力(1)將包含本發(fā)明的P450單加氧酶或表達(dá)所述酶的大腸桿菌細(xì)胞的原生質(zhì)球、親本氨基酸、NADPH、氧、NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶、和脂質(zhì)的反應(yīng)混合物于環(huán)境溫度保溫一段時(shí)間(2分鐘與2-6小時(shí)之間)；(2)終止反應(yīng)，例如通過加入變性化合物諸如乙酸乙酯；并(3)化學(xué)鑒定和量化生成的醛肟。
本發(fā)明還提供了包含編碼依照本發(fā)明的新型蛋白質(zhì)的開放讀碼框的核酸化合物。所述核酸分子在結(jié)構(gòu)和功能上與可以由生成相似生物合成酶的植物獲得的核酸分子相似。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，開放讀碼框可操作連接一種或多種調(diào)控序列，所述調(diào)控序列不同于與包含開放讀碼框外顯子的基因組基因相連的調(diào)控序列，而且所述核酸分子能夠與由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4；SEQ ID NO10或SEQ IDNO12；SEQ ID NO40；SEQ ID NO55(對(duì)應(yīng)于編碼CYP79B2的擬南芥屬cDNA)、SEQ ID NO56(對(duì)應(yīng)于編碼CYP79B2的擬南芥屬基因組DNA)、或SEQ ID NO71(對(duì)應(yīng)于編碼CYP79B5的蕓苔屬cDNA)；SEQ ID NO75或SEQ ID NO85定義的DNA分子的片段發(fā)生雜交。所述片段的長(zhǎng)度超過20個(gè)核苷酸，優(yōu)選超過25、30、或50個(gè)核苷酸。影響雜種分子穩(wěn)定性的因素確定了雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)度，而且可以依賴所形成雜種分子的解鏈溫度Tm進(jìn)行測(cè)量。Tm的計(jì)算描述于幾種教科書。例如，Keller等人在《(DNA ProbesBackground，Applications，Procedures》(DNA探針背景、應(yīng)用、流程)(Macmillan出版有限公司，1993，第8-10頁(yè))中描述了在計(jì)算雜交反應(yīng)的Tm值時(shí)要考慮的因素。依照本發(fā)明的DNA分子能夠與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4；SEQID NO10或SEQ ID NO12；SEQ ID NO40；SEQ ID NO55、SEQ IDNO56、或SEQID NO71；SEQ ID NO75或SEQ ID NO85的片段在比將要形成的雜種分子的計(jì)算Tm低30℃的溫度發(fā)生雜交。優(yōu)選的是，它們能夠在比計(jì)算Tm低25、20、15、10、或5℃的溫度發(fā)生雜交。
依照本發(fā)明的核酸化合物是由獨(dú)立選自G、A、T、和C或獨(dú)立選自G、A、U、和C的核苷酸殘基組成的，且表征為通式RA-RB-RC，其中-RA、RB、和RC稱為成份序列；且-RB由至少450個(gè)、優(yōu)選600個(gè)、或更多核苷酸殘基組成，編碼上文所述氨基酸成份序列R2。
有關(guān)SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、和SEQ ID NO4；SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、和SEQ ID NO12；SEQ ID NO39和SEQ ID NO40；SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO70、和SEQ ID NO71；SEQ ID NO74、SEQ ID NO75、SEQ ID NO84、和SEQ ID NO85的知識(shí)可用于加快編碼P450單加氧酶的DNA的分離和生成，所述酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的醛肟，該方法包括(1)由表達(dá)這種單加氧酶的植物組織構(gòu)建cDNA文庫(kù)；(2)使用根據(jù)SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、或SEQ IDNO4；SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、或SEQ ID NO12；SEQ ID NO39或SEQ ID NO40；SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO70、或SEQ ID NO71；或SEQ IDNO74、SEQ ID NO75、SEQ ID NO84、或SEQ ID NO85設(shè)計(jì)的至少一種寡核苷酸由cDNA文庫(kù)擴(kuò)增部分P450單加氧酶cDNA；(3)任選使用根據(jù)SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、或SEQ ID NO4；SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、或SEQ ID NO12；SEQ ID NO39或SEQ ID NO40；SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO70、或SEQ ID NO71；或SEQ ID NO74、SEQ ID NO75、SEQ ID NO84、或SEQ ID NO85設(shè)計(jì)的一種或多種寡核苷酸在嵌套PCR反應(yīng)中由cDNA文庫(kù)擴(kuò)增部分P450單加氧酶cDNA；(4)使用在步驟(2)或(3)中獲得的DNA作為探針篩選由表達(dá)P450單加氧酶的植物組織構(gòu)建的DNA文庫(kù)，所述酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟；(5)鑒定并純化包含編碼蛋白質(zhì)的開放讀碼框的載體DNA，所述蛋白質(zhì)的特征為氨基酸序列與得自SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或二者；SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或二者；SEQ ID NO39；SEQ ID NO54或SEQ ID NO70或二者；或SEQ ID NO74或SEQ ID NO84或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示至少40％或50％、優(yōu)選55％、甚至更優(yōu)選70％同一性；并(6)任選進(jìn)一步處理純化的DNA，以實(shí)現(xiàn)例如蛋白質(zhì)在微生物像大腸埃希氏菌或巴斯德畢赤酵母中的異源表達(dá)，用于隨后分離單加氧酶、測(cè)定其底物特異性、或生成抗體。
在上述方法的步驟(2)和(3)中，用于擴(kuò)增的第二種寡核苷酸優(yōu)選是與用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)的載體DNA內(nèi)某一區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸。然而，也可以使用根據(jù)SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、或SEQID NO4；SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、或SEQ IDNO12；SEQ ID NO39或SEQ ID NO40；SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO70、或SEQ ID NO71；或SEQ ID NO74、SEQ ID NO75、SEQ ID NO84、或SEQ ID NO85設(shè)計(jì)的第二種寡核苷酸。編碼將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶的cDNA克隆或該克隆的片段還可單獨(dú)或聯(lián)合編碼其它蛋白質(zhì)(諸如屬于CYP79蛋白質(zhì)家族的其它蛋白質(zhì))的cDNA克隆或其片段而用于DNA芯片。這為監(jiān)測(cè)植物中生物或非生物因素對(duì)例如芥子油苷或含氰苷生物合成的誘導(dǎo)或抑制提供了簡(jiǎn)易方法。
此外，衍生自本發(fā)明序列的特異寡核苷酸序列可用作標(biāo)記輔助育種程序中的標(biāo)記或用于鑒定這些標(biāo)記。因此，本發(fā)明容許開發(fā)通過一種或多種寡核苷酸的雜交來(lái)選擇期望性狀的標(biāo)記輔助育種方法，其中至少一種所述寡核苷酸的序列構(gòu)成本發(fā)明公開的DNA的成份序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸由至少15個(gè)、優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸組成，且構(gòu)成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定法的成份。
作為轉(zhuǎn)基因表達(dá)的、編碼依照本發(fā)明的P450單加氧酶的DNA對(duì)更改植物中的芥子油苷或含氰苷生物合成特別有用。當(dāng)與屬于CYP71E家族的細(xì)胞色素P450酶(如來(lái)自高粱的CYP71E1或優(yōu)選來(lái)自木薯的相應(yīng)同系物)和UDP-葡萄糖氰醇葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶一起在無(wú)氰植物中表達(dá)編碼將脂肪族或芳香族氨基酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的細(xì)胞色素P450酶的基因時(shí)，獲得的轉(zhuǎn)基因植物將是生氰的。將編碼將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的細(xì)胞色素P450酶的基因?qū)肷山孀佑蛙盏闹参镂锓N的方法可用于改變所述植物中的芥子油苷生成(如由選定轉(zhuǎn)基因植物中個(gè)別芥子油苷的整體水平或含量的改變所觀察到的)。若作為所導(dǎo)入細(xì)胞色素P450酶的底物的脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物先前不能由該植物物種中其它細(xì)胞色素P450識(shí)別成底物，則在轉(zhuǎn)化植物中導(dǎo)入了新的芥子油苷。同樣，將編碼將脂肪族或芳香族氨基酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的細(xì)胞色素P450酶的基因?qū)肷柚参锏姆椒捎糜诟南惹按嬖诘暮柢盏恼w水平和分布，及用于在植物中導(dǎo)入一種或多種其它含氰苷。
用于提供組成性、誘導(dǎo)性、或組織特異性基因表達(dá)的啟動(dòng)子的正確選擇提供了獲得具有期望疾病或食草動(dòng)物應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因植物的手段。同樣，可以使用相同基因的反義或核酶技術(shù)來(lái)更改或降低植物中芥子油苷或含氰苷的含量。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供轉(zhuǎn)基因植物，包括將依照本發(fā)明的P450單加氧酶的至少部分開放讀碼框穩(wěn)定整合到它們的基因組DNA中，所述酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟。可以通過包括下列步驟的方法生成這些植物(1)將包含依照本發(fā)明的P450單加氧酶的至少部分開放讀碼框的DNA導(dǎo)入能夠再生成完整植株的植物細(xì)胞或組織，所述酶將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟；并(2)選擇轉(zhuǎn)基因植物。
優(yōu)選的是，所述方法或是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因表達(dá)所述P450單加氧酶的植物，或是產(chǎn)生內(nèi)源P450單加氧酶表達(dá)降低的植物，或是產(chǎn)生芥子油苷或含氰苷的生成降低的植物。
實(shí)施例實(shí)施例1木薯CYP79探針的PCR擴(kuò)增和文庫(kù)篩選根據(jù)催化L-纈氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450酶屬于CYP79家族這一假設(shè)，設(shè)計(jì)了針對(duì)CYP79A1(高粱)、CYP79B1(歐白芥(Sinapis alba))、和CYP79B2(擬南芥)中顯示序列保守性的區(qū)域的簡(jiǎn)并引物。引物設(shè)計(jì)中排除了推定參與底物識(shí)別的結(jié)構(gòu)域，因?yàn)樵谝阎腃YP79中沒有一種利用纈氨酸或異亮氨酸作為底物。
總體積20μl的第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)是在10mM Tris-HCl pH9、50mMKCl、1.5mM MgCl2中使用0.5U Taq DNA聚合酶(Pharmacia，瑞典)、200μM dATP、200μM dCTP、200μM dGTP、200μM dTTP、500nM每種引物5’-GCGGAATTCARGGIAAYCCIYTICT-3’(SEQ ID NO5)和5’-CGCGGATCCGGDATRTCIGAYTCYTG-3’(SEQ ID NO6)(其中I表示肌苷)、和10ng質(zhì)粒DNA模板進(jìn)行的。質(zhì)粒DNA模板是由pcDNA2.1(Invitrogen，荷蘭)中的單向質(zhì)粒cDNA文庫(kù)制備的，而所述cDNA文庫(kù)又是由木薯植物芽尖的未成熟折疊葉片和葉柄構(gòu)建的。熱循環(huán)參數(shù)是首先變性，95℃ 2min；3個(gè)循環(huán)，95℃ 5sec、40℃ 30sec、72℃ 45sec；32個(gè)循環(huán)，95℃ 5sec、50℃ 5sec、72℃ 45sec；最后延伸，72℃ 5min。用巴斯德移液管戳出預(yù)期大小210bp的條帶，并用于在50μl上文所述相同反應(yīng)混合液中進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，只是熱循環(huán)參數(shù)改成首先變性，95℃ 2min；20個(gè)循環(huán)，95℃ 5sec、50℃ 5sec、72℃ 45sec；最后延伸，72℃ 5min。使用Thermo Sequenaseradiolabled terminator cycle sequencing kit即耐熱測(cè)序酶放射性標(biāo)記終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham，瑞典)和α-33P-ddNTP(Amersham，瑞典)，依照制造商的指示，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
通過PCR擴(kuò)增用洋地黃毒苷-11-dUTP(Boehringer，曼海姆，德國(guó))標(biāo)記基因特異片段，并用作探針及使用DIG系統(tǒng)(Boehringer，曼海姆，德國(guó))篩選木薯cDNA文庫(kù)。將探針于68℃在5x SSC、0.1％ N-肉桂酰肌氨酸、0.02％ SDS、1％封閉劑(Boehringer，曼海姆，德國(guó))中雜交過夜。檢測(cè)前，用0.1x SSC、0.1％ SDS于65℃清洗濾膜。實(shí)施例2CYP79D1和CYP79D2的測(cè)序和Southern印跡分析使用依照實(shí)施例1獲得的探針由木薯cDNA文庫(kù)分離了兩個(gè)相等豐度的全長(zhǎng)克隆。它們具有編碼61.2和61.3kDa的P450的開放讀碼框。將這些P450稱為CYP79D1和CYP79D2，作為新的CYP79D亞家族的最初兩個(gè)成員。
使用Thermo Sequenase Fluorescent-labled Primer cyclesequencing kit即耐熱測(cè)序酶熒光標(biāo)記引物循環(huán)測(cè)序試劑盒(7-脫氮dGTP)(Amersham，瑞典)和ALF-Express sequenator即快速測(cè)序儀(Pharmacia，瑞典)進(jìn)行測(cè)序。使用GCG Wisconsin Sequence AnalysisPackage即GCG威斯康星序列分析軟件包的程序進(jìn)行序列計(jì)算機(jī)分析。兩種木薯P450有85％同一，而且都與CYP79A1分享54％的同一性。將在氨基酸水平顯示超過40％但不足55％序列同一性的P450分到相同家族但不同亞家族。
CYP79D1和CYP79D2中的血紅素結(jié)合基元是TFSTGRRGCVA(CYP79D1的第470-480位殘基)，相比于A型P450(Durst等人，Drug MetabolDrug Interac，12189-206，1995)的共有序列PFGXGRRXCXG包含3個(gè)氨基酸替代。在CYP79A1中也發(fā)現(xiàn)了下劃線所示替代，而CYP79D1和CYP79D2血紅素結(jié)合基元中的第一個(gè)T在CYP79A1、CYP79B1、和CYP79B2中是S。因而，與先前提出的CYP79家族中存在獨(dú)有的血紅素結(jié)合序列結(jié)構(gòu)域是抵觸的。在CYP79D1和CYP79D2中還找到了另一獨(dú)特序列結(jié)構(gòu)域PERH(CYP79D1的第450-453位殘基)，其中有人提出H是CYP79家族特異的。
為了測(cè)定CYP79D1和CYP79D2的拷貝數(shù)，對(duì)木薯栽培載培品種MCol22的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡。如Chen等人在《MaizeHandbook》(玉米手冊(cè)，F(xiàn)reeling等人編，Springer Verlag，紐約，1994)中所述，由木薯栽培載培品種MCol22的葉片純化基因組DNA。將DNA在Genomic-tip 100/G(Qiagen，德國(guó))上進(jìn)一步純化，用消化酶消化，并在0.6％瓊脂糖凝膠(1x TAE)上電泳(10μg DNA/泳道)。將凝膠轉(zhuǎn)至尼龍膜(Boehringer，曼海姆，德國(guó))，并于68℃與放射性標(biāo)記的CYP79D1或CYP79D2克隆進(jìn)行雜交。雜交后，將濾膜用2x SSC、0.1％ SDS于室溫清洗兩次，再用0.1x SSC、0.1％ SDS于68℃清洗兩次。使用Storm 840 phosphor imager即磷光體成像儀(MolecularDynamics，加州，美國(guó))將放射性標(biāo)記的條帶顯影。使用Random PrimedDNA Labeling Kit即隨機(jī)引發(fā)DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer，曼海姆，德國(guó))用α-33p-dCTP標(biāo)記用于Southern雜交的探針。兩種探針與Southern印跡上的不同條帶發(fā)生雜交，證明MCol22基因組中存在這兩種基因?；蛑g的高度相似性導(dǎo)致微弱交叉雜交。低嚴(yán)謹(jǐn)度清洗(0.5x SSC、0.1％ SDS，55℃)未揭示有CYP79D基因的其它拷貝。實(shí)施例3在巴斯德畢赤酵母中的重組表達(dá)包含CYP79D1或CYP79D2的重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建是使用載體pPICZc(Invitrogen，荷蘭)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。該載體包含用于控制基因表達(dá)的甲醇誘導(dǎo)性AOX1啟動(dòng)子，并編碼針對(duì)zeocin的抗性，用于實(shí)現(xiàn)CYP79D1或CYP79D2在巴斯德畢赤酵母野生型菌株X-33(Invitrogen，荷蘭)中的胞內(nèi)表達(dá)。將大腸桿菌菌株TOP10F’用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和增殖。
通過PCR導(dǎo)入XhoI位點(diǎn)，緊挨CYP79D1終止密碼子的下游。用XhoI和BsmBI消化PCR產(chǎn)物，后一種酶切割于起始密碼子ATG下游18bp處。用BstBI和XhoI消化pPICZc。使用由下列寡聚物退火而成的銜接頭將載體和PCR產(chǎn)物連接起來(lái)5′-CGAAACGATGGCTATGAACGTCTCT-3’(SEQ ID NO7；有義方向)和5’-TGGTAGAGACGTTCATAGCCATCGTTT-3’(SEQ ID NO8)。銜接頭一方面重建了CYP79D1的前18bp(下劃線指示起始密碼子)并導(dǎo)入了兩個(gè)沉默突變，另一方面通過BstBI消化除去了一小段載體序列，從而像高度表達(dá)的AOX1基因產(chǎn)物一樣正確安置CYP79D1起始密碼子。以相似方式使用相同銜接頭將CYP79D2克隆到pPICZc中，因?yàn)镃YP79D1和CYP79D2編碼序列的前24bp是相同的。
巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化是使用EasySelect Pichia expressionKit Version A即簡(jiǎn)易選擇畢赤酵母表達(dá)試劑盒A型(Invitrogen，荷蘭)依照制造商的指示進(jìn)行電穿孔而實(shí)現(xiàn)的。通過在巴斯德畢赤酵母菌落上進(jìn)行的PCR確認(rèn)了CYP79D1或CYP79D2在zeocin抗性菌落中的存在。
將巴斯德畢赤酵母單菌落在25ml BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.1M KPi pH6.0、1.34％酵母氮堿、4x10-5％生物素、1％甘油、100μg/ml zeocin)中于28℃、以220rpm培養(yǎng)大約22小時(shí)。通過于室溫以1500g離心10分鐘收獲細(xì)胞，并接種裝有300ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基(即含1％甲醇代替甘油的BMGY)的2L帶擋板燒瓶，OD600達(dá)到0.5。將培養(yǎng)物于28℃以300rpm培養(yǎng)28小時(shí)，并在26小時(shí)后加入甲醇至0.5％。通過于4℃以3000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞，并用緩沖液A(50mM KPi pH7.9、1mM EDTA、5％甘油、2mM DTT、1mM苯甲基磺酰氟)清洗一次，然后在緩沖液A中重懸至OD600達(dá)到130。加入等體積的經(jīng)酸洗的玻璃珠，并通過渦旋(8x30sec、4℃并立即在冰上冷卻)破碎細(xì)胞。將裂解物于4℃以12000g離心10分鐘，以除去細(xì)胞碎片，并將得到的上清液于4℃以165000g離心1小時(shí)，以回收微粒體沉淀。將微粒體重懸于緩沖液A，保存于-80℃，臨使用前在冰上解凍。
由重組酵母細(xì)胞將L-纈氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的能力證明，CYP79D1和CYP79D2在巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行功能性表達(dá)。使用僅用載體轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞不發(fā)生轉(zhuǎn)變。在完整細(xì)胞中測(cè)量到代謝活性，證明巴斯德畢赤酵母內(nèi)源還原酶系統(tǒng)能夠支持將電子供給這些植物P450。由將L-纈氨酸積極轉(zhuǎn)變成纈氨酸肟的細(xì)胞制備的微粒體的SDS-PAGE顯示，存在對(duì)應(yīng)于CYP79D1 cDNA克隆預(yù)期分子量62kDa而遷移的其它多肽條帶。
關(guān)于完整巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中的CYP79D1活性，通過在豐富培養(yǎng)基中的培養(yǎng)和在OD 0.5時(shí)誘導(dǎo)24-30小時(shí)而獲得了最佳結(jié)果。每升培養(yǎng)物生成15-30nmol微粒體CYP79D1。誘導(dǎo)90小時(shí)后微粒體CYP79D1的產(chǎn)量是24小時(shí)后獲得的50％。實(shí)施例4重組CYP79D1的純化除非另外申名，所有步驟都是在4℃進(jìn)行的。通過一氧化碳差異光譜學(xué)、SDS-PAGE、和活性測(cè)量來(lái)鑒定含CYP79D1級(jí)分。
以巴斯德畢赤酵母微粒體作為起始材料，以TX-114相分配(Bordier，J Biol Chem，2561604-1607，1981；Werck-Reichhart等人，Anal Biochem，197125-131，1991)作為純化第一步，分離重組CYP79D1。相分配混合物包含微粒體蛋白質(zhì)(4mg/ml)、50mM KPipH7.9、1mM DTT、30％甘油、和1％ TX-114。于4℃攪動(dòng)30分鐘后，通過溫度變化和于22℃以24500g離心25分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)相分離。收集微紅的富含TX-114的上層相，并用1％ TX-114再次抽提TX-114較少的下層相。合并富含相，并用緩沖液B(10mM KPi pH7.9、2mM DTT)稀釋至TX-114濃度低于0.2％。以流速25ml/h將TX-114富含相應(yīng)用于串聯(lián)的DEAE-Sepharose FF(Pharmacia，瑞典)的2.6×2.8cm柱和ReactiveRed120瓊脂糖(Sigma，密蘇里州，美國(guó))的1.6×3cm柱。兩種柱子都是用緩沖液C(10mM KPi pH7.9、10％甘油、0.2％ TX-114、2mM DTT)平衡的。加樣后，用緩沖液C徹底(過夜)清洗柱子。CYP79D1在這些條件下不結(jié)合到離子交換柱上，通過梯度洗脫(50ml溶于緩沖液C的0-1.5M KCl)由Reactive Red120瓊脂糖洗脫。合并包含相當(dāng)純的CYP79D1的級(jí)分，在緩沖液C中透析過夜，并應(yīng)用于用緩沖液C平衡的Reactive Yellow 3A瓊脂糖(Sigma，密蘇里州，美國(guó))。用緩沖液C清洗柱子，并通過梯度洗脫(50ml溶于緩沖液的0-1.5M KCl)獲得CYP79D1。合并包含均質(zhì)CYP79D1的級(jí)分，并在緩沖液D(10mM KPipH7.9、10％甘油、50mM NaCl、2mM DTT)中透析2小時(shí)以減少鹽和去污劑。將CYP79D1分裝保存于-80℃。
使用高Tris線性8-25％梯度凝膠(Fling等人，Anal Biochem，15583-88，1986)進(jìn)行SDS-PAGE。在SLM Aminco DW-2000 TM分光光度計(jì)(Spectronic Instruments，紐約，美國(guó))上通過一氧化碳差異光譜學(xué)對(duì)總P450定量，還原型P450和一氧化碳之間的加合物的摩爾消光系數(shù)為91mM-1cm-1(Omura等人，J Biol Chem，2495019-5026，1964)。依照J(rèn)efcoate的方法(Jefcote，Methods Enzymol，27258-279，1978)記錄50mM KPi pH7.9、50mM NaCl中的底物結(jié)合光譜。
純化的CYP79D1以62kDa分子量遷移。分離流程的總產(chǎn)量是17％，即由260ml培養(yǎng)物獲得1nmol CYP79D1。在進(jìn)行CO差異光譜學(xué)時(shí)，始終在448nm產(chǎn)生吸收最大值。無(wú)論是使用分離的還是粗制的級(jí)分，在420nm都沒有觀察到最大值。這證明CYP79D1是相當(dāng)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。酵母細(xì)胞色素可能干預(yù)粗制提取物的光譜學(xué)，并掩藏420nm小峰，而且先前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了巴斯德畢赤酵母細(xì)胞色素氧化酶會(huì)妨礙P450光譜學(xué)。在本發(fā)明的研究中，CYP79D1的表達(dá)水平是高的，而且由細(xì)胞色素氧化酶產(chǎn)生的CO差異光譜(最大值在430nm，最小值在445nm)是明顯的，為450nm峰上的肩。巴斯德畢赤酵母細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合DEAE柱，因而在P450分離過程中被除去。延長(zhǎng)巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng)時(shí)間(90小時(shí))后，細(xì)胞色素氧化酶的含量降低，從而可以在微粒體中檢測(cè)到較低量的P450。最后，可以通過在硼酸鹽緩沖液中進(jìn)行的TX-114相分配由P450除去干擾性細(xì)胞色素氧化酶。在硼酸鹽緩沖液中相分配后，P450分配至TX-114貧乏相，而巴斯德畢赤酵母細(xì)胞色素氧化酶分配至富含相。
純化的CYP79D1在存在L-纈氨酸時(shí)形成I型底物結(jié)合光譜，即在結(jié)合底物后44％由低自旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成高自旋狀態(tài)。實(shí)施例5催化活性的測(cè)定重建分離的重組CYP79D1，并在體外使用含2.5pmol CYP79D1、0.05U NADPH P450氧化還原酶(Benveniste等人，Biochem J，235365-373，1986)、10.6mM L-α-二油酰磷脂酰膽堿、0.35μCi[U-14C]-L-氨基酸(L-Val、L-Ile、L-Leu、L-Tyr、或L-Phe；Amersham，瑞典)、1mM NADPH、0.1M NaCl、和20mM KPi pH7.9的總體積30μl的反應(yīng)混合液測(cè)定其催化活性。在含14C-L-纈氨酸或14C-L-異亮氨酸的測(cè)定法中，加入了不同量的未標(biāo)記L和D-氨基酸(0-6mM)。于30℃保溫10分鐘后，用60μl乙酸乙酯萃取形成的產(chǎn)物，并在TLC片(MerckKieselgel 60F254)上分離，其中使用正戊烷/二乙醚(50∶50，v/v)或甲苯/乙酸乙酯(5∶1，v/v)分別作為脂肪族化合物和芳香族化合物的洗脫液。將14C標(biāo)記的肟顯影，并使用Storm 840磷光體成像儀(Molecular Dynamics，加州，美國(guó))定量。另外在上文所述相同條件下在存在抑制劑tetcyclasis、ABT、和DPI時(shí)測(cè)量CYP79D1的活性。
為了進(jìn)行體外活性測(cè)定法，沉淀200μl巴斯德畢赤酵母細(xì)胞，并重懸于100μl 50mM Tricine pH7.9和0.35μCi[U-14C]-L-纈氨酸或L-異亮氨酸。于30℃保溫30分鐘后，用乙酸乙酯萃取細(xì)胞，并如上所述分析形成的產(chǎn)物。
在存在大量脂質(zhì)L-α-二油酰磷脂酰膽堿和100mM NaCl時(shí)用高粱NADPH-P450氧化還原酶重建CYP79D1。對(duì)在植物中用作含氰苷生物合成前體的五種蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)試作為CYP79D1的底物的情況。由L-纈氨酸或L-異亮氨酸形成了相應(yīng)的肟。在使用L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、或L-酪氨酸作為底物時(shí)，在檢測(cè)水平等于用L-纈氨酸觀察到的代謝的0.8％的情況下沒有明顯的代謝。觀察到的底物特異性符合木薯體內(nèi)只存在由L-纈氨酸和L-異亮氨酸衍生的含氰苷的現(xiàn)象。
為了檢查抑制劑對(duì)分離CYP79D1的影響，使用與木著微粒體相同的條件在存在tetcyclasis、ABT、和DPI時(shí)進(jìn)行重建。使用分離CYP79D1觀察到與木薯微粒體中相同的模式。CYP79D1受到tetcyclasis而非ABT的抑制。與木薯微粒體中的情況相似，DPI通過抑制NADPH-P450氧化還原酶而完全抑制纈氨酸-肟的形成。
在使用木薯微粒體時(shí)，以L-纈氨酸和L-異亮氨酸作為底物而產(chǎn)生氰化物，而使用D-纈氨酸和D-異亮氨酸時(shí)觀察不到代謝。在使用L-纈氨酸時(shí)觀察到與L-異亮氨酸相比更高的轉(zhuǎn)變率，這與使用由變白的木薯幼苗制備的微粒體得到的數(shù)據(jù)是相似的。分離的CYP79D1由14C-L-纈氨酸產(chǎn)生14C標(biāo)記的纈氨酸-肟。當(dāng)通過加入未標(biāo)記L-纈氨酸而將14C-L-纈氨酸底物的比活性降低120倍時(shí)，觀察到14C標(biāo)記的肟的形成量相應(yīng)降低。然而，向保溫混合物中加入未標(biāo)記D-纈氨酸不引起14C標(biāo)記肟的形成量的相應(yīng)降低。因此，木薯微粒體與分離的CYP79D1都不能代謝D-纈氨酸。D-纈氨酸不能競(jìng)爭(zhēng)L-纈氨酸說(shuō)明D-纈氨酸不能以高親和力結(jié)合CYP79D1的結(jié)合位點(diǎn)。使用14C-L-異亮氨酸、L-異亮氨酸、和D-異亮氨酸獲得了相似結(jié)果。
在飽和底物條件下，CYP79D1在以L-纈氨酸作為底物時(shí)具有較高轉(zhuǎn)變率。L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)變率是用L-纈氨酸觀察到的值的大約60％。這與木薯體內(nèi)亞麻苦苷相比于百脈根苷有更高積累的現(xiàn)象是一致的(4)。實(shí)施例6CYP79D1的N端測(cè)序如Kahn等人，J Biol Chem，27132944-32950，1996中所述，將分離的重組CYP79D1進(jìn)行SDS-PAGE，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至ProBlot膜(Applied Biosystems，加州，美國(guó))。由膜上切下考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白質(zhì)條帶，并在配備了聯(lián)機(jī)120A型乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸分析儀的Applied Biosystems 470A型測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。在預(yù)計(jì)的Edman降解循環(huán)中，因Asn信號(hào)的缺乏而檢測(cè)到Asn糖基化。
產(chǎn)生CO光譜且包含CYP79D1活性的級(jí)分總是在SDS-PAGE后產(chǎn)生兩種獨(dú)特的、靠近遷移的多肽條帶。N端氨基酸測(cè)序鑒定得出兩條帶都衍生自CYP79D1。起始甲硫氨酸被酵母加工系統(tǒng)切除。上面那條帶前15個(gè)殘基的測(cè)序證明兩個(gè)天冬酰胺都存在糖基化，而下面那條帶只有第一個(gè)天冬酰胺發(fā)生糖基化。不同的糖基化模式解釋了存在兩條帶的原因。CYP79D1 N端部分的糖基化與N端在易進(jìn)行糖基化機(jī)制的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中的定位是一致的。尚不知道在木薯中天然CYP79D1是否糖基化。然而，N端片段的氨基酸測(cè)序(15)證明，由高粱幼苗純化的CYP79D1未糖基化，而且只有少數(shù)報(bào)導(dǎo)顯示存在微粒體P450糖基化。認(rèn)為在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)重組CYP79D1后觀察到的糖基化反映了酵母系統(tǒng)中的表達(dá)。實(shí)施例7實(shí)施例8和9中所用的引物
a以5′-3′方向顯示序列。bF正向引物，R反向引物。e覆蓋在兩個(gè)克隆#1和#2中相同的序列。f覆蓋兩個(gè)克隆#1和#2的特異序列。
bF正向引物，R反向引物。c用于設(shè)計(jì)引物的氨基酸共有序列。dpcDNA2.1的特異引物，正好位于cDNA文庫(kù)5’端插入位點(diǎn)的上游。e覆蓋兩個(gè)克隆#1和#2中相同的序列。f覆蓋兩個(gè)克隆#1和#2的特異序列。g#1中5’UTR的特異引物。h星號(hào)表示終止密碼子。實(shí)施例8海韭菜CYP79基因的cDNA克隆用于生成海韭菜CYP79同源物的cDNA片段的PCR方法單向質(zhì)粒cDNA文庫(kù)是由InVitrogen(卡爾斯巴德，加州)使用包含lacZ啟動(dòng)子的表達(dá)載體pcDNA2.1由海韭菜的花和果實(shí)(分裂果)構(gòu)建的。植物材料是在Southern Amager的Aflandshage在resund海濱收集的，立即在液氮中冷凍，并保存于-80℃。
根據(jù)衍生自S.bicolor的CYP79A1(GenEMBL U32624)、衍生自歐白芥的CYP79B1(GenEMBL AF069494)、衍生自擬南芥的CYP79B2、和衍生自木薯(Manihot esculenta)的CYP79D1(GenEMBL AF140613)的PCR片段中的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并PCR引物。在50μl總體積中使用100pmol每種引物、5％二甲亞砜、200μM dNTP、和2.5U Taq DNA聚合酶在PCR緩沖液(50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.8、1.5mM MgCl2、0.1％ Triton X-100)中進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。熱循環(huán)參數(shù)是首先95℃2min；然后30個(gè)循環(huán)95℃ 5sec、45℃ 30sec、72℃ 45sec；最后72℃ 5min。第一輪PCR反應(yīng)是使用引物1F和1R(實(shí)施例7)在100ng由cDNA文庫(kù)制備的模板DNA或使用Nucleon Phytopure Plant DNAExtraction Kit(Amersham)制備的基因組DNA上進(jìn)行的。使用QIAquickPCR Purification Kit即QIA快速PCR純化試劑盒(Qiagen)純化PCR產(chǎn)物，用30μl 10mM Tris-HCl pH8.5洗脫，并作為模板(1μl)用于第二輪PCR反應(yīng)。第二輪PCR是使用衍生自cDNA和基因組DNA二者的PCR片段并使用簡(jiǎn)并引物2F和2R(實(shí)施例7)進(jìn)行的。將一部分(5μl)PCR反應(yīng)液應(yīng)用于1.5％瓊脂糖/TBE凝膠，并觀察到以cDNA和基因組DNA二者作為模板的預(yù)期大小大約200bp的條帶。使用QIAquick PCRPurification Kit即QIA快速PCR純化試劑盒純化剩余PCR反應(yīng)液，并用30μl 10mM Tris-HCl pH8.5洗脫。用EcoRI和BamHI消化純化的PCR片段(5μl)，由1.5％瓊脂糖/TBE凝膠切下，使用QIAEX II AgaroseGel Extraction Kit即QIAEX II瓊脂糖凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化，并連接到經(jīng)EcoRI和BamHI消化的pBluescript II SK載體(Stratagene)中。使用Thermo Sequenase Fluorescent-labledPrimer cycle sequencing kit即耐熱測(cè)序酶熒光標(biāo)記引物循環(huán)測(cè)序試劑盒和7-脫氮dGTP(Amersham，瑞典)，將由cDNA文庫(kù)衍生的7個(gè)克隆和由基因組DNA衍生的3個(gè)克隆測(cè)序(ALF Express，Pharmacia)。使用GCG Wisconsin Sequence Analysis Package即GCG威斯康星序列分析軟件包中的程序進(jìn)行序列分析。由海韭菜的花和果實(shí)構(gòu)建的質(zhì)粒cDNA文庫(kù)的篩選cDNA和基因組DNA都產(chǎn)生與其它已知CYP79序列高度類似的相同PCR片段。將克隆的PCR片段作為模板，使用商品化的T3和T7引物通過PCR產(chǎn)生350bp洋地黃毒苷-11-dUTP標(biāo)記的探針(TRI1)。將標(biāo)記探針用于篩選pcDNA2.1 cDNA文庫(kù)的660,000個(gè)菌落。于68℃在5x SSC(0.75M NaCl、75mM檸檬酸鈉pH7.0)、0.1％N-肉桂酰肌氨酸、0.02％十二烷基磺酸鈉、和1％封閉劑(Boehringer，曼海姆)中雜交過夜。將膜在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件(65℃，0.1x SSC、0.1％十二烷基磺酸鈉)下清洗兩次，與抗洋地黃毒苷-AP一起保溫，并依照Boehringer(曼海姆)的指示使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯和氮藍(lán)四唑顯影。在相同條件下重篩選陽(yáng)性菌落，并對(duì)陽(yáng)性單菌落進(jìn)行測(cè)序和分析。設(shè)計(jì)用于篩選全長(zhǎng)克隆的5’端探針的PCR方法上文所述文庫(kù)篩選產(chǎn)生了兩個(gè)非常相似的部分克隆，稱為#1和#2，它們的N端序列是不同的。為了由pcDNA2.1文庫(kù)分離相應(yīng)的全長(zhǎng)克隆，使用上文所述相同PCR條件(只是將退火溫度設(shè)成55℃)進(jìn)行了兩輪連續(xù)PCR反應(yīng)。第一輪PCR反應(yīng)是使用引物3F和3R(實(shí)施例7)進(jìn)行的，并使用100ng cDNA文庫(kù)作為模板。將第一輪PCR反應(yīng)的純化PCR產(chǎn)物(QIAquick PCR Purification Kit即QIA快速PCR純化試劑盒)用作第二輪PCR反應(yīng)的模板(1μl)，其中使用引物4R#1或4R#2和引物3F(實(shí)施例7)。將第二輪的PCR片段在2％瓊脂糖/TBE上分開，由凝膠切下遷移最慢的條帶，純化(QIAE II Agarose Gel Extraction Kit即QIAE II瓊脂糖凝膠提取試劑盒)，EcoRI和BamHI消化，克隆到pBluescript II SK中，并測(cè)序。使用引物4R#1和3F(實(shí)施例7)的第二輪PCR獲得了具有位于EcoRI克隆位點(diǎn)下游26個(gè)氨基酸處的推定起始甲硫氨酸的PCR片段。使用引物4R#2和3F(實(shí)施例7)的第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)生了長(zhǎng)度與早就用TRI1探針分離的部分cDNA克隆完全一樣的PCR片段。結(jié)果，將用4R#1和3F克隆的PCR片段作為模板，使用引物5F#1和5R#1(實(shí)施例7)產(chǎn)生洋地黃毒苷-11-dUTP標(biāo)記的探針(TRI2)。使用上文所述相同條件，將部分覆蓋克隆#1的5’非翻譯區(qū)(UTR)和開放讀碼框5’末端的TRI2與TRI1探針一起用于篩選pcDNA2.1文庫(kù)。第一份浸提物用TRI2進(jìn)行雜交，第二份用TRI1雜交。在篩選了1,000,000個(gè)菌落后，分離得到長(zhǎng)度與PCR片段完全一樣的2個(gè)單獨(dú)cDNA克隆。結(jié)果根據(jù)CYP79A1和屬于CYP79家族的推定N-羥化酶的序列比對(duì)，設(shè)計(jì)了覆蓋兩個(gè)CYP79特異區(qū)域的4種簡(jiǎn)并寡核苷酸引物(實(shí)施例7中描述的1F、2F、1R、2R)，并用于以由海韭菜花和果實(shí)制備的基因組DNA和cDNA作為模板的嵌套PCR反應(yīng)。由兩種模板擴(kuò)增到預(yù)期大小(即大約200bp)且在氨基酸水平顯示與CYP79序列有62-70％同一性的PCR片段，對(duì)其克隆，并進(jìn)一步用于篩選cDNA文庫(kù)。分離得到兩個(gè)cDNA克隆，稱為#1和#2，并通過序列比較證實(shí)與CYP79家族分享高度序列同一性。使用克隆特異PCR引物，分離得到對(duì)應(yīng)于#1的全長(zhǎng)克隆。開放讀碼框編碼分子量60.8kDa的蛋白質(zhì)。克隆#1與克隆#2的全長(zhǎng)序列的比較揭示，克隆#2的5’端短6bp，但是包含在相當(dāng)于克隆#1指定為第26位氨基酸殘基的位置處發(fā)現(xiàn)有克隆#1中未曾見到的甲硫氨酸密碼子。這個(gè)甲硫氨酸密碼子周圍的序列不符合單子葉植物起始密碼子的一般序列情況。因此最有可能的是克隆#2與全長(zhǎng)相比缺乏6bp。
由克隆#1和#2編碼的細(xì)胞色素P450顯示與早就知道的CYP79家族成員有44-48％同一性(見下表)，因此鑒定成新的亞家族CYP79E的最早兩個(gè)成員，稱為CYP79E1(SEQ ID NO9)和CYP79E2(SEQ ID NO11)。CYP79E1與CYP79E2之間的序列同一性是94％。
表CYP79家族的6個(gè)成員之間的同一性和相似性百分比
實(shí)施例9在大腸桿菌中的重組表達(dá)表達(dá)構(gòu)建物將表達(dá)載體pSP19g10L用于在大腸桿菌中表達(dá)CYP79E1和CYP79E2構(gòu)建物。該表達(dá)載體包含lacZ啟動(dòng)子并融合T7噬菌體基因10的短前導(dǎo)序列(g10L)，而且已經(jīng)顯示在大腸桿菌中有效表達(dá)異源蛋白(Olins等人，Methods Enzymol，185115-119，1990)。在細(xì)胞色素P450的情況中，通過修飾開放讀碼框的5’端以提高A和T的含量(Stormo等人，Nucleic Acids Res，102971-2996，1982；Schauder等人，Gene，7859-72，1989；Barnes等人，Proc Natl Acad Sci USA，885597-5601，1991)并通過用牛P45017α(Barnes等人，Proc NatlAcad Sci USA，885597-5601，1991)或人P4502E1或2D6(Gillam等人，Arch Biochem Biophys，31259-66，1994；Gillam等人，Arch Biochem Biophys，319540-550，1995)N端序列的密碼子替代5’端的許多密碼子，從而獲得表達(dá)水平的升高。為了利用這些知識(shí)，構(gòu)建了許多不同的構(gòu)建物。
使用Pwo聚合酶(Boehinger，曼海姆)通過PCR產(chǎn)生了克隆#1的3種不同構(gòu)建物，在起始密碼子處導(dǎo)入NdeI限制性位點(diǎn)，緊挨終止密碼子的后面導(dǎo)入HindIII限制性位點(diǎn)。使用引物6F#1(na)和6R#1(實(shí)施例1)合成了編碼天然CYP79E1的全長(zhǎng)構(gòu)建物(CY79E1na)，其在第3和5位密碼子處引入了沉默突變以提高AT含量。使用引物6F#1(Δ(1-31)17 α(8aa))和6R#1或引物6F#1(Δ(1-52)2E1(10aa))和6R#1(實(shí)施例7)構(gòu)建了2種截短構(gòu)建物。構(gòu)建物CYP79E1Δ(1-31)17α(8aa)編碼其中用P45017α(Halkier等人，Arch Biochem Biophys，322369-377，1995；Barnes等人，Proc Natl Acad Sci USA，885597-5601，1991)的8個(gè)富含AT密碼子替代天然5’序列的31個(gè)密碼子的CYP79E1截短形式；在構(gòu)建物CYP79E1Δ(1-52)2E1(10aa)中，用P4502E1的10個(gè)富含AT密碼子替代天然5’序列的前52個(gè)密碼子，并在第53和55位密碼子處導(dǎo)入沉默突變。用NdeI和HindIII消化PCR片段，并連接到經(jīng)NdeI和HindIII消化的pSP19g10L表達(dá)載體(Barnes，Methods Enzymol，2723-14，1996)中。將獨(dú)有限制性位點(diǎn)NcoI和PmlI用于用cDNA克隆的類似片段替代PCR片段(1045bp)的中部。將構(gòu)建物中衍生自PCR的剩余部分測(cè)序以排除PCR錯(cuò)誤。
因?yàn)榉蛛x得到的CYP79E2克隆符合載體pcDNA2.1中l(wèi)acZ基因的前24個(gè)密碼子的讀碼框，所以作為第四種構(gòu)建物測(cè)試這個(gè)克隆，稱為CYP79E2lacZ(24aa)。為了比較，還制備了等同的第五種構(gòu)建物CYP79E1Δ(1-2)lacZ(24aa)。
所有構(gòu)建物都包含在最高度表達(dá)的大腸桿菌基因中發(fā)現(xiàn)的原始終止序列TAAT。使用載體pSP19g10L的所有構(gòu)建物都除去了它們的3’UTR，因?yàn)閾?jù)報(bào)導(dǎo)包含3’UTR會(huì)阻止或降低某些基因的表達(dá)。在基于pcDNA2.1的構(gòu)建物中，保留了3’UTR。在大腸桿菌中的表達(dá)將所有表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM109(Stratagene)和XL-1 blue(Stratagene)中。在所有情況中，JM109菌株證實(shí)是最有效的。
CYP79E1和CYP79E2包含19和17個(gè)在大腸桿菌基因中罕見的AGA或AGG精氨酸密碼子。在密碼子發(fā)生率與tRNA含量之間已建立了強(qiáng)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)。因此，將克隆#1的天然和Δ(1-52)2E1(10aa)構(gòu)建物以及克隆#2的構(gòu)建物與編碼罕見精氨酸密碼子tRNA基因的pSBET(Schenk等人，BioTechniques，19196-200，1995)一起共轉(zhuǎn)化到JM109中。將單菌落在LB培養(yǎng)基(50μg/ml氨芐青霉素)中于37℃以225rpm培養(yǎng)過夜，并用于接種100倍體積的修改后TB培養(yǎng)基(50μg/ml氨芐青霉素、1mM硫胺素、75μg/ml δ-氨基-乙酰丙酸、1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))，于28℃以125rpm培養(yǎng)48小時(shí)。表達(dá)水平和生物合成活性的測(cè)量通過CO差異光譜學(xué)測(cè)定不同構(gòu)建物的表達(dá)水平，并使用消光系數(shù)ε450-49091mM-1Gm-1進(jìn)行定量(Omura等人，J Biol Chem，2392370-2378，1964)。使用100μl或500μl完整大腸桿菌細(xì)胞或者使用TritonX-114相分配的富含相測(cè)繪光譜，后者溶于50mM KH2PO4/K2HPO4pH7.5、2mM EDTA、20％甘油、0.2％ Triton X-100(總體積1ml)。為了制備用于體內(nèi)研究的大腸桿菌，將1ml細(xì)胞培養(yǎng)物以7000g離心2分30秒，并重懸于100μl 50mM Tricine pH7.9、1mM苯甲基磺酰氟。對(duì)于體外研究，由表達(dá)克隆#1的天然或Δ(1-52)2E1(10aa)構(gòu)建物或克隆#2的構(gòu)建物的大腸桿菌(JM109)細(xì)胞制備原生質(zhì)球，然后如先前所述(Halkier等人，Arch Biochem Biophys，322369-377，1995)溫度誘導(dǎo)相分配(0.6％ Triton X-114、30％甘油)。通過施用[U-14C]酪氨酸(0.35μCi，7.39μM)、對(duì)羥基苯乙醛肟(0或0.1mM)、或?qū)αu基苯乙腈(0或0.1mM)以重懸100μl大腸桿菌細(xì)胞來(lái)進(jìn)行體內(nèi)催化活性的測(cè)量。在重建實(shí)驗(yàn)中使用相分配的富含相測(cè)量體外活性。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物(總體積50μl)包含5μl富含相、0.375U S.bicolor NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶、5μl L-α-二肉桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)、0.6mM NADPH、和14mM KH2PO4/K2HPO4pH7.9。測(cè)試了下列底物L(fēng)-[U-14C]酪氨酸(0.20μCi、9.04μM)、L-[U-14C]苯丙氨酸(0.20μCi、8.8μM)、和L-3，4-二羥基苯基[3-14C]丙氨酸(0.20μCi、400μM)。還在包含純化的CYP791E1(Kahn等人，Plant Physiol，1151661-1670，1997；Bak等人，Plant Mol，36393-405，1998)的重建實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了L-[U-14C]酪氨酸(0.20μCi、9.04μM)。在搖動(dòng)水浴中于30℃保溫1小時(shí)，即在加入底物(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))或NADPH(體外實(shí)驗(yàn))后開始，在加入乙酸乙酯后終止。如先前所述(Moller等人，J Biol Chem，2548575-8583，1979)使用薄層層析(TLC)分析，通過放射性產(chǎn)物的形成來(lái)監(jiān)測(cè)生物合成活性，并使用Storm 840磷光體成像儀(MolecularDynamics，桑尼維爾，CA)進(jìn)行檢測(cè)和定量。在TLC應(yīng)用前，用乙酸乙酯萃取樣品。在此步驟中，過剩的放射性標(biāo)記酪氨酸保持在水相，從而防止原點(diǎn)的過度曝光。將全部乙酸乙酯相應(yīng)用于TLC板。在有些實(shí)驗(yàn)中，不可避免的攜帶少量水相導(dǎo)致原點(diǎn)出現(xiàn)酪氨酸條帶。在TLC板上預(yù)先將未標(biāo)記的參照化合物(對(duì)羥基苯乙醛肟、對(duì)羥基苯乙腈、和對(duì)羥基苯甲醛)劃線，從而能夠在紫外線下目視檢測(cè)。
完整大腸桿菌細(xì)胞的一氧化碳結(jié)合光譜在450nm顯示最大吸收，這是下列三種構(gòu)建物形成功能性細(xì)胞色素P450的癥候CYP79Elna、CYP79E1Δ(1-52)2E1(10aa)、和CYP79E2lacZ(24aa)。在進(jìn)行或不進(jìn)行pSBET共轉(zhuǎn)化的情況下測(cè)繪光譜，但是在所有情況中細(xì)胞色素P450的含量低得不足以定量。為了獲得精確測(cè)定，通過分離大腸桿菌原生質(zhì)球，隨后溫度誘導(dǎo)Triton X-114相分配，由此富集細(xì)胞色素P450(Werck-Reichart等人，Anal Biochem，197125-131，1991；Halkier等人，Arch BiochemBiophys，322369-377，1995)。使用CYP79E2lacZ(24aa)獲得了最高表達(dá)水平(在JM109細(xì)胞中，48小時(shí)后)56nmol/L培養(yǎng)物。該水平與使用作為陽(yáng)性對(duì)照的S.bicolor構(gòu)建物CYP79A1Δ(1-33)17α(8aa)(Halkier等人，Arch Biochem Biophys，322369-377，1995)獲得的表達(dá)水平62nmol/L培養(yǎng)物相當(dāng)。具有經(jīng)修飾的P45017αN末端的CYP79E1Δ(1-31)17α(8aa)和空載體不展示任何可檢測(cè)光譜。實(shí)施例10用CYP71E1重建CYP79E
使用來(lái)自兩種物種S.bicolor和海韭菜的酶實(shí)現(xiàn)了含氰苷合成的膜相關(guān)途徑的重建，導(dǎo)致對(duì)羥基扁桃腈即蜀黍苷的糖苷配基(體外視作對(duì)羥基苯甲醛)的形成。在包含酪氨酸、NADPH、NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶、CYP71E1、和CYP79E1或CYP79E2的重建實(shí)驗(yàn)中，積累了可觀數(shù)量的對(duì)羥基苯乙腈和對(duì)羥基苯甲醛。實(shí)施例11實(shí)施例12和13中所有的引物下列PCR引物是根據(jù)發(fā)現(xiàn)包含于GenBank編號(hào)AB010692中的CYP79A2的擬南芥Columbia載培品種基因組序列而設(shè)計(jì)的。下劃線指示加入的限制性位點(diǎn)，斜體指示編碼CYP17A的序列A2F1......5′-GTGCATATGCTTGACTCCACCCCAATG-3′(SEQ ID NO3)，A2R1......5′-ATGCATTTTTCTAGTAATCTTTACGCTC-3′(SEQ ID NO4)，A2F2......5′-CGTGAATTCCATATGCTCGCGTTTATTATAGGTTTGC-3′(SEQ ID NO5)，A2R2......5′-CGGAAGCTTATTAGGTTGGATACACATGT-3′(SEQ ID NO6)，A2R3......5′-CGTCACTTGTGCTTTGATCTCTTC-3′(SEQ ID NO7)，A2F3......5′-GAACTAATGTTGGCGACGGTTGAT-3′(SEQ ID NO8)，A2FX1.....5′-CGTGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTCTCGCGTTTATTATA-GGTTTG-3′(SEQ ID NO9)，A2FX2.....5′-CGTGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTCTTCTTCTTGCATTAAC-TATG-3′(SEQ ID NO10)，A2R4......5′-CATCTCGAGTCTTCTTCCACTGCTCTCCTT-3′(SEQ ID NO11)，A2FX3.....5′-TTAATCGGAAACCTACC-3′(SEQ ID NO12)；另外，還使用了下列引物17AF......5′-CGTGAATTCCATATGGCTCTGTTATTAGCTGTT-3′(SEQ ID NO13)，A1R.......5′-GGGCCACGGCACGGGACC-3′(SEQ ID NO14)，實(shí)施例12CYP79A2 cDNA的克隆使用引物A2F1和A2R1在展現(xiàn)2.5×107pfu擬南芥Wassilewskija載培品種長(zhǎng)角果cDNA文庫(kù)CD4-12(由Linda A.Castle博士和David W.Meinke博士惠贈(zèng)，Department of Botany，Oklohoma StateUniversity，Stillwater，俄克拉荷馬州，美國(guó))的噬菌體DNA和ABRC上進(jìn)行PCR。在含1.5mM MgCl2的Expand HF緩沖液(Roche MolecularBiochemicals)中建立50μl總體積的PCR反應(yīng)，其中添加了200μMdNTP、50pmol每種引物、和5％(v/v)DMSO。將反應(yīng)液于97℃保溫3分鐘后，加入2.6U Expand High Fidelity PCR system即延伸高保真PCR系統(tǒng)(Roche Molecular Biochemicals)，并進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(95℃ 90sec、65℃ 60sec、70℃ 120sec)。取0.5μl反應(yīng)液進(jìn)行嵌套PCR，其中使用引物A2F2和A2R2以及相同PCR條件。由瓊脂糖凝膠切下預(yù)期大小的PCR片段，克隆到經(jīng)EcoRI和HindIII消化的pYX223(R&D Systems)中，并對(duì)衍生自兩個(gè)嵌套PCR反應(yīng)的10個(gè)克隆的插入片段進(jìn)行測(cè)序。
使用Thermo Sequenase Fluorescent-labled Primer cyclesequencing kit即耐熱測(cè)序酶熒光標(biāo)記引物循環(huán)測(cè)序試劑盒(7-脫氮dGTP)(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行測(cè)序，并在ALF-ExpressDNA Sequencer即ALF快速DNA測(cè)序儀(Amersham Pharmacia Biotech)上進(jìn)行分析。使用GCG Wisconsin Sequence Analysis Package即GCG威斯康星序列分析軟件包的程序進(jìn)行序列計(jì)算機(jī)分析。以缺口生成罰分8和缺口延伸罰分2使用GAP程序來(lái)比較成對(duì)序列。使用NetPlantGene進(jìn)行剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)。
CYP79A2是在擬南芥基因組中鑒定的幾種CYP79同源物之一。依照計(jì)算機(jī)輔助剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)，它包含一個(gè)內(nèi)含子，這是A型細(xì)胞色素P450的特征。雖然它是CYP79A2的唯一內(nèi)含子，但是CYP79家族的其它成員具有一個(gè)或多個(gè)其它內(nèi)含子。全長(zhǎng)CYP79A2 cDNA的序列確認(rèn)了這一剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)。CYP79A2 cDNA的讀碼框具有兩個(gè)潛在ATG起始密碼子，一個(gè)位于5’非翻譯區(qū)中終止密碼子下游15bp處，另一個(gè)位于更下游15bp處。對(duì)于所有進(jìn)一步研究使用由第二個(gè)ATG密碼子起始的cDNA。該cDNA編碼523個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，它與參與含氰苷蜀黍苷生物合成的CYP79A1具有64％相似性和53％同一性。實(shí)施例13CYP79A2大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建物表達(dá)構(gòu)建物衍生自CYP79A2 cDNA，而后者是通過融合由擬南芥基因組DNA擴(kuò)增的兩個(gè)外顯子而得到的。這兩個(gè)外顯子是通過PCR使用1.25U Pwo聚合酶(Roche Molecular Biochemicals)和4mg模板DNA擴(kuò)增的，外顯子1使用引物A2F2和A2R3，外顯子2使用引物A2F3和A2R2。在含2mM MgSO4的Pwo聚合酶PCR緩沖液(Roche MolecularBiochemicals)中建立50μl總體積的PCR反應(yīng)，其中添加了200μMdNTP、50pmol每種引物、和5％(v/v)DMSO。將反應(yīng)液于94℃保溫3分鐘后，進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)即94℃ 20sec、60℃ 10sec、72℃ 30sec。用EcoRI(外顯子1)和HindIII(外顯子2)消化PCR片段后，用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs)將由引物A2R3和A2F3及Pwo聚合酶產(chǎn)生的平末端磷酸化。將兩個(gè)外顯子連接到經(jīng)EcoRI和HindIII消化的載體pYX223中。對(duì)克隆的DNA測(cè)序以排除摻入PCR錯(cuò)誤的可能性。
在表達(dá)載體pSP19g10L(Barnes，Meth Enzymol，2723-14，1996)中構(gòu)建了四個(gè)表達(dá)構(gòu)建物●79A2(“天然”)，其中79A2指CYP79A2編碼序列；●17A(1-8)79A2(修飾”)，其中17A(1-8)指經(jīng)修飾的CYP17AN端，編碼氨基酸序列MALLLAVF；●17A(1-8)79A2Δ(1-8)(“截短修飾”)，其中79A2Δ(1-8)指截去了第1-8位氨基酸的CYP79A2編碼序列；和●17A(1-8)79A1(25-74)79A2Δ(1-40)(“嵌合”)，其中79A1(25-74)指CYP79A1的第25-74位氨基酸，79A2Δ(1-40)指截去了第1-40位氨基酸的CYP79A2編碼序列。
CYP79A2的N端修飾設(shè)計(jì)成實(shí)現(xiàn)真核細(xì)胞色素P450在大腸桿菌中的高水平表達(dá)。構(gòu)建了兩個(gè)構(gòu)建物，分別在CYP79A2(產(chǎn)生“修飾”CYP79A2)或截短型CYP79A2(產(chǎn)生“截短-修飾”CYP79A2)的N末端前面導(dǎo)入牛細(xì)胞色素P450 CYP17A的8個(gè)N端氨基酸。這種細(xì)胞色素P450的N端似乎尤其適用于在大腸桿菌中表達(dá)。在第四種構(gòu)建物(“嵌合”CYP79A2)中，將CYP79A1Δ(1-24)bov(Halkier等人，Arch Biochem Biophys，322369-377，1995)的N端57個(gè)氨基酸融合編碼CYP79A2催化結(jié)構(gòu)域(第41-523位氨基酸)的cDNA。
N端修飾是如下導(dǎo)入的產(chǎn)生由CYP79A2 cDNA的ATG密碼子至PstI位點(diǎn)的PCR片段。將這些片段連接CYP79A2 cDNA的PstI/HindIII片段和經(jīng)EcoRI和HindIII消化的載體pYX223。為了得到修飾和截短修飾的CYP79A2，使用引物對(duì)A2FX1與A2R4以及A2FX2與A2R4。通過使用引物17AF與A1R由CYP79A1Δ(1-25)bovcDNA(Halkier等人，Arch BiochemBiophys，322369-377，1995)產(chǎn)生的PCR片段與使用引物A2FX3與A2R4由CYP79A2 cDNA產(chǎn)生的PCR片段的平端連接來(lái)進(jìn)行與CYP79A1 N端的融合。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，以排除摻入PCR錯(cuò)誤的可能性。通過NdeI和HindIII消化由pYX223切下不同的CYP79A2 cDNA，并連接到經(jīng)NdeI和HindIII消化的pSP19g10L中。實(shí)施例14大腸桿菌中的CYP79A2表達(dá)將用實(shí)施例13中所述表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109的細(xì)胞在添加100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并用于接種100ml含50μg/ml氨芐青霉素、1mM硫胺素、75μg/ml δ-氨基-乙酰丙酸、和1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的修改后TB培養(yǎng)基。將細(xì)胞于28℃以125rpm培養(yǎng)65小時(shí)。取75ml培養(yǎng)物沉淀細(xì)胞，并重懸于由0.1MTris HCl pH7.6、0.5mM EDTA、250mM蔗糖、和250μM苯甲基磺酰氟組成的緩沖液。加入溶菌酶至終濃度100μg/ml。于4℃保溫30分鐘后，加入乙酸鎂至終濃度10mM。沉淀原生質(zhì)球，重懸于5ml由10mMTris-HCl pH7.5、14mM乙酸鎂、和60mM乙酸鉀pH7.4組成的緩沖液，并在Potter-Elvehjem中勻漿。DNA酶和RNA酶處理后，加入甘油至終濃度29％。如Halkier等人，Arch Biochem Biophys，322369-377，1995中所述，進(jìn)行溫度誘導(dǎo)的Triton X-114相分配。通過SDS-PAGE分析Triton X-114富含相。
對(duì)重懸浮于900μl含50mM KPi pH7.5、2mM EDTA、20％(v/v)甘油、0.2％(v/v)Triton X-114、和少許連二亞硫酸鈉顆粒的緩沖液的100μl大腸桿菌原生質(zhì)球進(jìn)行Fe2+·CO與Fe2+差異光譜學(xué)(Omura等人，J Biol Chem，2392370-2378，1964)。將懸浮液分到兩個(gè)比色杯中，并在SLM Aminco DW-2000 TM分光光度計(jì)(SLM Instruments，烏爾班納，伊利諾伊州)上記錄400和500nm之間的基線。向樣品比色杯中通入CO 1分鐘，并記錄差異光譜。根據(jù)消光系數(shù)91mmol-1cm-1評(píng)估功能性細(xì)胞色素P450的量。
如Sibbesen等人，J Biol Chem，2703506-3511，1995中所述，在用由Sorghum bicolor(L.)Moench純化的NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶重建的大腸桿菌原生質(zhì)球中測(cè)量CYP79A2的活性。在典型的酶測(cè)定法中，將5μl原生質(zhì)球和4μl NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(相當(dāng)于0.04U，定義為1μmol細(xì)胞色素c min-1)與3.3μM L-[U-14C]苯丙氨酸(453mCi mmol-1)一起在含30mM KPi pH7.5、4mM NADPH、3mM還原型谷胱甘肽、0.042％(v/v)吐溫80、和1mg/ml L-α-二肉桂酰磷脂酰膽堿的總體積30μl的緩沖液中保溫。為了研究底物特異性，分別使用3.7μM L-[U-14C]酪氨酸(449mCi mmol-1)、0.1mM L-[甲基-14C]甲硫氨酸(56mCi mmol-1)、和1mM L-[5-3H]色氨酸(33Ci mmol-1)代替L-[U-14C]苯丙氨酸。于26℃保溫4小時(shí)后，取一半反應(yīng)混合物通過薄層層析在硅膠60 F254片(Merck)上進(jìn)行分析，其中使用甲苯∶乙酸乙酯(5∶1，v/v)作為洗脫液。通過Storm840磷光體成像儀(MolecularDynamics，桑尼維爾，加州)對(duì)14C放射性條帶進(jìn)行顯影和定量。通過放射自顯影將3H放射性條帶顯影。由時(shí)間點(diǎn)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、和6小時(shí)的測(cè)定顯示，保溫過程的前兩個(gè)小時(shí)內(nèi)由L-[U-14C]苯丙氨酸開始的產(chǎn)物形成隨時(shí)間是線性的。為了評(píng)估Km和Vmax值，將反應(yīng)混合物于26℃保溫2小時(shí)。為了進(jìn)行GC-MS分析，將含33μM L-苯丙氨酸(Sigma)或33μM高苯丙氨酸的450μl反應(yīng)混合物于26℃保溫4小時(shí)，并用總體積600μl的氯仿抽提兩次。合并有機(jī)相并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于15μl氯仿，并通過GC-MS進(jìn)行分析。GC-MS分析是在直接偶聯(lián)Jeol JMS-AX505W質(zhì)譜儀的HP5890系列II氣相層析儀上進(jìn)行的。使用SGE柱(BPX5，25m×0.25mm，0.25μm薄膜厚度)(上部壓力100kPa，無(wú)隙注射)。爐溫程序如下80℃ 3min，80-180℃ 5℃/min，180-300℃ 20℃/min，300℃ 10min。以E1模式(70eV)于200℃運(yùn)行離子源。苯乙醛肟(E)-和(Z)-異構(gòu)體的停留時(shí)間分別是12.43分和13.06分。兩種異構(gòu)體具有相同的斷裂模式，以m/z 135、117、和91為最突出的峰。
在由包含“天然”、“截短-修飾”、和“嵌合”CYP79A2的表達(dá)構(gòu)建物的大腸桿菌原生質(zhì)球的溫度誘導(dǎo)Triton X-114相分配獲得的去污劑富含相中檢測(cè)到在SDS-PAGE上以表觀分子量大約60kDa遷移的蛋白質(zhì)條帶。正如預(yù)期的，“嵌合”CYP79A2以略高于“天然”和“截短-修飾”CYP79A2的分子量進(jìn)行遷移。在包含“修飾”CYP79A2表達(dá)構(gòu)建物或空載體的細(xì)胞的去污劑富含相中沒有檢測(cè)到條帶。不同原生質(zhì)球制劑的光譜分析顯示，“嵌合”CYP79A2和較低程度的“截短-修飾”CYP79A2產(chǎn)生452nm特征峰的CO差異光譜，指示存在功能性細(xì)胞色素P450。在所有原生質(zhì)球制劑中都發(fā)現(xiàn)了415nm峰。該峰可能來(lái)自由大腸桿菌衍生的血紅素蛋白、在培養(yǎng)基中存在δ-氨基乙酰丙酸時(shí)產(chǎn)生的未附著血紅素基團(tuán)、或非功能性構(gòu)象的細(xì)胞色素P450。根據(jù)452nm峰，估計(jì)“嵌合”CYP79A2的表達(dá)水平是每升培養(yǎng)物50nmol細(xì)胞色素P450。在與L-[14C]苯丙氨酸一起保溫時(shí)，用“天然”、“截短-修飾”、或“嵌合”CYP79A2表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化并用由S.bicolor純化的NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶重建的大腸桿菌原生質(zhì)球產(chǎn)生兩種放射性標(biāo)記的化合物，它們?cè)诒訉游鲋信c苯乙醛肟的(E)-和(Z)-異構(gòu)體共遷移。在包含含“修飾”CYP79A2表達(dá)構(gòu)建物或空載體的大腸桿菌原生質(zhì)球的測(cè)定混合物中沒有檢測(cè)到這些產(chǎn)物。GC-MS分析顯示，在“嵌合”CYP79A2的反應(yīng)混合物中存在具有相同斷裂模式的這兩種化合物，但是對(duì)照反應(yīng)中沒有。由停留時(shí)間和斷裂模式將這些化合物鑒定為苯乙醛肟的(E)-和(Z)-異構(gòu)體。對(duì)表達(dá)“天然”或“嵌合”CYP79A2的大腸桿菌原生質(zhì)球施用L-[14C]酪氨酸、L-[14C]甲硫氨酸、或L-[3H]色氨酸并不引起可檢測(cè)量的相應(yīng)醛肟的生成。在表達(dá)“嵌合”CYP79A2的大腸桿菌原生質(zhì)球中研究了CYP79A2代謝DL-高苯丙氨酸的能力。反應(yīng)混合物的GC-MS分析顯示不存在可檢測(cè)量的高苯丙氨酸衍生醛肟。以L-[14C]苯丙氨酸作為底物，使用表達(dá)“天然”CYP79A2的大腸桿菌原生質(zhì)球測(cè)定得到CYP79A2的Km值為6.7μmol L-1，Vmax值為16.6pmol min-1(mg蛋白質(zhì))-1。由于使用“天然”CYP79A2沒有獲得CO光譜，所以不可能估計(jì)功能性“天然”CYP79A2的量。然而，根據(jù)功能性“嵌合”CYP79A2的表達(dá)水平，可以估計(jì)“天然”CYP79A2的轉(zhuǎn)換數(shù)是0.24min-1。
CYP79A2的底物特異性似乎是相當(dāng)窄的，因?yàn)長(zhǎng)-酪氨酸、DL-高苯丙氨酸、L-色氨酸、和L-甲硫氨酸都不能被該酶代謝。高底物特異性符合由參與含氰苷生物合成的CYP79同源物獲得的結(jié)果。重組CYP79A2的活性強(qiáng)烈依賴反應(yīng)混合物的pH，在較低程度上依賴幾個(gè)其它因素。與在pH7.5時(shí)的活性相比，“嵌合”CYP79A2的活性在pH6是25％，在pH6.5是50％，在pH7.0是80％，在pH7.9是70％。加入吐溫80至終濃度0.083％(v/v)導(dǎo)致醛肟生成增加1.5倍。加入還原型谷胱甘肽至終濃度3mM會(huì)刺激醛肟生成，但程度較低。實(shí)施例15CYP79A2在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的組成性表達(dá)將擬南芥Columbia載培品種用于所有的實(shí)驗(yàn)。在空調(diào)擬南芥箱(Percival AR-60 I，Boone，愛荷華州，美國(guó))中以光合流量100-120μmol光子m-2sec-1、于20℃、和70％相對(duì)濕度培養(yǎng)植物。光照期對(duì)于用于轉(zhuǎn)化的植物是12小時(shí)，對(duì)于用于生化分析的植物是8小時(shí)。
為了在擬南芥中在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下表達(dá)CYP79A2，通過幾個(gè)亞克隆步驟將天然全長(zhǎng)CYP79A2 cDNA導(dǎo)入經(jīng)EcoRI和KpnI消化的pRT101(Tpfer等人，Nucleic Acid Res，25989-994，1994)中。通過花浸潰(Clough等人，Plant J，16735-743，1998)，使用溶于10mM MgCl2的0.005％(v/v)Silwet L-77和5％(w/v)蔗糖，將用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的根癌土壤桿菌菌株C58(Zambryski等人，EMBO J，22143-2150，1983)用于植物轉(zhuǎn)化。讓種子在添加50μg/ml卡那霉素、2％(w/v) 蔗糖、和0.9％(w/v) 瓊脂的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽。兩周后選擇轉(zhuǎn)化體并轉(zhuǎn)移至土壤。
由6周齡植株(9株轉(zhuǎn)基因植株和3株野生型植株)采集蓮座葉(每株植物采5-8片不同齡的葉片)，立即在液氮中冷凍，并凍干48小時(shí)。如Sorensen在《Canola and Rapeseed-Production，chemistry，nutrition and processing technology》(蕓苔和油料種子生成、化學(xué)、營(yíng)養(yǎng)、和加工技術(shù)，Shahidi編，Van Nostrand Reinhold，紐約，第149-172頁(yè)，1990)中所述，分析脫磺酸基芥子油苷。簡(jiǎn)而言之，取2-5mg凍干材料在3.5ml沸騰的70％(v/v)甲醇中通過Polytron勻漿器勻漿1分鐘，加入10μl內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(5mM對(duì)羥基苯甲基芥子油苷；Bioraf，丹麥)，繼續(xù)勻漿1分鐘。沉淀植物材料，并將沉淀通過Polytron勻漿器用3.5ml沸騰的70％(v/v)甲醇再次抽提1分鐘。沉淀植物材料，用3.5ml 70％(v/v)甲醇清洗，并離心。合并上清液，并上樣至如下平衡的DEAE Sephadex A-25柱取25mg DEAE Sephadex A-25在1ml 0.5M醋酸鹽緩沖液pH5中溶脹過夜，裝到5ml移液槍頭中，并用1ml水清洗。將植物提取物上樣，并用2ml 70％(v/v)甲醇、2ml水、和0.5ml 0.02M醋酸鹽緩沖液pH5清洗柱子。應(yīng)用Helix pomatia硫酸酯酶(H-1型，Sigma；0.1ml，2.5mg/ml，溶于0.02M醋酸鹽緩沖液pH5)，并將柱子于室溫靜置16小時(shí)。用2ml水進(jìn)行洗脫。將洗脫液真空干燥，將殘余物溶于150μl水，并取100μl在配備了Supelcosil LC-ABZ 59142 C18柱(25cm×4.6mm，5mm；Supelco)和SPD-M10AVP光電二極管陣列檢測(cè)器(Shimadzu)的Shimadzu LC-10A Tvp上進(jìn)行HPLC。流速是1ml/min。用水洗脫2分鐘，隨后是用溶于水的0-60％甲醇線性梯度(48分鐘)、溶于水的60-100％甲醇線性梯度(3分鐘)、和100％甲醇(3分鐘)洗脫。峰的指定依據(jù)相比于標(biāo)準(zhǔn)化合物的停留時(shí)間和UV光譜。相對(duì)于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)并通過使用Buchner在《Glucosinolates in rapeseedAnalytical aspects》(油料種子中的芥子油苷分析方面，Wathelet編，Martinus Nijhoff出版社，第50-58頁(yè)，1987)中和Haughn等人，Plant Physiol，97217-226，1991描述的應(yīng)答因子，對(duì)芥子油苷定量。在蓮座葉的分析中，術(shù)語(yǔ)“總芥子油苷含量”指占野生型擬南芥蓮座葉中芥子油苷含量的85％的5種主要芥子油苷(4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷、4-甲基硫代丁基芥子油苷、8-甲基亞磺酰辛基芥子油苷、吲哚-3-基甲基芥子油苷、和4-甲氧基吲哚-3-基芥子油苷)和苯甲基芥子油苷的摩爾量。分析由T1植株#10、#13、和#14收獲的轉(zhuǎn)基因種子的芥子油苷含量，并與野生型種子的芥子油苷含量進(jìn)行比較。如上所述抽提12-30mg種子并進(jìn)行HPLC分析，只是省略了組織凍干。在這種種子分析中，術(shù)語(yǔ)“總芥子油苷含量”指占野生型擬南芥種子中芥子油苷含量的90％以上的10種主要芥子油苷(3-羥基丙基芥子油苷、4-羥基丁基芥子油苷、4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷、4-甲基硫代丁基芥子油苷、8-甲基亞磺酰辛基芥子油苷、7-甲基硫代庚基芥子油苷、8-甲基硫代辛基芥子油苷、吲哚-3-基甲基芥子油苷、3-苯甲酰氧基丙基芥子油苷、和4-苯甲酰氧基丁基芥子油苷)和苯甲基芥子油苷的摩爾量。
轉(zhuǎn)基因植株的外觀與野生型植株可比。在本研究中分析的所有轉(zhuǎn)基因植株(T1代)都在蓮座葉中積累苯甲基芥子油苷，而在同時(shí)培養(yǎng)的野生型植株中沒有檢測(cè)到苯甲基芥子油苷。只能在野生型擬南芥Columbia栽培品種的根和莖生葉中偶爾觀察到苯甲基芥子油苷，而且可能被環(huán)境條件誘導(dǎo)。苯甲基芥子油苷的偶爾發(fā)生符合CYP79A2 mRNA是低豐度轉(zhuǎn)錄本的觀察結(jié)果。通過Northern印跡和RT-PCR在擬南芥Columbia載培品種的幼苗、不同發(fā)育階段的蓮座葉、和莖生葉中未能檢測(cè)到CYP79A2 mRNA。轉(zhuǎn)基因植物中的苯甲基芥子油苷含量隨不同植株而變化。在具有最高積累的3株植物中，苯甲基芥子油苷分別占中葉片總芥子油苷含量的38％(植株#10)、5％(植株#14)、和2％(植株#13)。已知擬南芥Columbia載培品種的種子包含由高苯丙氨酸衍生的2-苯基乙基芥子油苷，而在擬南芥從未報(bào)導(dǎo)過有苯甲基芥子油苷。然而，我們已經(jīng)在擬南芥Columbia載培品種和Wassilewskija載培品種的種子中檢測(cè)到微量的苯甲基芥子油苷。轉(zhuǎn)基因植物種子的HPLC分析顯示，苯甲基芥子油苷占種子總芥子油苷含量的35％(植株#10)、12％(植株#14)、32％(植株#13)。在野生型植株(Columbia載培品種和Wassilewskija載培品種)的種子中檢測(cè)到微量的苯甲基芥子油苷(在Columbia載培品種中是每g鮮重0.034μmol，相當(dāng)于總芥子油苷含量的0.05％)。正如幾株轉(zhuǎn)基因植物中苯甲基芥子油苷的高水平積累所指示的，苯乙醛肟的形成是擬南芥中苯甲基芥子油苷生物合成的限速步驟。與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的葉片和種子中由高苯丙氨酸衍生的2-苯基乙基芥子油苷的含量不受影響。這支持了用在大腸桿菌中表達(dá)的CYP79A2獲得的數(shù)據(jù)，并顯示CYP79A2可以將苯丙氨酸而非高苯丙氨酸特異轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的醛肟。
已經(jīng)在不同植物物種中研究了在芥子油苷生物合成中參與氨基酸轉(zhuǎn)變成醛肟的酶的性質(zhì)。有人提出，依賴細(xì)胞色素P450的單加氧酶的參與可能只限于不屬于蕓苔科的物種，暗示歐白芥中依賴細(xì)胞色素P450的對(duì)羥基苯乙醛肟形成被看成是這一規(guī)律或?qū)嶒?yàn)假象的唯一例外。然而，展示的數(shù)據(jù)指示，在蕓苔科以及其它科的成員中由芳香族氨基酸開始的醛肟形成依賴細(xì)胞色素P450酶。實(shí)施例16組織化學(xué)GUS測(cè)定法對(duì)CYP79A2的表達(dá)分析在用在GUS-內(nèi)含子DNA序列之前包含CYP79A2啟動(dòng)子的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因擬南芥中研究了CYP79A2啟動(dòng)子。由EMBL3基因組文庫(kù)(擬南芥Columbia載培品種)分離一個(gè)包含CYP79A2基因的基因組克隆。由該陽(yáng)性噬菌體的DNA切下由2.5kb上游序列和120bp CYP79A2編碼區(qū)組成的SacI/XmaI片段(SEQ ID NO15)。將片段插入pPZP111，其讀碼框符合包含GUS-內(nèi)含子序列和35S終止子的pVictor IV S GiN(DaniscoBiotechnology，丹麥)的XbaI/SacI片段。通過17bp接頭進(jìn)行兩個(gè)片段之間的融合。得到的轉(zhuǎn)錄本編碼由與GUS蛋白質(zhì)融合的CYP79A2膜錨定蛋白組成的融合蛋白。
通過組織化學(xué)GUS測(cè)定法分析不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)化體。在10日齡植株的下胚軸和葉柄的葉脈中觀察到強(qiáng)烈染色。在子葉和葉片中沒有看到染色，只是在排水器(hydathode)中觀察到強(qiáng)烈染色。在3周齡的植株中，葉片的脈中度染色，而排水器強(qiáng)烈染色。在10日齡和3周齡植株的根中沒有看到染色。在5周齡的植株中，沒有檢測(cè)到GUS活性。實(shí)施例17實(shí)施例18、19、21、和22中所用的擬南芥植物和引物將擬南芥Columbia載培品種用于所有的實(shí)驗(yàn)。在空調(diào)擬南芥箱(Percival AR-60 I，Boone，愛荷華州，美國(guó))中以光合流量100-120μmol光子m-2sec-1、于20℃、和70％相對(duì)濕度培養(yǎng)植物。光照期對(duì)用于轉(zhuǎn)化的植物是12小時(shí)，對(duì)用于生化分析的植物是8小時(shí)。
下文實(shí)施例中提到的PCR引物序列如下T7 5′-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3′(SEQ ID NO57)，EST35′-GCT AGG ATC CAT GTT GTA TAC CCA AG-3′(SEQ ID NO58)，EST65′-CGG GCC CGT TTT CCG GTG GC-3′(SEQ ID NO59)，EST7A 5′-GGT CAC CAA AGG GAG TGA TCA CGC-3′(SEQ ID NO60)，5’“天然”有義 5′-ATC GTC AGT CGA CCA TAT GAA CAC TTT TAC CTC AAACTC TTC GG-3′(SEQ ID NO61)，5’“牛”有義 5′-ATC GTC AGT CGA CCA TAT GGC TCT GTT ATT AGC AGTTTT TAC ATC GTC CTT TAG CAC CTT GTA TCT CC-3′(SEQ ID NO62)，3’“末端”反義 5′-ACT GCT AGA ATT CGA CGT CAT TAC TTC ACC GTC GGGTAG AGA TGC-3′(SEQ ID NO62)，CYP79B2.2 5′-GGA ATT CAT GAA CAC TTT TAC CTC A-3′(SEQ ID NO64)，B2SB5′-TTG TCT AGA TCA CTT CAC CGT CGG GTA-3′(SEQ ID NO65)，B2AF5′-GGC CTC GAG ATG AAC ACT TTT ACC TCA-3′(SEQ ID NO66)，B2AB5′-TTG GAA TTC CTT CAC CGT CGG GTA GAG-3′(SEQ ID NO67)，XbaI5′-GTA CCA TCT AGA TTC ATG TTT GTG TAT AGA G-3′(SEQ ID NO68)，EST15′-TCC ATG TGC TCT ACA TCT-3′(SEQ ID NO72)，EST25′-GAC GGA ACT CGT ATG TCC-3′(SEQ ID NO73)，實(shí)施例18CYP79B2和CYP79B5 cDNA的克隆和表達(dá)模式與CYP79A1相比時(shí)，根據(jù)與S.bicolorCYP79A1的同源性鑒定的ESTT42902在5’端缺乏516bp。使用擬南芥λPRL2 cDNA文庫(kù)(Newman等人，Plant Physiol，1061241-1255，1994)作為模板以及T7和基因特異EST3引物，擴(kuò)增了缺失5’端的255bp片段，隨后通過擴(kuò)增的載體序列中的EcoRI位點(diǎn)和通過引物EST3導(dǎo)入的BamHI位點(diǎn)進(jìn)行克隆。將該片段作為模板，和引物EST6和EST7A一起，用于通過PCR擴(kuò)增洋地黃毒苷-11-dUTP(DIG，Boehringer，曼海姆)標(biāo)記的探針(DIG1)。依照制造商的指示(Boehringer，曼海姆)，用DIG1探針篩選λPRL2文庫(kù)，其中于68℃在5x SSC、0.1％N-肉桂酰肌氨酸、0.02％SDS、1.2％(w/v)封閉劑(Boehringer，曼海姆)中雜交過夜，并于65℃用0.1xSSC、0.1％ SDS進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)清洗兩次各15分鐘。依照制造商的指示(Boehringer，曼海姆)，通過氮藍(lán)四唑的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)來(lái)進(jìn)行陽(yáng)性噬斑的檢測(cè)。以255bp PCR片段作為探針(DIG1)篩選λPRL2文庫(kù)，分離到編碼CYP79B2的全長(zhǎng)cDNA克隆。
EST T42902是根據(jù)與S.bicolor CYP79A1序列的同源性鑒定到的。使用來(lái)自俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物學(xué)研究中心的EST T42902作為模板以及引物EST1和EST2，擴(kuò)增了240bp PCR片段。用洋地黃毒苷-11-dUTP(DIG，Boehringer，曼海姆)標(biāo)記該P(yáng)CR片段，并作為探針用于篩選蔓菁葉片的λZAP II cDNA文庫(kù)(Clontech Lab.公司)。依照制造商的指示，用DIG探針篩選文庫(kù)，于68℃在5x SSC、0.1％ N-肉桂酰肌氨酸、0.02％SDS、1.2％(w/v) 封閉劑(Boehringer，曼海姆)中雜交過夜，并于65℃用O.1x SSC、0.1％SDS進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)清洗兩次各15分鐘。依照制造商的指示(Boehringer，曼海姆)，通過氮藍(lán)四唑的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)來(lái)進(jìn)行陽(yáng)性噬斑的檢測(cè)。通過篩選文庫(kù)分離到編碼CYP79B5的全長(zhǎng)cDNA克隆。
使用Thermo Sequence Fluorescent-labled Primer cyclesequencing kit即耐熱測(cè)序酶熒光標(biāo)記引物循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham，瑞典)進(jìn)行序列反應(yīng)，并在ALF-Express automatedsequenator即ALF快速自動(dòng)化測(cè)序儀(Pharmacia)上進(jìn)行分析。使用GCG Wisconsin Sequence Analysis Package即GCG威斯康星序列分析軟件包中的程序進(jìn)行序列計(jì)算機(jī)分析和比對(duì)。
為了進(jìn)行Southern印跡分析，使用Nucleon Phytopure Plant DNAExtraction Kit(Amersham)由擬南芥葉片分離基因組DNA。取10μgDNA，用BamHI、XbaI、SspI、EcoRI、或EcoRV進(jìn)行消化，并在O.8％瓊脂糖凝膠上通過電泳進(jìn)行分離。使用洋地黃毒苷標(biāo)記的探針DIG1進(jìn)行Southern印跡分析，并在高嚴(yán)謹(jǐn)條件(68℃，0.1x SSC、0.1％ SDS，2x 15分鐘)下進(jìn)行清洗。使用CDP-StarTM(Tropix公司)通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)使條帶顯影。
為了進(jìn)行Northern印跡分析，使用TRIzol流程(Gibco BRL)，由蓮座葉、莖生葉、莖、花、和根以及發(fā)生創(chuàng)傷的蓮座葉分離總RNA。取15μg總RNA，在1％變性甲醛/瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并印跡至帶正電的尼龍膜(Boehringer)上。通過隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記，生成覆蓋CYP79B2完整編碼區(qū)或擬南芥ACTIN-1的32P標(biāo)記探針。將濾膜于60℃在0.5％SDS、2x SSC、5x Denhardt氏液、20μg/ml超聲處理鮭魚精DNA中進(jìn)行雜交，并于60℃用0.2x SSC、0.1％ SDS洗去過量探針。在Storm 840磷光體成像儀上使放射性標(biāo)記條帶顯影，并用ImageQuant分析軟件定量。
根據(jù)其它CYP79基因中起始密碼子的定位和雙子葉植物中起始密碼子周圍最有可能的序列預(yù)測(cè)了起始密碼子。在該起始密碼子的5’端沒有找到終止密碼子。CYP79B2和CYP79B5的全長(zhǎng)cDNA克隆分別編碼長(zhǎng)度為541個(gè)和540個(gè)氨基酸的61kDa多肽，它們與其它A型CYP79細(xì)胞色素高度同源(Nelson，Arch Biochem Biophys，3691-10，1999)。特別感興趣的是與歐白芥CYP79B1分別有93％和96％氨基酸同一性，與擬南芥CYP79B3有85％(85％)氨基酸同一性。CYP79B5與CYP79B2有94％同一。一般而言，CYP79B2和CYP79B5顯示與CYP79家族其它已知成員有44-67％氨基酸同一性。使用DIG1探針的高嚴(yán)謹(jǐn)度Southern印跡顯示CYP79B2是單拷貝基因。在每條泳道中檢測(cè)到1或2條主要條帶。這是A型細(xì)胞色素P450的一般情況，而且與通過Arabidopsis GenomeSequencing Project即擬南芥基因組測(cè)序計(jì)劃只鑒定了位于4號(hào)染色體上的單一匹配序列的事實(shí)有關(guān)。然而，位于2號(hào)染色體上且與幾個(gè)其它細(xì)胞色素P450成簇的CYP79B3與CYP79B2在氨基酸水平上85％同一。因此，很有可能是CYP79B3催化相同反應(yīng)。在Southern印跡的大多數(shù)泳道中檢測(cè)到其它微弱條帶。它們大概是由于與同源物諸如CYP79B3或假基因CYP79B4的雜交所致。在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，每個(gè)泳道中存在多個(gè)條帶，這指示擬南芥中存在多種CYP79序列。迄今為止，擬南芥基因組測(cè)序計(jì)劃已經(jīng)鑒定了7種CYP79同源物。
由多種擬南芥組織提取的RNA的Northern分析測(cè)定的CYP79B2表達(dá)模式揭示在所檢查的所有組織類型中均有表達(dá)。在根中發(fā)現(xiàn)了最高表達(dá)水平，在莖生葉中發(fā)現(xiàn)了最低水平；在蓮座葉、莖、和花中發(fā)現(xiàn)了大致相等的量。根中的CYP79B2 mRNA水平比在蓮座葉中發(fā)現(xiàn)的水平高大約3-4倍。在創(chuàng)傷后15分鐘內(nèi)可檢測(cè)到2倍水平的誘導(dǎo)，在蓮座葉中，在2小時(shí)后觀察到這一現(xiàn)象。所述升高與CYP79B2參與吲哚芥子油苷生物合成是一致的。實(shí)施例19CYP79B2大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建物和活性測(cè)量將使用5’“天然”有義引物或5’“?！庇辛x引物和3’“末端”反義引物的PCR分別用于生成用于表達(dá)的構(gòu)建物“天然”和“Δ(1-9)bov”。使用通過引物導(dǎo)入的AatII和NdeI限制性位點(diǎn)，將PCR片段克隆到經(jīng)AatII和NdeI消化的pSP19g10L載體(Barnes，Meth Enzymol，2723-14，1996)中，并進(jìn)行測(cè)序以排除PCR錯(cuò)誤。
天然構(gòu)建物由CYP79B2的未修飾編碼區(qū)組成，而Δ(1-9)bov構(gòu)建物除了用牛P45017α(17)的前8個(gè)密碼子替代前8個(gè)密碼子以外，還截去了9個(gè)氨基酸。牛修飾型顯示導(dǎo)致細(xì)胞色素P450在大腸桿菌中的高水平表達(dá)。兩種構(gòu)建物都攜帶TAAT經(jīng)修飾終止序列，以提高翻譯終止效率(Tate等人，Biochem，312443-2450，1992)。
通過用來(lái)自Sorghum bicolor(L.)Moench的純化NADPH細(xì)胞色素P450還原酶重建表達(dá)CYP79B2的大腸桿菌的原生質(zhì)球來(lái)測(cè)量CYP79B2的活性。如Sibbesen等人，J Biol Chem，2703506-3511，1995所述，純化S.bicolor的NADPH細(xì)胞色素P450還原酶。向含100mM TricinepH7.9、10μg/μl DLPC(二肉桂酰磷脂酰膽堿)(超聲處理2次各10秒鐘)、4mM NADPH、3mM還原型谷胱甘肽(GSH)、5μl[3-14C]色氨酸(0.1μCi，比活56.5mCi/mmol)、和1U/μl純化的NADPH細(xì)胞色素P450還原酶的45μl反應(yīng)混合物中加入5μl大腸桿菌原生質(zhì)球，由此開始反應(yīng)。將反應(yīng)液于34℃保溫30分鐘，用乙酸乙酯抽提兩次，通過TLC分析乙酸乙酯相，使用甲苯∶乙酸乙酯(5∶1)作為洗脫液。在Storm840磷光體成像儀(Molecular Dynamics)上使放射性標(biāo)記條帶顯影，并用ImageQuant分析軟件(Molecular Dynamics)定量。通過用14C標(biāo)記的酪氨酸或苯丙氨酸替代14C標(biāo)記的色氨酸來(lái)研究底物特異性。
采用GC-MS來(lái)確認(rèn)重組CYP79B2由色氨酸生成的化合物的結(jié)構(gòu)。將如上所述包含2mM未標(biāo)記色氨酸的450μl反應(yīng)混合物于34℃保溫2小時(shí)。將反應(yīng)混合物用300μl CHCl3萃取兩次，并冷凍至干燥。使用偶聯(lián)Jeol JMS-AX505W質(zhì)譜儀的HP5890系列II氣相層析儀進(jìn)行GC-MS。在SGE柱(BPX5，25mm×0.25mm，0.25μm薄膜厚度)上使用無(wú)隙注射和高差壓力100kPa。如Rausch等人，J Chromatogr，31895-102，1985所述，合成真實(shí)的吲哚-3-乙醛肟(IAOX)。實(shí)施例20大腸桿菌中的CYP79B2表達(dá)將上文實(shí)施例19中所述表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株C43(DE3)(Miroux等人，J Mol Biol，260289-298，1996)中。將單菌落在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜。取1ml過夜培養(yǎng)物用于接種75ml含100μg/ml氨芐青霉素、75μg/ml δ-氨基乙酰丙酸、1mM硫胺素、和1mM IPTG的TB培養(yǎng)基。將TB培養(yǎng)物28℃以125rpm培養(yǎng)44小時(shí)。如Halkier等人，Arch Biochem Biophys，322369-377，1995所述制備大腸桿菌原生質(zhì)球。
通過用由S.bicolor純化的NADPH細(xì)胞色素P450還原酶在DLPC微囊中重建大腸桿菌原生質(zhì)球來(lái)進(jìn)行活性測(cè)量。向包含表達(dá)天然或Δ(1-9)bovCYP79B2構(gòu)建物的大腸桿菌原生質(zhì)球的反應(yīng)混合物中施用[14C]色氨酸，導(dǎo)致生成在TLC上與真實(shí)IAOX標(biāo)準(zhǔn)物共遷移的強(qiáng)烈條帶。通過GC-MS實(shí)現(xiàn)了這種化合物的明確化學(xué)鑒定即IAOX。包含用空載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌原生質(zhì)球的反應(yīng)混合物中不積累IAOX。天然構(gòu)建物給出最高水平的活性，因而在由這種構(gòu)建物表達(dá)的重組CYP79B2上進(jìn)行分析。這一活性顯示依賴NADPH細(xì)胞色素P450還原酶的加入，因?yàn)樵谙蛉?xì)胞施用放射性標(biāo)記的色氨酸時(shí)檢測(cè)不到活性。這說(shuō)明大腸桿菌內(nèi)源電子供給系統(tǒng)黃素氧還蛋白NADPH-黃素氧還蛋白還原酶不能將電子供給CYP79B2。在不存在NADPH時(shí)觀察到少許活性，這最有可能是由于原生質(zhì)球制劑中NADPH的殘余量所致。加入1.5mM還原型谷胱甘肽(GSH)可將活性提高1.8倍。Km測(cè)定為21μM，Vmax測(cè)定為97.2pmol/h/μl原生質(zhì)球。在向包含重組CYP79B2的反應(yīng)混合物施用放射性標(biāo)記的苯丙氨酸或酪氨酸時(shí)，沒有檢測(cè)到肟生成活性。這指示CYP79B2對(duì)色氨酸是特異的。
原生質(zhì)球或原生質(zhì)球的Triton X-114溫度誘導(dǎo)相分配的富含相的CO差異光譜不顯示450nm特征峰。另外，在將原生質(zhì)球或其TritonX-114富含相在SDS-PAGE上分開并用考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)，可以看到大約60kDa的新條帶。這指示生成了很少的重組CYP79B2，并且CYP79B2是高度有活性的。
先前顯示了中國(guó)甘藍(lán)和擬南芥中的質(zhì)膜酶系統(tǒng)通過過氧化物酶樣酶(TrpOxe)催化由色氨酸形成IAOX。這一轉(zhuǎn)變受到H2O2的刺激，在某些情況中還受MnCl2和2，4-二氯苯酚的刺激。向CYP79B2重建測(cè)定法中加入100mM H2O2、1mM MnCl2、或800μM 2，4-二氯苯酚分別將活性抑制96％、34％、和72％，而在聯(lián)合時(shí)可抑制99％。這說(shuō)明兩種系統(tǒng)是不相同的，而且TrpOxE活性顯然與CYP79B2不同。另外，在50mM Tricine緩沖液pH8.0中包含100mM H2O2、1mM MnCl2、和800μM 2，4-二氯苯酚的非酶促反應(yīng)混合物能夠催化色氨酸轉(zhuǎn)變成與IAOX共遷移的化合物，轉(zhuǎn)變率是對(duì)CYP79B2所觀察到的大約0.7％。這說(shuō)明在氧化條件下可以發(fā)生色氨酸非酶促轉(zhuǎn)變成IAOX。實(shí)施例21CYP79B2在擬南芥中的有義和反義表達(dá)使用引物CYP79B2.2、B2SB、B2AF、和B2AB，以有義和反義方向，將CYP79B2 cDNA克隆到花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動(dòng)子的后面。使用引物對(duì)CYP79B2.2/B2SB(有義構(gòu)建物)和B2AF/B2AB(反義構(gòu)建物)通過PCR擴(kuò)增天然全長(zhǎng)CYP79B2 cDNA。將有義構(gòu)建物的PCR產(chǎn)物克隆到經(jīng)EcoRI和XbaI消化的pRT101(Tpfer等人，Nucleic Acids Res，155890，1987)中并測(cè)序。將反義構(gòu)建物的PCR產(chǎn)物克隆到經(jīng)EcoRI和XhoI消化的pBluescript(Stratagene)中，通過EcoRI和KpnI消化切下，連接到經(jīng)EcoRI和KpnI消化的pRT101中并測(cè)序。通過PstI消化由pRT101切下有義和反義表達(dá)盒并轉(zhuǎn)移至pPZP111(Haj dukiewicz等人，Plant Mol Biol，25989-994，1994)。通過花浸漬方法(Clough等人，Plant J，16735-743，1998)，使用溶于10mM MgCl2的0.005％ Silwet L-77和5％蔗糖，將用兩種構(gòu)建物之一轉(zhuǎn)化的根癌土壤桿菌菌株C58(Zambryski等人，EMBO J，22143-2150，1983)用于轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型Columbia。讓種子在添加50μg/ml卡那霉素、2％蔗糖、和0.9％瓊脂的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽。兩周后選擇轉(zhuǎn)化體并轉(zhuǎn)移至土壤。
如Sorensen在《Canola and Rapeseed-Production，chemistry，nutrition and processing technology》(蕓苔和油料種子生成、化學(xué)、營(yíng)養(yǎng)、和加工技術(shù)，Shahidi編，第149-172頁(yè)，1990，VanNostrand Reinhold，紐約)中所述，通過HPLC對(duì)具有改變CYP79B2表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因擬南芥分析芥子油苷分布。通過在4ml 50％甲醇中煮沸2次各2分鐘，由6-8周齡擬南芥的凍干蓮座葉提取芥子油苷。將提取物應(yīng)用于用1ml 0.5M KOAc pH5.0平衡并用1ml H2O清洗兩次的200μl DEAE Sephadex CL-6B柱(Pharmacia)。將流過物用1ml H2O洗三次。將400μl 2.5mg/ml Helix pomatia硫酸酯酶(Sigma Aldrich)應(yīng)用于柱子，密封并靜置過夜。將得到的脫磺基芥子油苷(desulphoglucosinolate)用1ml H2O洗脫兩次，蒸發(fā)至干燥，并重懸于200μl H2O。取一部分應(yīng)用于配備了Supelco supelcosil LC-ABZ59142 C18柱(25cm×4.6mm，5mm；Supelco)和SPD-M10AVP光電二極管陣列檢測(cè)器(Shimadzu)的Shimadzu Spectachrom HPLC系統(tǒng)。流速是1ml/min。用水洗脫2分鐘，隨后用溶于水的0-60％甲醇線性梯度(48分鐘)、溶于水的60-100％甲醇線性梯度(3分鐘)、和100％甲醇(3分鐘)洗脫。使用光電二極管陣列于229nm和260nm進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)應(yīng)答系數(shù)和內(nèi)部金蓮葡糖硫苷標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)脫磺基芥子油苷定量。
用35S啟動(dòng)子控制下的CYP79B2反義構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的擬南芥植株具有野生型表型，而用35S啟動(dòng)子控制下的CYP79B2有義構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植株的大多數(shù)(大約80％)展示矮化。超過75％的有義植株不形成花序，而且不產(chǎn)生種子。其余有義植株像野生型植株一樣，但是結(jié)籽一般較少。
過度表達(dá)CYP79B2植株的矮化表型可能是由于吲哚芥子油苷水平的升高所致。將酪氨酸轉(zhuǎn)變成對(duì)羥基苯乙醛肟的CYP79A1在擬南芥中的過度表達(dá)，導(dǎo)致具有高含量的酪氨酸衍生對(duì)羥基苯甲基芥子油苷的矮化植株。由CYP79A1生成的對(duì)羥基苯乙醛肟被非常有效的引導(dǎo)成對(duì)羥基苯甲基芥子油苷。在過度表達(dá)CYP79B2的擬南芥中也可能發(fā)生相似有效的將IAOX引導(dǎo)至吲哚芥子油苷。然而，不能排除矮態(tài)表型是由于由IAOX生成的IAA水平升高，或由升高水平的吲哚芥子油苷降解生成的吲哚-3-乙腈所致。
轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代的芥子油苷分布的HPLC分析顯示，過度表達(dá)CYP79B2的植株積累比用空載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株更高數(shù)量的吲哚芥子油苷。兩種最豐富的吲哚芥子油苷即蕓苔葡糖硫苷和4-甲氧基蕓苔葡糖硫苷的水平分別升高了大約5倍和2倍，而新蕓苔葡糖硫苷(neoglucobrassicin)的水平?jīng)]有顯著升高?？偨孀佑蛙蘸恳蜉^高水平的吲哚芥子油苷而升高，但是脂肪族和芳香族(即無(wú)吲哚)芥子油苷的水平不受影響。在反義植株中，吲哚芥子油苷水平與對(duì)照植株相比沒有降低?？赡艿慕忉屖撬梅戳x構(gòu)建物未能充分下調(diào)CYP79B2?；蛘撸鶕?jù)同源性有可能催化相同反應(yīng)的CYP79B3補(bǔ)償了吲哚芥子油苷的下調(diào)。實(shí)施例22組織化學(xué)GUS測(cè)定法對(duì)CYP79B2的表達(dá)分析使用DIG系統(tǒng)(Boehringer)，用能夠與CYP79B2基因5’端退火的505bp洋地黃毒苷-11-dUTP標(biāo)記探針篩選擬南芥生態(tài)型ColumbiaEMBL3基因組文庫(kù)。探針雜交是于65℃在5x SSC、0.1％ N-肉桂酰肌氨酸、0.02％ SDS、和1％封閉劑中進(jìn)行的。在檢測(cè)前用0.1x SSC、0.1％ SDS于65℃清洗濾膜。如Grossberger，Nucleic Acids Res，156737，1987所述，由陽(yáng)性噬菌體純化噬菌體DNA。將包含完整CYP79B2編碼區(qū)和2361bp啟動(dòng)子區(qū)(參閱GenBank編號(hào)AL035708的第60536-62896位核苷酸，SEQ ID NO16)的5kb EcoRI片段亞克隆到pBluescriptII SK(Stratagene)中。使用T7載體引物和XbaI引物(實(shí)施例17)通過PCR在緊挨CYP79B2起始密碼子的下游導(dǎo)入了XbaI限制性位點(diǎn)。PCR反應(yīng)在200μl總體積中在含2mM MgSO4的Pwo聚合酶PCR緩沖液(Boehringer，曼海姆)中包含200μM dNTP、400pmol每種引物、0.1μg模板DNA、和10U Pwo聚合酶。將反應(yīng)液于94℃保溫5分鐘后，進(jìn)行23個(gè)PCR循環(huán)即94℃ 30sec、45℃ 30sec、72℃ 1.5min。用EcoRI和XbaI消化得到的PCR產(chǎn)物，克隆到pBluescript II SK中，并測(cè)序以排除PCR錯(cuò)誤。最后，通過將來(lái)自CYP79B2啟動(dòng)子區(qū)的2361bpEcoRI-XbaI片段與來(lái)自pVictor IV S GiN(Danisco Biotechnology，丹麥)的XbaI-SalI片段(包含GUS內(nèi)含子及35S終止子)一起連接到二元載體pPZP111中，構(gòu)建了轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pPZP111.p79B2-GUS。通過電穿孔(Wen-Jun等人，Nucleic Acid Res，178385，1983)將pPZP111.p79B2-GUS導(dǎo)入根癌土壤桿菌C58C1/pGV3850。通過花浸漬法(Clough等人，Plant J，16735-743，1998)，使用溶于10mM MgCl2的0.005％ Silwet L-77和5％蔗糖，用根癌土壤桿菌C58C1/pGV3850/pPZP111.p79B2-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型Columbia。讓種子在添加50μg/ml卡那霉素、2％蔗糖、和0.9％瓊脂的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽。兩周后選擇轉(zhuǎn)化體并轉(zhuǎn)移至土壤?；旧先鏜artin等人在《GUSProtocolsUsing the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression》(GUS方案將GUS基因用作基因表達(dá)的報(bào)告基因，Gallagher編，第23-43頁(yè)，Academic出版公司)中所述對(duì)T3植株進(jìn)行組織化學(xué)GUS測(cè)定法，只是在染色前沒有將組織在低聚甲醛中固定。將組織染色3小時(shí)。
在幼根和子葉中檢測(cè)到最高水平的GUS表達(dá)。在幼蓮座葉和成熟蓮座葉中檢測(cè)到一些表達(dá)，這主要與維管組織中的主要和次要葉脈有關(guān)。老葉片中的表達(dá)非常微弱。在長(zhǎng)角果中，GUS于柱頭表面和萼片附著處表達(dá)。在種子中檢測(cè)不到GUS染色。物理?yè)p傷的1-2mm內(nèi)發(fā)生非常強(qiáng)烈的GUS染色。實(shí)施例23實(shí)施例24和26中所用的引物下列PCR引物是根據(jù)發(fā)現(xiàn)在GenBank編號(hào)AC006341中包含的CYP79F1的擬南芥基因組序列而設(shè)計(jì)的。引物1..5′-CTCTAGATTCGAACATATGGCTAGCTTTACAACATCATTACC-3′(SEQ ID NO3)，引物2..5′-CGGGATCCTTAAGGACGGAACTTTGGATA-3′(SEQ ID NO4)，引物3..5′-AACTGCAGCATGATGAGCTTTACCACATC-3′(SEQ ID NO5)，引物4..5′-CGGGATCCTTAATGGTGGTGATGAGGACGGAACTTTGGATAA-3′(SEQ ID NO6)，引物5..5′-AAAGCTCAATGCGTAGAAT-3′(SEQ ID NO7)，引物6..5′-TTTTTAGACACCATCTTGTTTTCTTCTTC-3′(SEQ ID NO8)，引物7..5′-TGTAGCGGCGCATTAAGC-3′(SEQ ID NO9)，引物8..5′-CAAAAGAATAGACCGAGATAGGG-3′(SEQ ID NO10)，實(shí)施例24CYP79F1大腸桿菌表達(dá)構(gòu)建物CYP79F1是在擬南芥基因組中鑒定的幾種CYP79同源物之一。CYP79F1的推導(dǎo)氨基酸序列與CYP79F2的推導(dǎo)氨基酸序列具有88％同一性，與來(lái)自包含芥子油苷和含氰苷物種的其它CYP79同源物具有43-50％同一性。CYP79F1和CYP79F2位于相同染色體上，只相隔1638bp。這說(shuō)明這兩種基因是通過基因復(fù)制形成的，而且可能催化相似反應(yīng)。由包含CYP79F1全長(zhǎng)序列的EST ATTS5112(Arabidopsis BiologicalResource Center即擬南芥生物學(xué)資源中心，俄亥俄州，美國(guó))衍生出表達(dá)構(gòu)建物。使用引物1(有義方向)和引物2(反義方向)通過PCR該EST擴(kuò)增CYP79F1編碼區(qū)。引物1在起始密碼子的上游導(dǎo)入了XbaI位點(diǎn)，在起始密碼子處導(dǎo)入了NdeI位點(diǎn)。為了優(yōu)化構(gòu)建物用于在大腸桿菌中表達(dá)(Barnes等人，Proc Natl Acad Sci USA，885597-5601，1991)，引物1將第二個(gè)密碼子由ATG改成GCT，并在第5位密碼子處導(dǎo)入沉默突變。引物2緊挨終止密碼子后面導(dǎo)入了BamHI限制性位點(diǎn)。使用2.5U Pwo聚合酶(Roche Molecular Biochemicals)、0.1μg模板DNA、200μM dNTP、和50pmol每種引物，在含2mM MgSO4的Pwo聚合酶PCR緩沖液中建立總體積50μl的PCR反應(yīng)。將反應(yīng)液于94℃保溫5分鐘后，進(jìn)行20個(gè)PCR循環(huán)即94℃ 15sec、58℃ 30sec、72℃ 2min。用XbaI和BamHI消化PCR片段，并連接到經(jīng)XbaI和BamHI消化的載體pBluescript II SK(Stratagene)中。使用Thermo SequenaseFluorescent-labled Primer cycle sequencing kit即耐熱測(cè)序酶熒光標(biāo)記引物循環(huán)測(cè)序試劑盒(7-脫氮dGTP)(Amersham，瑞典)在ALF-Express sequenator即ALF快速測(cè)序儀(Pharmacia)上對(duì)cDNA測(cè)序以排除PCR錯(cuò)誤，并由pBluecript II SK轉(zhuǎn)移至經(jīng)NdeI和BamHI消化的pSP19g10L表達(dá)載體(Barnes等人，Proc Natl Acad Sci USA，885597-5601，1991)中。實(shí)施例25大腸桿菌中的CYP79F1表達(dá)將用該表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109(Stratagene)和C43(DE3)(Miroux等人，J Mol Biol，260289-298，1996)的細(xì)胞在添加100μg/ml氨芐青霉素的LB中培養(yǎng)過夜，并用于接種40ml含50μg/ml氨芐青霉素、1mM硫胺素、75μg/ml δ-氨基-乙酰丙酸、1μg/ml氯霉素、和1mM異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的修改后TB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物于28℃以125rpm培養(yǎng)60小時(shí)。沉淀細(xì)胞，并重懸于由0.2MTris HCl pH7.5、1mM EDTA、0.5M蔗糖、和0.5mM苯甲基磺酰氟組成的緩沖液。加入溶菌酶至終濃度100μg/ml。于4℃保溫30分鐘后，加入Mg(OAc)2至終濃度10mM。沉淀原生質(zhì)球，重懸于3.2ml由10mMTris-HCl pH7.5、14mM Mg(OAc)2、和60mM KOAc pH7.4組成的緩沖液，并在Potter-Elvehjem勻漿器中勻漿。DNA酶處理后，加入甘油至終濃度30％。溫度誘導(dǎo)的Triton X-114相分配形成了包含大部分細(xì)胞色素P450的去污劑富含相和去污劑貧乏相(Halkier等人，Arch BiochemBiophys，322369-377，1995)。在SLM Aminco DW-2000 TM分光光度計(jì)(SLM Instruments，烏爾班納，IL)上，使用于990μl含50mMKPi pH7.5、2mM EDTA、20％甘油、0.2％Triton X-100、和少許連二亞硫酸鈉顆粒的緩沖液中的10μl Triton X-114富含相，通過Fe2+CO對(duì)Fe2+差異光譜學(xué)(Omura等人，J Biol Chem，2392370-2378，1964)監(jiān)測(cè)CYP79F1的功能性表達(dá)。
如Sibbesen等人，J Biol Chem，2703506-3511，1995所述，在用由Sorghum bicolor(L.)Moench純化的NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶重建的大腸桿菌原生質(zhì)球中測(cè)量CYP79F1的活性。在典型的酶測(cè)定法中，將5μl原生質(zhì)球和4μl NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(相當(dāng)于0.04U，定義為1μmol細(xì)胞色素c min-1)與底物一起在含30mM KPipH7.5、3mM NADPH、3mM還原型谷胱甘肽、0.042％吐溫80、和1mg/mlL-α-二肉桂酰磷脂酰膽堿的總體積30μl的緩沖液中保溫。在所有測(cè)定法中，將包含用空載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌C43(DE3)原生質(zhì)球的反應(yīng)混合物用作對(duì)照。測(cè)試3.3μM L-[U-14C]苯丙氨酸(453mCi mmol-1；Pharmacia)、3.7μM L-[U-14C]酪氨酸(449mCi mmol-1；Pharmacia)、0.1mM L-[甲基-14C]甲硫氨酸(56mCi mmol-1；Pharmacia)、和24μML-[側(cè)鏈-3-14C]色氨酸(56.5mCi mmol-1；NEN)作為潛在底物。于28℃保溫1小時(shí)后，取一半反應(yīng)混合物通過TLC在硅膠60 F254片(Merck)上進(jìn)行分析，使用甲苯∶乙酸乙酯(5∶1，v/v)作為洗脫液。通過Storm840磷光體成像儀(Pharmacia)對(duì)放射性標(biāo)記的條帶進(jìn)行顯影和定量。為了進(jìn)行GC-MS分析，將分別含3.3mM L-甲硫氨酸(Sigma)、3.3mM DL-二高甲硫氨酸、3.3mM DL-三高甲硫氨酸的450μl反應(yīng)混合物于25℃保溫4小時(shí)，并用總體積600μl的CHCl3抽提。合并有機(jī)相，蒸發(fā)，將殘余物溶于15μl CHCl3，并通過GC-MS進(jìn)行分析。GC-MS分析是在直接偶聯(lián)Jeol JMS-AX505W質(zhì)譜儀的HP5890系列II氣相層析儀上進(jìn)行的。使用SGE柱(BPX5，25m×0.25mm，0.25μm薄膜厚度)(高差壓力100kPa，無(wú)隙注射)。爐溫程序如下80℃ 3min，80-180℃ 5℃/min，180-300℃ 20℃/min，300℃ 10min。以E1模式(70eV)于200℃運(yùn)行離子源。5-甲基硫代戊醛肟的(E)-和(Z)-異構(gòu)體的停留時(shí)間分別是14.3分鐘和14.8分鐘。兩種異構(gòu)體具有相同的斷裂模式，以m/z 130、129、113、82、61、和55作為最突出的峰。6-甲基硫代戊醛肟的(E)-和(Z)-異構(gòu)體的停留時(shí)間分別是17.1分鐘和17.6分鐘。兩種異構(gòu)體具有相同的斷裂模式，以m/z 144、143、98、96、69、61、和55作為最突出的峰。DL-二高甲硫氨酸、DL-三高甲硫氨酸、5-甲基硫代己醛肟、和6-甲基硫代己醛肟是如Dawson等人，J Biol Chem，26827154-27159，1993所述合成的，并經(jīng)過NMR光譜的鑒別。
對(duì)于在大腸桿菌菌株C43(DE3)中表達(dá)的CYP79F1而非在大腸桿菌菌株JM109中表達(dá)的CYP79F1獲得了具有450nm特征峰的CO差異光譜。除了450nm的峰，還檢測(cè)到了418nm的峰。
為了鑒定CYP79F1的底物，使用用S.bicolor的NADPH細(xì)胞色素P450還原酶重建的大腸桿菌C43(DE3)原生質(zhì)球進(jìn)行活性測(cè)量。在將包含CYP79F1的反應(yīng)混合物與DL-二高甲硫氨酸一起保溫時(shí)，通過GC-MS檢測(cè)到在對(duì)照反應(yīng)中不存在的兩種化合物。這些化合物的停留時(shí)間和質(zhì)譜斷裂模式與合成5-甲基硫代戊醛肟的E/Z-異構(gòu)體是相同的。在向包含CYP79F1的反應(yīng)混合物中施用DL-三高甲硫氨酸時(shí)，通過GC-MS檢測(cè)到與合成6-甲基硫代戊醛肟E/Z-異構(gòu)體具有相同停留時(shí)間和斷裂模式的兩種化合物。向包含重組CYP79F1的反應(yīng)混合物施用L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、和L-色氨酸，不導(dǎo)致可檢測(cè)量的相應(yīng)醛肟的形成。實(shí)施例26CYP79F1 cDNA在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)將擬南芥Columbia載培品種用于所有的實(shí)驗(yàn)。在空調(diào)擬南芥箱(Percival AR-60 I，Boone，愛荷華州，美國(guó))中以光合流量100-200μmol光子m-2sec-1、于20℃、和70％相對(duì)濕度培養(yǎng)植物。除非另外申名，光照期對(duì)于用于轉(zhuǎn)化的植物是12小時(shí)，對(duì)于用于生化分析的植物是8小時(shí)。轉(zhuǎn)基因植物的生成為了構(gòu)建在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下表達(dá)CYP79F1 cDNA的植物(35SCYP79F1植物)，使用引物3(有義方向)和引物4(反義方向)由EST ATTS5112(Arabidopsis Biological Resource Center即擬南芥生物學(xué)資源中心，俄亥俄州，美國(guó))PCR擴(kuò)增CYP79F1 cDNA。引物3以PstI限制性位點(diǎn)結(jié)尾。引物4在終止密碼子前導(dǎo)入了4個(gè)編碼His的密碼子并在終止密碼子后導(dǎo)入了BamHI限制性位點(diǎn)。用PstI和BamHI消化包含CYP79F1 cDNA的PCR片段，連接到經(jīng)PstI和BamHI消化的載體pBluescript II SK中，并測(cè)序以排除PCR錯(cuò)誤。通過連接到經(jīng)PstI和BamHI消化的載體pSP48(Danisco Biotechnology，丹麥)，將CYP79F1cDNA置于CaMV 35S啟動(dòng)子控制之下。通過XbaI消化切下表達(dá)盒并轉(zhuǎn)移至pPZP111(Hajdukiewicz等人，Plant Mol Biol，25989-994，1994)中。通過花浸漬(Clough等人，Plant J，16735-743，1998)，使用溶于10mM MgCl2的0.005％ Silwet L-77和5％蔗糖，將用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的根癌土壤桿菌菌株C58(Zambryski等人，EMBO J，22143-2150，1983)用于植物轉(zhuǎn)化。讓種子在添加50μg/ml卡那霉素、2％蔗糖、和0.9％瓊脂的MS培養(yǎng)基上發(fā)芽。兩周后選擇轉(zhuǎn)化體并轉(zhuǎn)移至土壤。
研究了9株35SCYP79F1原代轉(zhuǎn)化體。3株(S5、S7、S9)在形態(tài)上與野生型植株不同。這些植株的生長(zhǎng)速率降低，但是在生長(zhǎng)的第一個(gè)7周里表現(xiàn)正常。在花轉(zhuǎn)換變得明顯前，頂端優(yōu)勢(shì)減弱導(dǎo)致多個(gè)腋芽的生成，稍后發(fā)育成側(cè)生花序。這些形態(tài)變化賦予S5、S7、和S9以茂密表型。另外，S5具有卷曲的蓮座葉，葉尖向下彎曲。
因CYP79F1的共遏制或過度表達(dá)而脂肪族芥子油苷含量改變的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物具有特征性形態(tài)表型，其特征是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)延長(zhǎng)和多個(gè)腋芽的生成。有人報(bào)導(dǎo)，擬南芥能夠耐受導(dǎo)致芥子油苷含量升高2-5倍的CYP79家族細(xì)胞色素P450的過度表達(dá)，而植物外觀沒有相似變化。因此，形態(tài)變化似乎不可能是由特定芥子油苷的存在或缺乏引起的?？赡艿慕忉屖牵螒B(tài)表型是由于由植物硫代謝受干擾引起的多效效應(yīng)，其中甲硫氨酸發(fā)揮中樞作用。甲硫氨酸代謝的改變可以解釋為什么共遏制和過度表達(dá)CYP79F1的植株與野生型植株相比顯示相似形態(tài)變化。CYP79F1共遏制植株中形態(tài)變化在花轉(zhuǎn)換時(shí)發(fā)作可能是由于需要甲硫氨酸來(lái)支持花的發(fā)育?；蛘?，它與野生型植株中CYP79F1表達(dá)水平的升高一致。植物提取物中芥子油苷含量的HPLC分析由9株9周齡35SCYP79F1原代轉(zhuǎn)化體植株和10株7周齡野生型植株每株采集6-8片相同大小的蓮座葉。將組織立即在液氮中冷凍，并凍干48小時(shí)。如下作為脫磺基芥子油苷分析芥子油苷向9-20mg凍干材料中加入3.5ml沸騰的70％(v/v)甲醇、10μl內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(5mM對(duì)羥基苯甲基芥子油苷；Bioraf，丹麥)，并將樣品在沸水浴中保溫4分鐘。沉淀植物材料，用3.5ml 70％(v/v)甲醇再次抽提沉淀，并離心。合并上清液，并在如Wittstock等人，J Biol Chem，27514659-14666，2000所述進(jìn)行硫酸酯酶處理之后通過HPLC進(jìn)行分析。峰的指定是基于相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化合物的停留時(shí)間和UV光譜。相對(duì)于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)并通過應(yīng)答因子(Haughn等人，Plant Physiol，97217-226，1991；Buchner，在《Glucosinolates in rapeseedAnalytical aspects》(油料種子中的芥子油苷分析方面)中，Wathelet編，Martinus Nijhoff出版社，波士頓，第155-181頁(yè)，1987)的使用，對(duì)芥子油苷定量。術(shù)語(yǔ)“總芥子油苷含量”指占野生型擬南芥蓮座葉中芥子油苷含量超過85％的7種主要芥子油苷(3-甲基亞硫酰丙基芥子油苷、4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷、4-甲基硫代丁基芥子油苷、8-甲基亞硫酰辛基芥子油苷、吲哚-3-基甲基芥子油苷、4-甲氧基吲哚-3-基芥子油苷、和N-甲氧基吲哚-3-基芥子油苷)的摩爾量。
由二高甲硫氨酸衍生的芥子油苷即4-甲基亞硫酰芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷占擬南芥葉片中總芥子油苷含量超過50％，而由三高甲硫氨酸衍生的芥子油苷只是葉片中的次要成份(總芥子油苷含量的2.1％)。因此，分析集中于4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷。
三株植株(S1、S7、S9)顯示蓮座葉中4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷水平顯著降低，而兩株植株(S3、S5)顯示這些芥子油苷水平略微升高。在S7、S1、和S9中4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷含量分別降低至0.7、2.2、和2.8μmol/g dw，而在S3和S5中分別升高至12.3和13.3μmol/g dw，比較而言，野生型植株中的水平范圍是5.7-11.5μmol/g dw。4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷的水平受到了相等的影響。既然認(rèn)為由二高甲硫氨酸形成醛肟是在決定4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷與4-甲基硫代丁基芥子油苷量之間的比例的次級(jí)修飾之前進(jìn)行的，那么兩種芥子油苷的總量應(yīng)反映上游酶活性的改變。4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷水平的降低指示S1、S7、和S9中發(fā)生了CYP79F1共遏制。4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷水平在S3和S5中的微弱升高說(shuō)明CYP79F1的表達(dá)水平升高。這說(shuō)明長(zhǎng)鏈甲硫氨酸是脂肪族芥子油苷生物合成中的限速步驟。然而，不能排除低水平積累可能是因T-DNA整合的位置效應(yīng)而低水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因所致。
因?yàn)橛啥呒琢虬彼嵫苌慕孀佑蛙帐且吧蜕徸~中的主要芥子油苷，所以這些芥子油苷水平的改變顯著影響總芥子油苷含量。這在CYP79F1共遏制的植株中特別突出。這些植株的總芥子油苷含量范圍是4.3-4.8μmol/g dw，比較而言，野生型植株的總芥子油苷含量范圍是8.8-17.4μmol/g dw。除了4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷含量的變化，在35SCYP79F1植株中還觀察到其它芥子油苷水平的改變，特別是由甲硫氨酸衍生的芥子油苷。在4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和4-甲基硫代丁基芥子油苷含量降低的植株中，由長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物衍生的其它主要芥子油苷(即3-甲基亞硫酰丙基芥子油苷和8-甲基亞硫酰辛基芥子油苷)的水平也降低。這可以解釋為不僅CYP79F1轉(zhuǎn)錄本被共遏制，而且參與脂肪族芥子油苷生物合成的其它CYP79同源物的轉(zhuǎn)錄本(諸如與CYP79F1具有88％氨基酸同一性的CYP79F2的轉(zhuǎn)錄本)也被共遏制?；蛘撸赡芊从矯YP79F1對(duì)長(zhǎng)鏈甲硫氨酸具有廣泛的底物特異性。長(zhǎng)鏈甲硫氨酸在CYP79F1共遏制植株中積累的事實(shí)指示催化長(zhǎng)鏈甲硫氨酸的酶不受到長(zhǎng)鏈產(chǎn)物的反饋抑制。三種吲哚芥子油苷的含量沒有受到顯著影響。植物提取物中氨基酸含量的分析使用3株12周齡35SCYP79F1轉(zhuǎn)化體原代植株和3株8周齡野生型植株的相同大小的蓮座葉。將每株植株的250mg葉片材料在3ml 50mM KPipH7.5中用Plytron勻漿器進(jìn)行勻漿。以20000g離心10分鐘沉淀植物材料，并用3ml 50mM KPi pH7.5再次抽提兩次。合并水相，真空干燥，并將殘余物溶于100μl水。取一部分再次溶解的提取物用1/10體積的30％水楊磺酸(salicylic sulfonic acid)進(jìn)行處理，并通過離心除去變性的蛋白質(zhì)。用1/10體積的1N NaOH中和上清液?；旧弦勒罩圃焐痰南疵摮绦颍贐iochrom 20氨基酸分析儀(Pharmacia)上用Ultropac 8 Resin Reverse Phase HPLC柱(200×4.6mm)鑒定樣品中的各蛋白質(zhì)氨基酸并定量。
為了將植物材料中的二高甲硫氨酸定量，對(duì)樣品進(jìn)行由制造商推薦的程序略微改動(dòng)的兩種洗脫程序。程序1如下53℃ 7分鐘，緩沖液A；50℃ 35分鐘，緩沖液A；95℃ 34分鐘，緩沖液A。程序2如下53℃ 7分鐘，緩沖液A；58℃ 12分鐘，緩沖液B；95℃ 25分鐘，緩沖液C。緩沖液A是0.2M醋酸鈉pH3.25，緩沖液B是0.2M醋酸鈉，pH4.25，緩沖液C是1.2M醋酸鈉，pH6.25。在程序1中，苯丙氨酸和二高甲硫氨酸于63.6分鐘共洗脫。在程序2中，酪氨酸和二高甲硫氨酸于25.3分鐘共洗脫。作為程序1中對(duì)應(yīng)于苯丙氨酸和二高甲硫氨酸的峰面積與程序2中對(duì)應(yīng)于苯丙氨酸的峰面積之間的差值，以及作為程序2中對(duì)應(yīng)于酪氨酸和二高甲硫氨酸的峰面積與程序1中對(duì)應(yīng)于酪氨酸的峰面積之間的差值來(lái)量化二高甲硫氨酸。使用真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定二高甲硫氨酸的應(yīng)答系數(shù)。
為了將植物材料中的三高甲硫氨酸定量，也對(duì)樣品進(jìn)行由制造商推薦的程序略微改動(dòng)的洗脫程序。程序3如下53℃ 7分鐘，緩沖液A；58℃ 5分鐘，緩沖液B；95℃ 7分鐘，緩沖液B；95℃ 25分鐘，緩沖液C。三高甲硫氨酸于29.0分鐘洗脫，并使用用真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定的應(yīng)答系數(shù)，作為峰面積量化。
S7即芥子油苷含量降低最顯著并具有強(qiáng)形態(tài)表型的35SCYP79F1植株中，二高甲硫氨酸和三高甲硫氨酸含量的分析揭示了相比于野生型植株有50倍升高。三高甲硫氨酸積累至野生型植株中含量的4倍。在S9中觀察到二高甲硫氨酸含量升高15倍，而沒有檢測(cè)到三高甲硫氨酸含量的升高。RT-PCR的表達(dá)分析為了檢查由不同植物組織獲得的RNA制劑中的成份對(duì)RT反應(yīng)的抑制，使用由通過Scal消化線性化的pBluescript II SK載體(Stratagene)合成的對(duì)照RNA。在添加500μM rNTP、10mM DTT、100URNAsin Ribonuclease inhibitor即RNA酶抑制劑(Promega)、3μg線性化pBluescript II SK、和50U T3 RNA聚合酶(Promega)的Transcription Optimized Buffer即轉(zhuǎn)錄優(yōu)化緩沖液(Promega)中建立總體積100μl的合成反應(yīng)。于37℃保溫2小時(shí)后，加入20U不含RNA酶的DNA酶，并將反應(yīng)液于37℃繼續(xù)保溫1小時(shí)。酚和CHCl3抽提及乙醇沉淀后，將RNA溶于用焦碳酸二乙酯處理過的水中。
由擬南芥采集下列組織(1)4周齡植株(以8小時(shí)光照/16小時(shí)黑暗培養(yǎng))的總植物組織；(2)蓮座葉(不含葉柄)(3)5周齡植株(花轉(zhuǎn)換開始前；以8小時(shí)光照/16小時(shí)黑暗培養(yǎng))的地上部分；(4)蓮座葉(不含葉柄)；和(5)開花植株(9周齡；以12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗培養(yǎng)以誘導(dǎo)開花)的莖生葉。
使用TRIZOL試劑(GIBCO BRL)由所述組織分離總RNA。通過分光光度法對(duì)RNA定量，并用于合成第一條cDNA鏈。為了確保RT-PCR的線性，第一條cDNA鏈合成是在1μg、0.3μg、和0.1μg每種RNA集合上進(jìn)行的。在添加0.5mM dNTP、10mM DTT、200ng隨機(jī)六聚體(Pharmacia)、3pg對(duì)照RNA(內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物)、和200U SUPERSCRIPT II逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCOBRL)的First Strand Buffer即第一鏈緩沖液(GIBCO BRL)中(總體積20μl)合成cDNA。將反應(yīng)混合液于27℃保溫10分鐘，隨后于42℃保溫50分鐘，并于95℃滅活5分鐘。通過PCR純化試劑盒(QIAGEN；用50μl 1mM Tris緩沖液pH8進(jìn)行洗脫)的手段純化RT反應(yīng)。取2μl純化后的RT反應(yīng)液進(jìn)行PCR。在添加200μM dNTP、1.5mM MgCl2、50pmol有義引物、50pmol反義引物、和2.5U Platinum Taq DNA聚合酶(GIBCOBRL)的PCR緩沖液(GIBCO BRL)中建立總體積50μl的PCR反應(yīng)。PCR程序如下94℃ 2min，32個(gè)循環(huán)的94℃ 30sec、57℃ 30sec、72℃50sec。取10μl PCR反應(yīng)液在1％瓊脂糖凝膠上通過凝膠電泳進(jìn)行分析。通過溴化乙啶染色使條帶顯影，并在Gel Doc 2000Transilluminator(Biorad)上進(jìn)行定量。用于分析CYP79F1轉(zhuǎn)錄本的引物是引物5(有義方向)和引物6(反義方向)。在57℃時(shí)，引物5不與包含CYP79F1基因的基因組DNA發(fā)生退火，因?yàn)橐?的序列與CYP79F1基因111bp內(nèi)含子側(cè)翼的序列互補(bǔ)。引物6與CYP79F1的3’非翻譯區(qū)發(fā)生退火，而且對(duì)CYP79F1高度特異。用于分析內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的引物是引物7(有義方向)和引物8(反義引物)。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的PCR分析顯示RT反應(yīng)與用不同量的、由不同植物組織分離的RNA制備的樣品同樣有效地進(jìn)行。
在所有檢查的組織中都檢測(cè)到CYP79F1轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄本水平隨植株的突變而升高。9周齡開花植株蓮座葉中的表達(dá)水平比5周齡植株蓮座葉高大約4倍。在分析5周齡植株的地上部分時(shí)，檢測(cè)到的CYP79F1轉(zhuǎn)錄本比相同植株的蓮座葉少。這指示CYP79F1在蓮座葉中的表達(dá)水平高于葉柄。
序列表序列表<110>Novartis AGRoyal Veterinary and Agricultural University<120>CYP79家族的P450單加氧酶<130>S-31292A<140><141><150>EP 00100646.9<151>2000-01-13<150>EP 00107001.0<151>2000-03-30<150>EP 00109423.4<151>2000-05-03<150>EP 00114184.5<151>2000-07-13<150>EP 00114912.9<151>2000-07-17<160>85<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>542<212>PRT<213>木薯(Manihot esculenta)<400>1Met Ala Met Asn Val Ser Thr Thr Ile Gly Leu Leu Asn Ala Thr Ser1 5 10 15Phe Ala Ser Ser Ser Ser Ile Asn Thr Val Lys Ile Leu Phe Val Thr20 25 30Leu phe Ile Ser Ile Val Ser Thr Ile Val Lys Leu Gln Lys Ser Ala35 40 45Ala Asn Lys Glu Gly Ser Lys Lys Leu Pro Leu Pro Pro Gly Pro Thr50 55 60Pro Trp Pro Leu Ile Gly Asn Ile Pro Glu Met Ile Arg Tyr Arg Pro65 70 75 80Ihr phe Arg Trp Ile His Gln Leu Met Lys Asp Met Asn Thr Asp Ile85 90 95Cys Leu Ile Arg Phe Gly Arg Thr Asn Phe Val Pro Ile Ser Cys Pro
100 105 110Val Leu Ala Arg Glu Ile Leu Lys Lys Asn Asp Ala Ile Phe Ser Asn115 120 125Arg Pro Lys Thr Leu Ser Ala Lys Ser Met Ser Gly Gly Tyr Leu Thr130 135 140Thr Ile Val Val Pro Tyr Asn Asp Gln Trp Lys Lys Met Arg Lys Ile145 150 155 160Leu Thr Ser Glu Ile Ile Ser Pro Ala Arg His Lys Trp Leu His Asp165 170 175Lys Arg Ala Glu Glu Ala Asp Asn Leu Val Phe Tyr Ile His Asn Gln180 185 190Phe Lys Ala Asn Lys Asn Val Asn Leu Arg Thr Ala Thr Arg His Tyr195 200 205Gly Gly Asn Val Ile Arg Lys Met Val Phe Ser Lys Arg Tyr Phe Gly210 215220Lys Gly Met Pro Asp Gly Gly Pro Gly Pro Glu Glu Ile Glu His Ile225 230 235 240Asp Ala Val Phe Thr Ala Leu Lys Tyr Leu Tyr Gly Phe Cys Ile Ser245 250 255Asp Phe Leu Pro Phe Leu Leu Gly Leu Asp Leu Asp Gly Gln Glu Lys260265 270Phe Val Leu Asp Ala Asn Lys Thr Ile Arg Asp Tyr Gln Asn Pro Leu275 280 285Ile Asp Glu Arg Ile Gln Gln Trp Lys Ser Gly Glu Arg Lys Glu Met290 295 300Glu Asp Leu Leu Asp Val Phe Ile Thr Leu Lys Asp Ser Asp Gly Asn305 310 315 320Pro Leu Leu Thr Pro Asp Glu Ile Lys Asn Gln Ile Ala Glu Ile Met325 330 335Ile Ala Thr Val Asp Asn Pro Ser Asn Ala Ile Glu Trp Ala Met Gly340 345 350Glu Met Leu Asn Gln Pro Glu Ile Leu Lys Lys Ala Thr Glu Glu Leu355 360 365Asp Arg Val Val Gly Lys Asp Arg Leu Val Gln Glu Ser Asp Ile Pro370 375 380Asn Leu Asp Tyr Val Lys Ala Cys Ala Arg Glu Ala Phe Arg Leu His385 390 395 400Pro Val Ala His Phe Asn Val Pro His Val Ala Met Glu Asp Thr Val405 410 415Ile Gly Asp Tyr Phe Ile Pro Lys Gly Ser Trp Ala Val Leu Ser Arg420 425 430Tyr Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Thr Trp Ser Asp Pro Leu Lys Tyr435 440 445Asp Pro Glu Arg His Met Asn Glu Gly Glu Val Val Leu Thr Glu His450 455 460Glu Leu Arg Phe Val Thr Phe Ser Thr Gly Arg Arg Gly Cys Val Ala465 470 475 480Ser Leu Leu Gly Ser Cys Met Thr Thr Met Leu Leu Ala Arg Met Leu485 490 495Gln Cys Phe Thr Trp Thr Pro Pro Ala Asn Val Ser Lys Ile Asp Leu500 505 510Ala Glu Thr Leu Asp Glu Leu Thr Pro Ala Thr Pro Ile Ser Ala Phe515 520 525Ala Lys Pro Arg Leu Ala Pro His Leu Tyr Pro Thr Ser Pro530 535 540<210>2<211>1845<212>DNA<213>木薯(Manihot esculenta)<400>2gttcagggca tatcaatatg gccatgaacg tctccaccac catcggttta cttaacgcca 60cctccttcgc ctcctcctcc tccatcaaca cggtcaagat cttgttcgtc accctcttta 120tttccattgt tagtactatt gtaaaacttc aaaagagtgc tgctaacaag gaaggtagca 180agaaactccc actccctcct ggccctactc catggccact catcggaaac atcccggaaa 240tgatccggta cagacccacg tttcggtgga ttcaccaact catgaaggac atgaacactg 300atatttgtct cattcgtttt ggaagaacta actttgttcc tataagctgt cctgttcttg 360ctcgtgaaat actaaaaaag aatgacgcta tcttctctaa caggccaaag actctctctg 420caaaatctat gagcggagga tacttgacaa ctattgtggt gccatacaat gaccaatgga 480agaaaatgag gaagatctta acctcagaga tcatttctcc ggccagacac aaatggctcc 540atgataaaag agctgaggag gctgataatc ttgtgttcta catccacaac cagttcaaag 600caaataaaaa tgtgaatttg agaacagcca ccaggcatta cggcgggaat gtgatcagaa 660aaatggtgtt cagcaagaga tacttcggca agggaatgcc ggacggagga ccagggcctg 720aagaaatcga gcacattgat gccgttttca ctgccttgaa atacttgtat gggttttgca 780tatcagattt cttgcctttc ttgttgggac ttgatctgga tggccaagaa aaatttgtgc 840ttgatgcaaa taagaccata agggattatc agaacccttt aattgatgaa aggattcaac 900aatggaagag tggtgaaagg aaggaaatgg aggacttgct tgatgttttc atcactctca 960aggattcaga cggcaaccca ttgctcactc ctgacgagat caagaatcaa atagctgaaa 1020ttatgatagc aacagtagat aacccatcaa acgcaatcga atgggcaatg ggggagatgc 1080taaatcaacc agaaatcctg aagaaggcca cagaagagct cgacagggtg gtcggcaaag 1140acaggcttgt tcaagaatcc gacatcccca accttgacta tgtcaaagcc tgtgcaagag 1200aagccttcag gctccatcca gtagcacact tcaatgtccc tcatgtagcc atggaagaca 1260ctgtcattgg tgattacttt attccaaagg gcagctgggc agttctcagc cgctatgggc 1320tcggcaggaa cccaaagaca tggtctgatc ctctcaagta cgatccagaa aggcacatga 1380acgagggaga ggtggtgctc actgagcacg agttaaggtt tgtgactttc agcactggaa 1440gacgtggctg cgtagcttcg ttgcttggaa gctgcatgac gacgatgttg ctggcgagga 1500tgctgcagtg cttcacttgg actccaccag ccaatgtttc caagattgat ctcgccgaga 1560ctctagatga gcttactcct gcaacaccca tctctgcatt tgccaagcct cgcctggctc 1620ctcatctcta cccaacgtca ccttgaaaga gagatcagat cttatcagtt cttagaacgt 1680cctttaatta tgatttgcta aaaacaaata aaaatcattt ggttattgtg taggtaatct 1740tacaagcttc ctgtttattg agagttgtta attaactctc aaaatgattt gtggggttat 1800cttgtttctc ttgcaatata gttgctttac tagaaaaaaa aaaaa 1845<210>3<211>541<212>PRT<213>木薯(Manihot esculenta)<400>3Met Ala Met Asn Val Ser Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ser Phe Ala1 5 10 15Ser Thr Ser Ser Met Asn Asn Thr Ala Lys Ile Leu Leu Ile Thr Leu20 25 30Phe Ile Ser Ile Val Ser Thr Val Ile Lys Leu Gln Lys Arg Ala Ser35 40 45Tyr Lys Lys Ala Ser Lys Asn Phe Pro Leu Pro Pro Gly Pro Thr Pro50 55 60Trp Pro Leu Ile Gly Asn Ile Pro Glu Met Ile Arg Tyr Arg Pro Thr65 70 75 80Phe Arg Trp Ile His Gln Leu Met Lys Asp Met Asn Thr Asp Ile Cys85 90 95Leu Ile Arg Phe Gly Lys Thr Asn Val Val Pro Ile Ser Cys Pro Val100 105 110Ile Ala Arg Glu Ile Leu Lys Lys His Asp Ala Val Phe Ser Asn Arg115 120 125Pro Lys Ile Leu Cys Ala Lys Thr Met Ser Gly Gly Tyr Leu Thr Thr130 135 140Ile Val Val Pro Tyr Asn Asp Gln Trp Lys Lys Met Arg Lys Val Leu145 150 155 160Thr Ser Glu Ile Ile Ser Pro Ala Arg His Lys Trp Leu His Asp Lys165 170 175Arg Ala Glu Glu Ala Asp Gln Leu Val Phe Tyr Ile Asn Asn Gln Tyr180 185 190Lys Ser Asn Lys Asn Val Asn Val Arg Ile Ala Ala Arg His Tyr Gly195 200 205Gly Asn Val Ile Arg Lys Met Met Phe Ser Lys Arg Tyr Phe Gly Lys210 215 220Gly Met Pro Asp Gly Gly Pro Gly Pro Glu Glu Ile Met His Val Asp225 230 235 240Ala Ile Phe Thr Ala Leu Lys Tyr Leu Tyr Gly Phe Cys Ile Ser Asp245 250 255Tyr Leu Pro Phe Leu Glu Gly Leu Asp Leu Asp Gly Gln Glu Lys Ile260 265 270Val Leu Asn Ala Asn Lys Thr Ile Arg Asp Leu Gln Asn Pro Leu Ile275 280 285Glu Glu Arg Ile Gln Gln Trp Arg Ser Gly Glu Arg Lys Glu Met Glu290 295 300Asp Leu Leu Asp Val Phe Ile Thr Leu Gln Asp Ser Asp Gly Lys Pro305 310 315 320Leu Leu Asn Pro Asp Glu Ile Lys Asn Gln Ile Ala Glu Ile Met Ile325 330 335Ala Thr Ile Asp Asn Pro Ala Asn Ala Val Glu Trp Ala Met Gly Glu340 345 350Leu Ile Asn Gln Pro Glu Leu Leu Ala Lys Ala Thr Glu Glu Leu Asp355 360 365Arg Val Val Gly Lys Asp Arg Leu Val Gln Glu Ser Asp Ile Pro Asn370 375 380Leu Asn Tyr Val Lys Ala Cys Ala Arg Glu Ala Phe Arg Leu His Pro385 390 395 400Val Ala Tyr Phe Asn Val Pro His Val Ala Met Glu Asp Ala Val Ile405 410 415Gly Asp Tyr Phe Ile Pro Lys Gly Ser Trp Ala Ile Leu Ser Arg Tyr420 425 430Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Thr Trp Pro Asp Pro Leu Lys Tyr Asp435 440 445Pro Glu Arg His Leu Asn Glu Gly Glu Val Val Leu Thr Glu His Asp450 455 460Leu Arg Phe Val Thr Phe Ser Thr Gly Arg Arg Gly Cys Val Ala Ala465 470 475 480Leu Leu Gly Thr Thr Met Ile Thr Met Met Leu Ala Arg Met Leu Gln485 490 495Cys Phe Thr Trp Thr Pro Pro Pro Asn Val Thr Arg Ile Asp Leu Ser500 505 510Glu Asn Ile Asp Glu Leu Thr Pro Ala Thr Pro Ile Thr Gly Phe Ala515 520 525Lys Pro Arg Leu Ala Pro His Leu Tyr Pro Thr Ser Pro530 535 540<210>4<211>1920<212>DNA<213>木薯(Manihot esculenta)<400>4ggtcttggtc atagccctgg acttgaattg ttcagggcaa caccaatatg gccatgaacg 60tctccaccac cgcaaccacc acggcctcct tcgcctccac gtcctccatg aacaatactg 120ccaaaatcct ccttatcacc ctcttcattt ccattgtcag tactgttata aaacttcaaa 180aaagggcatc ctacaagaaa gctagcaaga acttcccact ccctcctggt ccgactccat 240ggccactcat cggaaacatc cctgaaatga tccggtacag accgacgttt cgttggattc 300accaactcat gaaggacatg aacaccgata tttgtctgat ccgtttcgga aaaactaacg 360ttgttcctat tagctgccct gtcattgctc gtgaaatcct gaaaaagcac gatgctgtct 420tctctaacag gccaaagatt ctctgcgcta aaacaatgag cggcggatac ttgacgacga 480ttgtggtgcc atacaatgat caatggaaga aaatgaggaa ggtcctaact tcagagatca 540tttctccagc taggcacaaa tggctccatg ataagagagc tgaggaagca gatcagcttg 600tgttctatat caataaccag tacaagagca acaagaatgt gaatgtgaga attgcggcaa 660ggcattacgg tggaaatgtg atcagaaaga tgatgtttag caagagatac ttcggcaaag 720ggatgcctga tggaggacca gggcctgaag aaatcatgca cgttgatgca atttttacag 780cacttaaata tttgtatgga ttttgcatct ctgattactt gccttttttg gaggggcttg 840atcttgatgg ccaggaaaag attgtgctta atgcaaataa gaccataagg gatcttcaaa 900acccattaat agaagaaagg attcaacaat ggaggagtgg tgaaagaaag gaaatggaag 960acttgcttga tgttttcatt actcttcagg attcagatgg caagccattg ctcaatccag 1020acgagataaa gaatcaaatc gctgaaatta tgatagcaac aatagacaac ccagcaaacg 1080ccgtagaatg ggcaatgggg gagctgataa atcaaccaga acttctggca aaggccacag 1140aggaacttga cagagtggtc ggcaaagaca ggcttgtgca agaatctgac atccctaatc 1200ttaattacgt caaagcctgt gcaagggagg ccttcaggct ccacccagtt gcatacttca 1260acgtccctca cgtagccatg gaagacgccg tcatcggcga ttacttcatt ccaaagggca 1320gctgggcaat tcttagccgc tacgggctcg gccggaaccc aaaaacatgg cctgatccac 1380tcaagtacga cccagaaagg cacttgaacg agggcgaagt ggtgctgact gagcacgacc 1440ttaggttcgt cacattcagc actggacgtc gtgggtgtgt cgctgctttg cttggaacca 1500ccatgattac gatgatgctg gccaggatgc ttcagtgctt cacttggact ccacccccta 1560atgtaaccag gattgatctc agtgagaata tcgatgagct tactccagca acacccatca 1620ctggatttgc taagccacgg ttggctcctc atctctaccc cacttcacct tgaattaaag 1680cccaaagatg ggaagggatg aatgtgagtt gttagaagtt ttaataaaaa aattattggg 1740tttatatgtg taattacgtg gtaaccttac aaagtgtctg ttattgagag ttttaatctc 1800tcaaaataat ttgtgtggct aagatttctt catctttgta tctcttgcaa ttgtttgctc 1860tataaaacat cttatttcct taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>修飾堿基<222>(14)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(20)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(23)<223>i<220><223>人工序列的描述寡核苷酸序列<400>5gcggaattca rggnaayccn ytnct25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>修飾堿基<222>(18)<223>i<220><223>人工序列的描述寡核苷酸序列<400>6cgcggatccg gdatrtcnga ytcytg 26<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸序列<400>7cgaaacgatg gctatgaacg tctct25<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸序列<400>8tggtagagac gttcatagcc atcgttt 27<210>9<211>540<212>PRT<213>海韭菜(Triglochin maritima)<400>9Met Glu Leu Ile Thr Ile Leu Pro Ser Val Leu Pro Asn Ile His Ser1 5 10 15Thr Ala Thr Val Leu Phe Leu Leu Leu Leu Thr Thr Ala Leu Ser Phe20 25 30Leu Phe Leu Phe Lys Gln His Leu Thr Lys Leu Thr Lys Ser Lys Ser35 40 45Lys Ser Thr Thr Leu Pro Pro Gly Pro Arg Pro Trp Pro Ile Val Gly50 55 60Ser Leu Val Ser Met Tyr Met Asn Arg Pro Ser Phe Arg Trp Ile Leu65 70 75 80Ala Gln Met Glu Gly Arg Arg Ile Gly Cys Ile Arg Leu Gly Gly Val85 90 95His Val Val Pro Val Asn Cys Pro Glu Ile Ala Arg Glu Phe Leu Lys100 105 110Val His Asp Ala Asp Phe Ala Ser Arg Pro Val Thr Val Val Thr Arg115 120 125Tyr Ser Ser Arg Gly Phe Arg Ser Ile Ala Val Val Pro Leu Gly Glu130 135 140Gln Trp Lys Lys Met Arg Arg Val Val Ala Ser Glu Ile Ile Ash Ala145 150 155 160Lys Arg Leu Gln Trp Gln Leu Gly Leu Arg Thr Glu Glu Ala Asp Asn165 170 175Ile Met Arg Tyr Ile Thr Tyr Gln Cys Asn Thr Ser Gly Asp Thr Asn180 185 190Gly Ala Ile Ile Asp Val Arg Phe Ala Leu Arg His Tyr Cys Ala Asn195 200 205Val Ile Arg Arg Met Leu Phe Gly Lys Arg Tyr Phe Gly Ser Gly Gly210 215 220Glu Gly Gly Gly Pro Gly Lys Glu Glu Ile Glu His Val Asp Ala Thr225 230 235 240Phe Asp Val Leu Gly Leu Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Ala Asp Tyr Val245 250 255Ser Trp Leu Lys Phe Leu Asp Leu His Gly Gln Glu Lys Lys Val Lys260 265 270Lys Ala Ile Asp Val Val Asn Lys Tyr His Asp Ser Val Ile Glu Ser275 280 285Arg Arg Glu Arg Lys Val Glu Gly Arg Glu Asp Lys Asp Pro Glu Asp290 295 300Leu Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Lys Asp Ser Asn Gly Lys Pro Leu305 310 315 320Leu Asp Val Glu Glu Ile Lys Ala Gln Ile Ala Asp Leu Thr Tyr Ala325 330 335Thr Val Asp Asn Pro Ser Asn Ala Val Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met340 345 350Leu Asn Asn Pro Asp Ile Leu Gln Lys Ala Thr Asp Glu Val Asp Gln355 360 365Val Val Gly Arg His Arg Leu Val Gln Glu Ser Asp Phe Pro Asn Leu370 375 380Pro Tyr Ile Arg Ala Cys Ala Arg Glu Ala Leu Arg Leu His Pro Val385 390 395 400Ala Ala Phe Asn Leu Pro His Val Ser Leu Arg Asp Thr His Val Ala405 410 415Gly Phe Phe Ile Pro Lys Gly Ser His Val Leu Leu Ser Arg Val Gly420 425 430Leu Gly Arg Asn Pro Lys Val Trp Asp Asn Pro Leu Arg Phe Asp Pro435 440 445Asp Arg His Leu His Gly Gly Pro Thr Ala Lys Val Glu Leu Ala Glu450 455 460Pro Glu Leu Arg Phe Val Ser Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Cys Met465 470 475 480Gly Gly Pro Leu Gly Thr Ala Met Thr Tyr Met Leu Leu Ala Arg Phe485 490 495Val Gln Gly Phe Thr Trp Gly Leu Arg Pro Ala Val Glu Lys Val Glu500 505 510Leu Glu Glu Glu Lys Cys Ser Met Phe Leu Gly Lys Pro Leu Arg Ala515 520 525Leu Ala Lys Pro Arg Gln Glu Leu Leu Gln Ser Phe530 535 540<210>10<211>1858<212>DNA<213>海韭菜(Triglochin maritima)<400>10caatgcattg ctcccactag cccactacgt actataaatg catgcaccac tccacctctc 60ctcctcagta gcaaaatgga actcataacc attcttccat cagtgcttcc taacatccac 120tctactgcca cagtactgtt cctcttgcta ctcaccacag ccctctcctt cctcttcctc 180ttcaaacaac acctcactaa gctaaccaag tccaagtcca agtccaccac attgccaccc 240ggcccccgac catggcccat cgttggcagc ctcgtgtcga tgtacatgaa ccggccgtct 300ttccggtgga tactagccca gatggagggg agaaggatag ggtgcattag gttgggtggt 360gttcatgttg ttccggttaa ttgtcctgag attgctaggg agtttcttaa ggtgcatgat 420gctgattttg catcgcgtcc ggtcacggtt gtgactcgct actcgtctcg tgggttccgg 480tctattgccg tggttccact gggggagcaa tggaagaaga tgaggagggt ggtggcgtcg 540gagattatta atgctaagag gctccaatgg cagcttgggc ttagaaccga agaagccgac 600aacataatga ggtacatcac ctaccaatgc aacacttcgg gcgacactaa cggagcgatt 660atcgacgtcc gcttcgccct ccgccactac tgtgccaatg tcatccggcg aatgctgttc 720gggaaacgct acttcggaag cggtggagaa ggcggtgggc cgggaaagga ggagattgag 780cacgttgacg ccaccttcga cgtcttgggt ctaatatacg ccttcaatgc ggcggactac 840gtgtcgtggt tgaagttctt agacttgcat gggcaggaga agaaggttaa gaaggccatt 900gatgtggtga ataagtatca tgactccgtt atcgagtcga ggagggagag gaaagtagag 960ggaagagagg acaaggatcc agaggatctt cttgatgtgc ttttgtcgct taaggattct 1020aatgggaagc ctctcttgga cgtggaggag atcaaagcac aaattgcgga tttgacgtac 1080gcaacagttg ataacccgtc gaacgccgtg gaatgggcac tagccgagat gctgaacaac 1140ccggacatcc tccaaaaggc gaccgacgag gtagaccagg tcgtcggaag gcaccgtctc 1200gtacaagaat ccgacttccc gaacctcccc tacatccggg cctgcgcccg ggaggccctc 1260cgtctccacc ctgtcgcggc cttcaacctc ccccacgtgt cccttcgtga cactcatgtc 1320gccggttttt tcattccaaa aggcagccac gttctcctga gtcgcgtcgg cctcggacgc 1380aaccccaagg tctgggacaa cccgcttcga ttcgaccccg accgacacct ccacggcggg 1440cccaccgcca aagtcgagct ggccgagccg gagctgaggt tcgtgtcgtt caccaccggg 1500aggagagggt gcatgggggg cccacttggg actgccatga cttatatgct gcttgctagg 1560ttcgtccagg gtttcacttg gggtcttcgc cctgctgtgg agaaggttga gcttgaggag 1620gagaagtgta gcatgttctt gggcaagcca ttaagggctt tggctaagcc acgtcaggag 1680ctgctccaga gcttctaatt agggttaggg tttgggttgg attaataata cttatgaaat 1740gcacgtttat gagtctataa atattatcca tgtaagtgtt atatgttttc gtgcaatcct 1800attatccatg taagttaaat ttgataccat gaatgagttt atatgtgaaa aaaaaaaa 1858<210>11<211>533<212>PRT<213>海韭菜(Triglochin maritima)<400>11Leu Ile Thr Ile Leu Pro Ser Val Leu Pro Asn Ile His Ser Ser Alal 5 10 15Thr Leu Phe Leu Leu Leu Leu Met Thr Thr Ala Leu Ser Phe Leu Phe20 25 30Leu Phe Lys Gln His Leu Ala Lys Leu Thr Lys Pro Lys Ser Thr Thr35 40 45Leu Pro Pro Gly Pro Arg Pro Trp Pro Ile Val Gly Ser Leu Val Ser50 55 60Met Tyr Met Asn Arg Pro Ser Phe Arg Trp Ile Leu Ala Gln Met Glu65 70 75 80Gly Arg Arg Ile Gly Cys Ile Arg Leu Gly Gly Val His Val Val Pro85 90 95Val Asn Cys Pro Glu Ile Ala Arg Glu Phe Leu Lys Val His Asp Ser100 105 110Asp Phe Ala Ser Arg Pro Val Thr Val Val Thr Arg Tyr Ser Ser Arg115 120 125Gly Phe Arg Ser Ile Ala Val Val Pro Leu Gly Glu Gln Trp Lys Lys130 135 140Met Arg Arg Val Val Ala Ser Glu Ile Ile Asn Ala Lys Arg Leu Gln145 150 155 160Trp Gln Leu Gly Leu Arg Thr Glu Glu Ala Asp Asn Ile Val Arg Tyr165 170 175Ile Thr Tyr Gln Cys Asn Thr Ser Gly Asp Thr Ser Gly Ala Ile Ile180 185 190Asp Val Arg Phe Ala Leu Arg His Tyr Cys Ala Asn Val Ile Arg Arg195 200 205Met Leu Phe Gly Lys Arg Tyr Phe Gly Ser Gly Gly Val Gly Gly Gly210 215 220Pro Gly Lys Glu Glu Ile Glu His Val Asp Ala Thr Phe Asp Val Leu225 230 235 240Gly Leu Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Ala Asp Tyr Val Ser Trp Leu Lys245 250 255Phe Leu Asp Leu His Gly Gln Glu Lys Lys Val Lys Lys Ala Ile Asp260 265 270Val Val Asn Lys Tyr His Asp Ser Val Ile Asp Ala Arg Thr Glu Arg275 280 285Lys Val Glu Asp Lys Asp Pro Glu Asp Leu Leu Asp Val Leu Phe Ser290 295 300Leu Lys Asp Ser Asn Gly Lys Pro Leu Leu Asp Val Glu Glu Ile Lys305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Asp Leu Thr Tyr Ala Thr Val Asp Asn Pro Ser Asn325 330 335Ala Val Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Leu Asn Asn Pro Ala Ile Leu340 345 350Gln Lys Ala Thr Asp Glu Leu Asp Gln Val Val Gly Arg His Arg Leu355 360 365Val Gln Glu Ser Asp Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Ile Arg Ala Cys Ala370 375 380Arg Glu Ala Leu Arg Leu His Pro Val Ala Ala Phe Asn Leu Pro His385 390 395 400Val Ser Leu Arg Asp Thr His Val Ala Gly Phe Phe Ile Pro Lys Gly405 410 415Ser His Val Leu Leu Ser Arg Val Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Val420 425 430Trp Asp Asn Pro Leu Gln Phe Asn Pro Asp Arg His Leu His Gly Gly435 440 445Pro Thr Ala Lys Val Glu Leu Ala Glu Pro Glu Leu Arg Phe Val Ser450 455 460Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Cys Met Gly Gly Leu Leu Gly Thr Ala465 470 475 480Met Thr Tyr Met Leu Leu Ala Arg Phe Val Gln Gly Phe Thr Trp Gly485 490 495Leu His Pro Ala Val Glu Lys Val Glu Leu Gln Glu Glu Lys Cys Ser500 505 510Met Phe Leu Gly Glu Pro Leu Arg Ala Phe Ala Lys Pro Arg Leu Glu515 520 525Leu Leu Gln Ser Phe530<210>12<211>1778<212>DNA<213>海韭菜(Triglochin maritima)<400>12ctcataacca ttcttccatc agtgctacca aacatccact cttctgccac attgttcctc 60ttgctactca tgaccacagc cctctccttc ctcttcctct tcaaacaaca cctcgctaag 120ctaaccaaac ccaagtccac cacattgcca cctggccccc gaccctggcc catcgttggc 180agcctcgtgt cgatgtacat gaaccggccg tccttccggt ggatactagc ccagatggag 240gggaggagga tagggtgcat taggttgggt ggtgttcatg ttgttccggt taattgtcct 300gagattgcta gggagtttct taaggtgcat gattctgatt ttgcatcgcg tccggtcacg 360gttgtgactc gctactcgtc tcgtgggttc cggtctattg ccgtggttcc actgggggag 420cagtggaaga agatgaggag ggtggtggca tcggagatta ttaatgctaa gaggctccaa 480tggcagcttg ggcttagaac cgaagaagcc gacaacatag tgaggtacat cacctaccaa 540tgcaacactt cgggcgacac tagcggagcg attatcgacg tccgcttcgc cctccgccac 600tactgtgcca atgtcatccg gcgaatgctg ttcggaaaac gctactttgg tagcggtgga 660gtaggcggtg ggcctggaaa ggaggagatt gagcacgttg acgccacctt cgacgtcttg 720ggtctaatat acgccttcaa tgcggcggac tacgtgtcgt ggttgaagtt cttagacttg 780catgggcagg agaagaaggt taagaaggcc attgatgtgg tgaataagta tcatgactcc 840gttatcgacg cgaggacaga gagaaaagtg gaggataagg atccagagga tcttcttgat 900gtgctttttt cgcttaagga ttctaatgga aagcctctct tggacgtgga ggagatcaaa 960gcacaaattg cggatttgac gtacgcaaca gttgacaacc cgtcgaacgc cgtggaatgg 1020gcactagccg agatgctgaa caacccggcc atcctccaaa aggcgaccga cgagctagac 1080caggtcgtcg gaaggcaccg tctcgtacaa gaatccgact tcccgaacct cccctacatc 1140cgtgcctgcg cccgggaggc cctccgtctc cacccggtcg cggctttcaa cctcccccac 1200gtgtcccttc gtgacactca cgtcgccggc ttctttattc ccaaaggcag ccacgttctc 1260ctgagtcgcg ttggcctcgg acgcaacccc aaggtgtggg acaacccgct tcaattcaac 1320ccagaccgac acctccacgg cgggcccacc gccaaagtcg agctggccga accggagctg 1380aggttcgtgt cgttcaccac cgggaggaga gggtgcatgg ggggcctact tgggactgcc 1440atgacttata tgctgcttgc taggttcgtc cagggtttca cttgggggct tcaccctgct 1500gtggagaagg ttgagcttca ggaggagaag tgtagcatgt tcttgggcga gccattgaga 1560gcttttgcta agccacgtct ggagctgctc cagagcttct aattagtttt ggattaataa 1620taactataat tactaccgat gtccttaaag ttgcatgtcg tgtaactagc acttgttata 1680tttatagtta tgaaaggtac gtttatgaat ctataaaaat tatccatgta attgttatat 1740gttttcgtgc aatcgtattg tgagtttggt ttacaaaa 1778<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<220><221>修飾堿基<222>(18)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(21)<223>i<400>13gcggaattcg ayaayccnws naaygc 26<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<220><221>修飾堿基<222>(11)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(17)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(20)<223>i<400>14gcggatccgc nacrtgnggn ahrttraa 28<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<220><221>修飾堿基<222>(12)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(18)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(21)<223>i<400>15gcggaattcw snaaygcnrt ngartgg 27<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<220><221>修飾堿基<222>(15)..(17)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(21)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(24)<223>i<400>16gcggatccrt traannnngc nacnggrtg 29<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>17gcggaattcc acacaggaaa cagctatgac30<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>18gcggatccag acgagtagcg agtcacaac 29<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>19gcggatccaa gaggaacagt act 23<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>20gcggatccaa gaggaacaat gtg 23<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>21gcgaatgcat tgctcccact agcc 24<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>22gcgatggtta tgagttcca ttttg 24<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>23gcgcatatgg aactaataac aattctt 27<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>24gcgaagctta ttagaagctc tggagcag 28<210>25<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>25gcgcatatgg ctctgttatt agcagttttt ttcctcttcc tcttcaaaca a51<210>26<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>26gcgcatatgg ctcgtcaagt tcattcttct tggaatttac caccaggccc c51<210>27<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>27Asp Asn pro Ser Asn Ala1 5<210>28<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<220><221>變體<222>(3)<223>V或L<400>28Phe Asn Xaa Pro His Val Ala1 5<210>29<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>29Ser Asn Ala Val Glu Trp15<210>30<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>30His Pro Val Ala Xaa Phe Asn1 5<210>31<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>31Val Val Thr Arg Tyr Ser Ser1 5<210>32<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>32Thr Val Leu Phe Leu Leu1 5<210>33<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>33Ala Thr Leu Phe Leu Leu1 5<210>34<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>34Met Glu Leu Ile Thr Ile1 5<210>35<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>35Met Glu Leu Ile Thr Ile Leu1 5<210>36<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>36Leu Leu Gln Ser Phe1 5<210>37<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>37Met Ala Leu Leu Leu Ala Val Phe Phe Leu Phe Leu Phe Lys Gln1 5 10 15<210>38<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述編碼的引物<400>38Met Ala Arg Gln Val His Ser Ser Trp Asn Leu pro Pro Gly Pro1 5 10 15<210>39<211>523<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>39Met Leu Ala Phe Ile Ile Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Thr Met Lys1 5 10 15Arg Lys Glu Lys Lys Lys Thr Met Leu Ile Ser Pro Thr Arg Asn Leu20 25 30Ser Leu Pro Pro Gly Pro Lys Ser Trp Pro Leu Ile Gly Asn Leu Pro35 40 45Glu Ile Leu Gly Arg Asn Lys Pro Val Phe Arg Trp Ile His Ser Leu50 55 60Met Lys Glu Leu Asn Thr Asp Ile Ala Cys Ile Arg Leu Ala Asn Thr65 70 75 80His Val Ile Pro Val Thr Ser Pro Arg Ile Ala Arg Glu Ile Leu Lys85 90 95Lys Gln Asp Ser Val Phe Ala Thr Arg Pro Leu Thr Met Gly Thr Glu100 105110Tyr Cys Ser Arg Gly Tyr Leu Thr Val Ala Val Glu Pro Gln Gly Glu115 120 125Gln Trp Lys Lys Met Arg Arg Val Val Ala Ser His Val Thr Ser Lys130135 140Lys Ser Phe Gln Met Met Leu Gln Lys Arg Thr Glu Glu Ala Asp Asn145 150 155 160Leu Val Arg Tyr Ile Asn Asn Arg Ser Val Lys Asn Arg Gly Asn Ala165 170 175Phe Val Val Ile Asp Leu Arg Leu Ala Val Arg Gln Tyr Ser Gly Asn180 185 190Val Ala Arg Lys Met Met Phe Gly Ile Arg His Phe Gly Lys Gly Ser195 200 205Glu Asp Gly Ser Gly Pro Gly Leu Glu Glu Ile Glu His Val Glu Ser210 215 220Leu Phe Thr Val Leu Thr His Leu Tyr Ala Phe Ala Leu Ser Asp Tyr225 230 235 240Val Pro Trp Leu Arg Phe Leu Asp Leu Glu Gly His Glu Lys Val Val245 250 255Ser Asn Ala Met Arg Asn Val Ser Lys Tyr Asn Asp Pro Phe Val Asp260 265 270Glu Arg Leu Met Gln Trp Arg Asn Gly Lys Met Lys Glu Pro Gln Asp275 280 285Phe Leu Asp Met Phe Ile Ile Ala Lys Asp Thr Asp Gly Lys Pro Thr290 295 300Leu Ser Asp Glu Glu Ile Lys Ala Gln Val Thr Glu Leu Met Leu Ala305 310 315 320Thr Val Asp Asn Pro Ser Asn Ala Ala Glu Trp Gly Met Ala Glu Met325 330 335Ile Asn Glu Pro Ser Ile Met Gln Lys Ala Val Glu Glu Ile Asp Arg340 345 350Val Val Gly Lys Asp Arg Leu Val Ile Glu Ser Asp Leu Pro Asn Leu355 360 365Asn Tyr Val Lys Ala Cys Val Lys Glu Ala Phe Arg Leu His Pro Val370 375 380Ala Pro Phe Asn Leu Pro His Met Ser Thr Thr Asp Thr Val Val Asp385 390 395 400Gly Tyr Phe Ile Pro Lys Gly Ser His Val Leu Ile Ser Arg Met Gly405 410 415Ile Gly Arg Asn Pro Ser Val Trp Asp Lys Pro His Lys Phe Asp Pro420 425 430Glu Arg His Leu Ser Thr Asn Thr Cys Val Asp Leu Asn Glu Ser Asp435 440 445Leu Asn Ile Ile Ser Phe Ser Ala Gly Arg Arg Gly Cys Met Gly Val450 455 460Asp Ile Gly Ser Ala Met Thr Tyr Met Leu Leu Ala Arg Leu Ile Gln465 470 475 480Gly Phe Thr Trp Leu Pro Val Pro Gly Lys Asn Lys Ile Asp Ile Ser
485 490 495Glu Ser Lys Asn Asp Leu Phe Met Ala Lys Pro Leu Tyr Ala Val Ala500 505 510Thr Pro Arg Leu Ala Pro His Val Tyr Pro Thr515 520<210>40<211>1572<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>40atgctcgcgt ttattatagg tttgcttctt cttgcattaa ctatgaagcg taaggagaag 60aagaaaacca tgttaattag ccctacgaga aacctctctc tccctcccgg gccgaaatct 120tggcctttaa tcggaaacct accggaaata ctagggagga acaaaccggt gttccggtgg 180atacattctc tcatgaaaga actcaacacc gatattgcat gtatccgtct tgcgaatact 240cacgtgatcc ccgtgacatc cccgagaatt gcaagagaga ttctgaagaa gcaagactcc 300gttttcgcca ctagaccgct aacgatgggc acggagtact gcagccgcgg gtacttgacc 360gttgcggtgg agccacaagg agagcagtgg aagaagatga ggagagtggt ggcatctcac 420gtgacgagca agaagagctt ccaaatgatg ctacaaaaga gaaccgaaga ggctgataac 480ttagtccggt acatcaataa ccgtagtgtc aaaaaccgtg gtaatgcttt tgtggttatt 540gatttaaggc ttgcggtacg gcaatacagt ggaaatgtag ctcggaagat gatgtttggt 600ataaggcatt ttggtaaagg aagtgaagat ggatcgggac cagggttgga agagattgaa 660catgtggaat ctttgtttac ggttttaacc catctttacg cctttgcatt gtcagattat 720gtcccgtggc taaggttctt ggacttggaa ggccatgaga aggttgtgag taacgcaatg 780agaaatgtaa gtaagtataa cgaccctttt gttgatgaaa gactcatgca atggcgaaat 840gggaagatga aagaacctca agattttctt gacatgttta taatagctaa agacactgac 900gggaagccta ctctgtcgga cgaagagatc aaagcacaag tgacggaact aatgttggcg 960acggttgata atccgtctaa cgcggcagag tggggtatgg cggagatgat taacgagccg 1020agcatcatgc aaaaagccgt ggaagagatt gatagggtag ttggaaaaga ccgtcttgtc 1080attgagtctg atctcccaaa tcttaactat gtgaaggctt gtgtgaaaga agcattccgg 1140ttacaccccg tggcaccgtt caacctccct cacatgtcca ccactgatac tgtggtagac 1200ggttatttca tccccaaggg aagccacgta ttgattagtc gtatggggat tgggagaaat 1260cctagtgtgt gggacaagcc gcataagttc gaccctgaga gacatttgag cactaacaca 1320tgtgtggatc taaacgagtc tgatctgaat ataatatcgt tcagtgcagg acgaagaggt 1380tgtatgggtg tggacattgg gtcagccatg acgtacatgt tactggctcg gttgattcaa 1440ggattcacgt ggttaccagt gcctggtaag aataagattg atatttcaga aagcaagaat 1500gatcttttta tggcaaaacc attatacgcg gttgccacac ctcgtttagc tccacatgtg 1560tatccaacct aa 1572<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2F1<400>41gtgcatatgc ttgactccac cccaatg 27<210>42<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2R1<400>42atgcattttt ctagtaatct ttacgctc 28<210>43<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2F2<400>43cgtgaattcc atatgctcgc gtttattata ggtttgc 37<210>44<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2R2<400>44cggaagctta ttaggttgga tacacatgt 29<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2R3<400>45cgtcacttgt gctttgatct cttc 24<210>46<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2F3<400>46gaactaatgt tggcgacggt tgat 24<210>47<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2FX1<400>47cgtgaattcc atatggctct gttattagca gtttttctcg cgtttattat aggtttg 57<210>48<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2FX2<400>48cgtgaattcc atatggctct gttattagca gtttttcttc ttcttgcatt aactatg57<210>49<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2R4<400>49catctcgagt cttcttccac tgctctcctt 30<210>50<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物A2FX3
A2FX3<400>50ttaatcggaa acctacc17<210>51<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物17AF<400>51cgtgaattcc atatggctct gttattagct gtt 33<210>52<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物AlR<400>52gggccacggc acgggacc 18<210>53<211>2702<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>53ctcgagctca gtttcttctt cttcctcgta cttatcctcc tcagccaaac gatctctcac 60cgtattctct agctgcactc cgtactgagc tccttttatc tcctttatca ccaccactct 120tataaccttc tccatctccg ctgaaaaatg tataatagta agcagaggaa ccggttcaat 180ttcgttggac acgtacttaa ccagattaat taagtaaacc ggagtttaac cagttgaatc 240aaagtaaacc aaaataagaa gccaaaccaa ataatgtatt tattgaacca cgtagtctcc 300atctaaacca gagaacccta attcaaattt tgatttgaaa acatggacta attaagatta 360ccggaggcaa gggcgtcgaa gaagtcatca tcgccggcga gttcttttcc ggttttgcct 420ttccagttat caagatgtgt tttaacatct gaaggatcta agtaaactcc gatcgcagtg 480aacttcactt gaagaaagtg gatctcaatg tctgtgatcc ctataacaag aatatgaaca 540atccatataa aattattgtt acctgcgatt ttgttatgta tcgcattata aggtatcaga 600cattaagaaa gcaaaaaaga aataaaaacc ttggcccaga agagagagtg gcttggaagt 660gatgatctgt ggaggaaaag gaacctcgtg aaccatgacc atctctgttc ccactgtttg 720ataaacaaga acacacaaat cttaggaaaa aaacaaagca ttgaaaaaaa gacaatgaga 780ataattgaaa cttgttagaa ctgaaaatct tactttagtg gataaacttg taataaaaaa 840gaatgcaaag agtgtaagac ttactttcta atttatatta ttttgaatct gagagtgaag 900aaatttataa atggcttggt gtactatttt acgatcttag agaaacaata tcgaaattgt 960aaatgtgaat atctctctct atataataag ccagggactg gtggtaggta acataatttt 1020gctaacgttc aaagcttgtg atctaaaaga cgacgtattc tttttatgaa ttcaattttt 1080ttgctaccaa agcttgtgat ctcaattgtt tgttagcgac ccaccaggaa gccacgtgtt 1140tggatcaagc actcagtcca caaccactca ttctacctaa caaatgaagg tatagaagta 1200taataattaa aagagataga agaaagaatt gctatgatac agtaaaaaga gatcagatgt 1260caaatgtgaa acaaagcgta cataaattag atacaaaatt agaagcagcc acatttctcc 1320acaacggctc ttgaaatcag taacgtaaag taaactgatg atgacaaaga cccaaaaaaa 1380aaaaaaaaaa aaaaaaagag aaataaagag tgtctttaaa gcagtaacgt ataaaaaccc 1440tttttcgtct tctcttctat ctcgacctcc caaatcatga aaggatcaat tcatgactcc 1500gctattacgg gtttagaggc tcagcttatg gcatcgaagc gaggactaat cgaagccgtg 1560agtttgggga tcactcataa gtcatatctc aatctattgc gatcattatc acatttttga 1620actggtaagt aagtgttact gctgcaaatc gaaactgact attgaaagct atgcccatct 1680ttcgacacat aaactaagag ccaagtggga acaaaggatc gaagagacaa ctgaaagaga 1740ttgggtaatg tgtgcaaagt gccaaaaatt ggcttcagca agtcatggta taatctctat 1800tctctaatca caatctctag cttttcttaa ttagtcctta tgtaatttga ttatgtttta 1860attcgcctcc taattaattt catggttgat ggatagtcgt gggtattcct tttgctacgc 1920atgtcgagcc gaatggaagc tgctaggatt aaatttacag aagctgaatc aatttttaag 1980tgggccaaat atttacagtt tttataagcc caaatctcca tgtccatatt gtttttaacg 2040tggcgctacc taaaagggga taaagatttc ataaacagca ttaacaattt aacatcaaca 2100agattttaaa gggataagga ttaaggaatc gtaagcaaat ttatccttag agattagatt 2160tagacgaatt tggaaaagta aaaagttggt aattaaatag aaatgtactt aaaacacaac 2220atgtaataca ttagacatat gagctgttga aaaatcgtgg tttttctaat gatggcgcta 2280cctaaaaggg acaaggattt cataatgatg cattaccaat ttaacatcca caagatttat 2340aagggataag gaataatcaa agaaaaaaac atgtcttaca tatgagctgt tgaaaaatcg 2400tggattcatt taacattgtt ttcttcaaca tttaaagcac atttattttc catagattac 2460acttaaacaa aagcatttgt ttcatggcta taaatagctt attcctcatc atagataaga 2520aaaaaccttt tcgaactcaa ataatttctc caaattgaga tttaaaaaaa aaaatgcttg 2580actccacccc aatgctcgcg tttattatag gtttgcttct tcttgcatta actatgaagc 2640gtaaggagaa gaagaaaacc atgttaatta gccctacgag aaacctctct ctccctcccg 2700gg2702<210>54<211>541<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>54Met Asn Thr Phe Thr Ser Asn Ser Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ala Thr1 5 10 15Glu Thr Ser Ser Phe Ser Thr Leu Tyr Leu Leu Ser Thr Leu Gln Ala20 25 30Phe Val Ala Ile Thr Leu Val Met Leu Leu Lys Lys Leu Met Thr Asp35 40 45Pro Asn Lys Lys Lys Pro Tyr Leu Pro Pro Gly Pro Thr Gly Trp Pro50 55 60Ile Ile Gly Met Ile Pro Thr Met Leu Lys Ser Arg Pro Val Phe Arg65 70 75 80Trp Leu His Ser Ile Met Lys Gln Leu Asn Thr Glu Ile Ala Cys Val85 90 95Lys Leu Gly Asn Thr His Val Ile Thr Val Thr Cys Pro Lys Ile Ala100 105 110Arg Glu Ile Leu Lys Gln Gln Asp Ala Leu Phe Ala Ser Arg Pro Leu115 120 125Thr Tyr Ala Gln Lys Ile Leu Ser Asn Gly Tyr Lys Thr Cys Val Ile130 135 140Thr Pro Phe Gly Asp Gln Phe Lys Lys Met Arg Lys Val Val Met Thr145 150 155 160Glu Leu Val Cys Pro Ala Arg His Arg Trp Leu His Gln Lys Arg Ser165 170 175Glu Glu Asn Asp His Leu Thr Ala Trp Val Tyr Asn Met Val Lys Asn180 185 190Ser Gly Ser Val Asp Phe Arg Phe Met Thr Arg His Tyr Cys Gly Asn195 200 205Ala Ile Lys Lys Leu Met Phe Gly Thr Arg Thr Phe Ser Lys Asn Thr210 215 220Ala Pro Asp Gly Gly Pro Thr Val Glu Asp Val Glu His Met Glu Ala225 230 235 240Met Phe Glu Ala Leu Gly Phe Thr Phe Ala Phe Cys Ile Ser Asp Tyr245 250 255Leu Pro Met Leu Thr Gly Leu Asp Leu Asn Gly His Glu Lys Ile Met260 265 270Arg Glu Ser Ser Ala Ile Met Asp Lys Tyr His Asp Pro Ile Ile Asp275 280 285Glu Arg Ile Lys Met Trp Arg Glu Gly Lys Arg Thr Gln Ile Glu Asp290 295 300Phe Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ile Lys Asp Glu Gln Gly Asn Pro Leu305 310 315 320Leu Thr Ala Asp Glu Ile Lys Pro Thr Ile Lys Glu Leu Val Met Ala325 330 335Ala Pro Asp Asn Pro Ser Asn Ala Val Glu Trp Ala Met Ala Glu Met340 345 350Val Asn Lys Pro Glu Ile Leu Arg Lys Ala Met Glu Glu Ile Asp Arg355 360 365Val Val Gly Lys Glu Arg Leu Val Gln Glu Ser Asp Ile Pro Lys Leu370 375 380Asn Tyr Val Lys Ala Ile Leu Arg Glu Ala Phe Arg Leu His Pro Val385 390 395 400Ala Ala Phe Asn Leu Pro His Val Ala Leu Ser Asp Thr Thr Val Ala405 410 415Gly Tyr His Ile Pro Lys Gly Ser Gln Val Leu Leu Ser Arg Tyr Gly420 425 430Leu Gly Arg Asn Pro Lys Val Trp Ala Asp Pro Leu Cys Phe Lys Pro435 440 445Glu Arg His Leu Asn Glu Cys Ser Glu Val Thr Leu Thr Glu Asn Asp450 455 460Leu Arg Phe Ile Ser Phe Ser Thr Gly Lys Arg Gly Cys Ala Ala Pro465 470 475 480Ala Leu Gly Thr Ala Leu Thr Thr Met Met Leu Ala Arg Leu Leu Gln485 490 495Gly Phe Thr Trp Lys Leu Pro Glu Asn Glu Thr Arg Val Glu Leu Met500 505 510Glu Ser Ser His Asp Met Phe Leu Ala Lys Pro Leu Val Met Val Gly515 520 525Asp Leu Arg Leu Pro Glu His Leu Tyr Pro Thr Val Lys530 535 540<210>55<211>1916<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>55gtcgacccac gcgtccgcaa cagaaaccac aacaaaaact ttgagtcctc ttcttctcta 60tacacaaaca tgaacacttt tacctcaaac tcttcggatc tcactaccac tgcaaccgaa 120acatcgtcct ttagcacctt gtatctcctc tcaacacttc aagcttttgt ggctataacc 180ttagtgatgc tactcaagaa attgatgacg gatcccaaca aaaagaaacc gtatctgcca 240ccgggtccca caggatggcc gatcattgga atgattccga cgatgctaaa gagccggccc 300gttttccggt ggctccacag catcatgaag cagctcaata ctgagatagc atgcgtgaag 360ttaggaaaca ctcatgtgat caccgtcacg tgccctaaga tagcacgtga gatactcaag 420caacaagacg ctctcttcgc gtcgaggcct ttaacttacg ctcagaagat cctctctaac 480ggctacaaaa cctgcgtgat cactcccttt ggtgaccaat tcaagaaaat gaggaaagtt 540gtgatgacgg aactcgtatg tccagcgaga cacaggtggc tccaccagaa gagatcagaa 600gaaaacgatc atttaaccgc ttgggtatac aacatggtta agaactcggg ctctgtcgat 660ttccggttca tgactaggca ttactgtgga aatgcaatca agaagcttat gttcgggacg 720agaacgttct ctaagaacac tgcacctgac ggtggaccca ccgtagaaga tgtagagcac 780atggaagcaa tgtttgaagc attagggttt accttcgctt tttgcatctc tgattatctg 840ccgatgctca ctggacttga tcttaacggt cacgagaaga ttatgagaga atcaagtgcg 900attatggaca agtatcatga cccaatcatc gacgagagga tcaagatgtg gagagaagga 960aagagaactc aaatcgaaga ttttcttgat attttcatct ctatcaaaga cgaacaaggc 1020aacccattgc ttaccgccga tgaaatcaaa cccaccatta aggagcttgt aatggcggcg 1080ccagacaatc catcaaacgc cgtggaatgg gccatggcgg agatggtgaa caaaccggag 1140attctccgta aagcaatgga agagatcgac agagtcgtcg ggaaagagag actcgttcaa 1200gaatccgaca tcccaaaact aaactacgtc aaagctatcc tccgcgaagc tttccgtctc 1260catcccgtcg ccgccttcaa cctcccccac gtggcacttt ctgacacaac cgtcgccgga 1320tatcacatcc ctaaaggaag tcaagtcctt cttagccgat atgggctggg ccgtaaccca 1380aaagtttggg ccgacccact ttgctttaaa ccggagagac atctcaacga atgctccgaa 1440gttactttga ccgagaacga tctccggttt atctcgttca gtaccgggaa aagaggttgt 1500gcggctccgg cgctaggaac ggcgttgacc acgatgatgc tcgcgagact tcttcaaggt 1560ttcacttgga agctacctga gaatgagaca cgtgtcgagc tgatggagtc tagtcacgat 1620atgtttctgg ctaaaccgtt ggttatggtc ggtgacctta gattgccgga gcatctctac 1680ccgacggtga agtgagatga gacgacgccg tatatatttt atgaaactac ttttatataa 1740tcgcccaacc aagtttggtc aattccggtt accagaagat aattggtcaa attgtgaaca 1800aacttgtgtg ttggtttctt ggttcttttt gggacacttg aattgtgtct cctttacctc 1860ttcttttgtt gttttcaata aaaactttta ttaccatttc aaaaaaaaaa aaaaaa 1916<210>56<211>1974<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>56atgaacactt ttacctcaaa ctcttcggat ctcactacca ctgcaaccga aacatcgtcc 60tttagcacct tgtatctcct ctcaacactt caagcttttg tggctataac cttagtgatg 120ctactcaaga aattgatgac ggatcccaac aaaaagaaac cgtatctgcc accgggtccc 180acaggatggc cgatcattgg aatgattccg acgatgctaa agagccggcc cgttttccgg 240tggctccaca gcatcatgaa gcagctcaat actgagatag catgcgtgaa gttaggaaac 300actcatgtga tcaccgtcac gtgccctaag atagcacgtg agatactcaa gcaacaagac 360gctctcttcg cgtcgaggcc tttaacttac gctcagaaga tcctctctaa cggctacaaa 420acctgcgtga tcactccctt tggtgaccaa ttcaagaaaa tgaggaaagt tgtgatgacg 480gaactcgtat gtccagcgag acacaggtgg ctccaccaga agagatcaga agaaaacgat 540catttaaccg cttgggtata caacatggtt aagaactcgg gctctgtcga tttccggttc 600atgactaggc attactgtgg aaatgcaatc aagaagctta tgttcgggac gagaacgttc 660tctaagaaca ctgcacctga cggtggaccc accgtagaag atgtagagca catggaagca 720atgtttgaag cattagggtt taccttcgct ttttgcatct ctgattatct gccgatgctc 780actggacttg atcttaacgg tcacgagaag attatgagag aatcaagtgc gattatggac 840aagtatcatg acccaatcat cgacgagagg atcaagatgt ggagagaagg aaagagaact 900caaatcgaag attttcttga tattttcatc tctatcaaag acgaacaagg caacccattg 960cttaccgccg atgaaatcaa acccaccatt aaggtattta tcacgttcct ttcatataag 1020gtttcgatcg taaaaatatc aaaagaacaa tttttgttaa attttatttg agaaagcatg 1080catatcaaat ttatttacac atactaacat tttgattcat aaaacattta taaaagaaga 1140aagaaacatt ttgtggtaaa agttgattag ttacaatatt tgtttttttt ttgctaaaca 1200tgggctactt ttttgtttgt ctcttttgat tactttggtc aaagacagat gcatgcaact 1260taattgtatt tatttttatg ttatacaaaa attaaagatc caaaattaat aaaagctggt 1320atatatgttt ataatgaata ggagcttgta atggcggcgc cagacaatcc atcaaacgcc 1380gtggaatggg ccatggcgga gatggtgaac aaaccggaga ttctccgtaa agcaatggaa 1440gagatcgaca gagtcgtcgg gaaagagaga ctcgttcaag aatccgacat cccaaaacta 1500aactacgtca aagctatcct ccgcgaagct ttccgtctcc atcccgtcgc cgccttcaac 1560ctcccccacg tggcactttc tgacacaacc gtcgccggat atcacatccc taaaggaagt 1620caagtccttc ttagccgata tgggctgggc cgtaacccaa aagtttgggc cgacccactt 1680tgctttaaac cggagagaca tctcaacgaa tgctccgaag ttactttgac cgagaacgat 1740ctccggttta tctcgttcag taccgggaaa agaggttgtg cggctccggc gctaggaacg 1800gcgttgacca cgatgatgct cgcgagactt cttcaaggtt tcacttggaa gctacctgag 1860aatgagacac gtgtcgagct gatggagtct agtcacgata tgtttctggc taaaccgttg 1920gttatggtcg gtgaccttag attgccggag catctctacc cgacggtgaa gtga 1974<210>57<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物T7<400>57aatacgactc actatag17<210>58<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物EST3<400>58gctaggatcc atgttgtata cccaag 26<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物EST6<400>59cgggcccgtt ttccggtggc20<210>60<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物EST7A<400>60ggtcaccaaa gggagtgatc acgc 24<210>61<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物5*天然*有義<400>61atcgtcagtc gaccatatga acacttttac ctcaaactct tcgg 44<210>62<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物5*牛*有義<400>62atcgtcagtc gaccatatgg ctctgttatt agcagttttt acatcgtcct ttagcacctt 60gtatctcc 68<210>63<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物3*末端*反義<400>63actgctagaa ttcgacgtca ttacttcacc gtcgggtaga gatgc45<210>64<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物CYP79B2.2<400>64ggaattcatg aacactttta cctca 25<210>65<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物B2SB<400>65ttgtctagat cacttcaccg tcgggta 27<210>66<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物B2AF<400>66ggcctcgaga tgaacacttt tacctca 27<210>67<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物B2AB<400>67ttggaattcc ttcaccgtcg ggtagag 27<210>68<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物XbaI<400>68gtaccatcta gattcatgtt tgtgtataga g 31<210>69<211>2361<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>69gaattcattg atctggtctt gctaaaaact ttaaaattga tgagttcaac atcttcaaat 60gcatgataac gggtccaacg gaaattgact tttttttcat gctcctgata tataataata 120tctaacgatt acgggttcca ctaattgtca ttactcatta acattcctat ttaaaagttg 180tgatagtttt agggttttac gtagtcgtgt catatagcga ttaactacgt acttgtagat 240ttatcaatta cttctgttgt ttacgagaac ctaaaaaaaa gaagcagatg cctagtttat 300agagcacgtg tactgtcttg aaaacttagg taggttggta aggttaccaa aagaccttaa 360aggaatataa agttactaat taacttaagt aaagttggta ttgcttatat attgcaaagt 420attacaaacc aatcccctct gtatattgtt ttaaaccata gattttttta caattaagtt 480tatgatcaat caattatttc accatttcta ttaaattatg taaaaagaaa aggatatata 540tatatatata taattaaata agaataaatc aaaataccga aattttttat tatccattct 600ttgtggacat cgcccctaat atataaaaaa aaaaaacttt cgtataactg atttatattt 660ttttgtaaaa acttaaagga agcctaagaa atatcttgtg atatttttga caaaatgtgg 720tatatatctt tttataatat catttataaa gaaaatattg attacatggt gaaaaacatt 780ttgctagcga tcaacaaaat taaataggca catgttaact gatctcatac gaccttgaaa 840ttttaatctt tgtgtcgaga gaccgatctt tatgcaaatt atgaaactac acatggttta 900tgcacggaag atcacattgc atgtatacca tattataaac caaaaatgat caagaagaag 960gcgaaaacat ttgggtaaat tttaaatttc gatcatgcga ttttttagct catcatcaac 1020agacaagaaa ctatcttttg tactgtaaat actaaataca aaataaaatc ttcatcattt 1080tttgcatgtg tcaaataaat tacgcgaact tttttttttt atcgactatt aatagagaaa 1140cctgttttat ttgccttgat ttggaaaaat ggagaaattg acttaagact tagtctcggt 1200cacatcggca acaacggagc ttaaacggcg tccgcaacat ggaaactcaa gccacgaatc 1260tgatatattg actatagaag tagtaagtaa ctttgactcg tcccacatca gtttcaattt 1320ccacgagggt atttggcagg tgaactctct acgtacccaa aacataatgg ctattttatt 1380tcataactga tatttagcaa ttaattattc gtccttttta aaccaatttc tatagttggg 1440aaaataatca atttttacac tttcaatgta tacgttacag attttttttt attagtcatg 1500cacatatttt caatttttac actttcaatg taaacaatcg attcttaatt gttaaaaata 1560ggtttacgta aggaattaaa gatttgttta aaatatgttc cggccggtct aataatttac 1620ttgacgttaa tttcttaaac acttttagat aggaggcttt gtttatccca aatgattttg 1680taccactgcg acaatactag ctagacataa aatgttaata aatttttatt aagtaatata 1740atcgaagtat tagatcaatg tagtagacag ttaggttaac taaaacaaga gtaaacactt 1800ttttttttct tttcaggata ggtaaaacaa atttcacact attttgcgta tttccttaaa 1860tttgttgttc gttttctcag caaagatgaa tattttgttt catagtaatt cacaagtata 1920aactcgccag aactcctcaa acagtgaaat ataatatagc ttttaactgt ttttcggctg 1980gaccgggttt ttaagtgcat atataacacg aggaattttg gcaggtcacc aacaaaactt 2040ttaaaaatat taaaaattcc catcaagaat agaaattaat aaacaatgat atctctaata 2100atatagatat tttgaaacgt taggaataat cgtaataatg ttcaacgttg gtggtggtac 2160tcaagatgga ccctccctcc cacattttcc tcactccttc gtaagtcctt tccacgcata 2220agggtattat agtcatttca cataaactaa cgactactag acttgtatat aaataggaag 2280gtgaagctct ctctttatcc atgcagagac aacagaaacc acaacaaaaa ctttgagtcc 2340tcttcttctc tatacacaaa c 2361<210>70<211>540<212>PRT<213>蔓菁(Brassica napus)<400>70Met Asn Thr Phe Thr Ser Asn Ser Ser Asp Leu Thr Ser Thr Thr Thr1 5 10 15Gln Thr Ser Pro Phe Ser Asn Met Tyr Leu Leu Thr Thr Leu Gln Ala20 25 30Phe Ala Ala Ile Thr Leu Val Met Leu Leu Lys Lys Val Phe Thr Thr35 40 45Asp Lys Lys Lys Leu Ser Leu Pro Pro Gly Pro Thr Gly Trp Pro Ile50 55 60Ile Gly Met Val Pro Thr Met Leu Lys Ser Arg Pro Val Phe Arg Trp65 70 75 80Leu His Ser Ile Met Lys Gln Leu Asn Thr Glu Ile Ala Cys Val Arg85 90 95Leu Gly Asn Thr His Val Ile Thr Val Thr Cys Pro Lys Ile Ala Arg100 105 110Glu Ile Leu Lys Gln Gln Asp Ala Leu Phe Ala Ser Arg Pro Met Thr115 120 125Tyr Ala Gln Asn Val Leu Ser Asn Gly Tyr Lys Thr Cys Val Ile Thr130 135 140Pro Phe Gly Glu Gln Phe Lys Lys Met Arg Lys Val Val Met Thr Glu145 150 155 160Leu Val Cys Pro Ala Arg His Arg Trp Leu His Gln Lys Arg Ala Glu165 170 175Glu Asn Asp His Leu Thr Ala Trp Val Tyr Asn Leu Val Lys Asn Ser180 185 190Gly Ser Val Asp Phe Arg Phe Val Thr Arg His Tyr Cys Gly Asn Ala195 200 205Ile Lys Lys Leu Met Phe Gly Thr Arg Thr Phe Ser Glu Asn Thr Ala210 215 220Pro Asp Gly Gly Pro Thr Ala Glu Asp Ile Glu His Met Glu Ala Met225 230 235 240Phe Glu Ala Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Cys Ile Ser Asp Tyr Leu245 250 255Pro Met Leu Thr Gly Leu Asp Leu Asn Gly His Glu Lys Ile Met Arg260 265 270Asp Ser Ser Ala Ile Met Asp Lys Tyr His Asp Pro Ile Val Asp Ala275 280 285Arg Ile Lys Met Trp Arg Glu Gly Lys Arg Thr Gln Ile Glu Asp Phe290 295 300Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ile Lys Asp Glu Gln Gly Asn Pro Leu Leu305 310 315 320Thr Ala Asp Glu Ile Lys Pro Thr Ile Lys Glu Leu Val Met Ala Ala325 330 335Pro Asp Asn Pro Ser Asn Ala Val Glu Trp Ala Met Ala Glu Met Val340 345 350Asn Lys Pro Glu Ile Leu His Lys Ala Met Glu Glu Ile Asp Arg Val355 360 365Val Gly Lys Glu Arg Leu Val Gln Glu Ser Asp Ile Pro Lys Leu Asn370 375 380Tyr Val Lys Ala Ile Leu Arg Glu Ala Phe Arg Leu His Pro Val Ala385 390 395 400Ala Phe Asn Leu Pro His Val Ala Leu Ser Asp Ala Thr Val Ala Gly405 410 415Tyr His Ile Pro Lys Gly Ser Gln Val Leu Leu Ser Arg Tyr Gly Leu420 425 430Gly Arg Asn Pro Lys Val Trp Ala Asp Pro Leu Ser Phe Lys Pro Glu
435 440 445Arg His Leu Asn Glu Cys Ser Glu Val Thr Leu Thr Glu Asn Asp Leu450 455 460Arg Phe Ile Ser Phe Ser Thr Gly Lys Arg Gly Cys Ala Ala Pro Ala465 470 475 480Leu Gly Thr Ala Leu Thr Thr Met Met Leu Ala Arg Leu Leu Gln Gly485 490 495Phe Thr Trp Lys Leu Pro Glu Asn Glu Thr Arg Val Glu Leu Met Glu500 505 510Ser Ser His Asp Met Phe Leu Ala Lys Pro Leu Val Met Val Gly Glu515 520 525Leu Arg Leu Pro Glu His Leu Tyr Pro Thr Val Lys530 535 540<210>71<211>1913<212>DNA<213>蔓菁(Brassica napus)<400>71tggagctcca ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat 60tcgcggccgc gtcgactttg attcttcttc tctgctctct ctctctctac tcgaaaacat 120gaacaccttt acctcaaact cttcggatct cacttccact acaacgcaaa cgtctccgtt 180cagcaacatg tatctcctca caacgctcca ggcctttgcg gctataacct tggtgatgct 240tctcaagaaa gtcttcacga cggataaaaa gaaattgtct ctcccgccgg gtcccaccgg 300atggccgatc atcggaatgg ttccaacgat gctaaagagc cgtcccgttt tccggtggct 360ccacagcatc atgaagcagc taaacaccga gatagcctgc gtgaggctag gaaacactca 420cgtgatcacc gtcacatgcc cgaagatagc acgtgagata ctcaagcaac aagacgctct 480cttcgcctcg agacccatga cttacgcaca gaatgtcctc tctaacggat acaaaacatg 540cgtgatcact cccttcggtg aacaattcaa gaaaatgagg aaagtcgtga tgactgaact 600cgtttgtccc gcgaggcaca ggtggcttca ccagaagaga gctgaagaga acgaccattt 660aaccgcttgg gtatacaact tggtcaagaa ctctggctca gtcgattttc ggtttgtcac 720gaggcattac tgtggaaatg ctatcaagaa gcttatgttc gggacaagaa cgttctctga 780aaacaccgca cctgacggtg gaccaaccgc tgaggatatc gagcatatgg aagctatgtt 840cgaagcatta gggtttactt tctccttttg tatctctgat tatctaccta tgctcactgg 900acttgatctt aacggccacg agaagatcat gagggattcg agtgctatta tggacaagta 960tcacgatcct atcgtcgatg caaggatcaa gatgtggaga gaaggaaaga gaactcaaat 1020cgaggatttt ctagacattt ttatttctat caaggatgaa caaggcaacc cattgcttac 1080cgccgatgaa atcaaaccca ccattaagga acttgtaatg gcggcgccag acaatccatc 1140aaacgctgtc gagtgggcca tggcggagat ggtgaacaaa ccggagatac tccataaagc 1200aatggaagaa atagacagag ttgtcggaaa agaaagactt gtccaagaat ccgacattcc 1260aaaattaaat tacgtcaaag ctatcctccg tgaagccttc cgcctccatc ccgtagcggc 1320ctttaacctc ccacacgtgg cactttccga cgcaaccgtc gccgggtatc acatccctaa 1380aggaagtcaa gtccttctca gtcgatatgg gctgggccgt aacccgaaag tttgggctga 1440ccccttgagc tttaaaccgg agagacatct caacgaatgc tcggaagtta ctttgacgga 1500gaacgatctc cggtttatct cgtttagtac cgggaaaaga ggttgtgctg ctccggcttt 1560aggtacggcg ttgaccacga tgatgctcgc gagacttctt caaggtttca cttggaagct 1620gccggagaat gagacacgcg ttgagctgat ggagtctagc catgatatgt ttttggctaa 1680accattggtt atggtcggtg agttgagact cccagagcat ctttacccga cggtgaagta 1740agaataaaac gacggcgtat atattttatt aaataacttc tacgtactta tgtaattaac 1800cacagagttt ggtcggtttc tccggttacc agaagataat cggttaatat atgaacaaac 1860ttgtgcttgg ttttggtaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaact cgaggggggg ccc1913<210>72<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物EST1<400>72tccatgtgct ctacatct 18<210>73<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物EST2<400>73gacggaactc gtatgtcc 18<210>74<211>537<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>74Met Ser Phe Thr Thr Ser Leu Pro Tyr Pro Phe His Ile Leu Leu Val1 5 10 15Phe Ile Leu Ser Met Ala Ser Ile Thr Leu Leu Gly Arg Ile Leu Ser20 25 30Arg Pro Thr Lys Thr Lys Asp Arg Ser Cys Gln Leu Pro Pro Gly Pro35 40 45Pro Gly Trp Pro Ile Leu Gly Asn Leu Pro Glu Leu Phe Met Thr Arg50 55 60Pro Arg Ser Lys Tyr Phe Arg Leu Ala Met Lys Glu Leu Lys Thr Asp65 70 75 80Ile Ala Cys Phe Asn Phe Ala Gly Ile Arg Ala Ile Thr Ile Asn Ser85 90 95Asp Glu Ile Ala Arg Glu Ala Phe Arg Glu Arg Asp Ala Asp Leu Ala100 105 110Asp Arg Pro Gln Leu Phe Ile Met Glu Thr Ile Gly Asp Asn Tyr Lys115 120 125Ser Met Gly Ile Ser Pro Tyr Gly Glu Gln Phe Met Lys Met Lys Arg130 135 140Val Ile Thr Thr Glu Ile Met Ser Val Lys Thr Leu Lys Met Leu Glu145 150 155 160Ala Ala Arg Thr Ile Glu Ala Asp Asn Leu Ile Ala Tyr Val His Ser165 170 175Met Tyr Gln Arg Ser Glu Thr Val Asp Val Arg Glu Leu Ser Arg Val180 185 190Tyr Gly Tyr Ala Val Thr Met Arg Met Leu Phe Gly Arg Arg His Val195 200 205Thr Lys Glu Asn Val Phe Ser Asp Asp Gly Arg Leu Gly Asn Ala Glu210 215 220Lys His His Leu Glu Val Ile Phe Asn Thr Leu Asn Cys Leu Pro Ser225 230 235 240Phe Ser Pro Ala Asp Tyr Val Glu Arg Trp Leu Arg Gly Trp Asn Val245 250 255Asp Gly Gln Glu Lys Arg Val Thr Glu Asn Cys Asn Ile Val Arg Ser260 265 270Tyr Asn Asn Pro Ile Ile Asp Glu Arg Val Gln Leu Trp Arg Glu Glu275 280 285Gly Gly Lys Ala Ala Val Glu Asp Trp Leu Asp Thr Phe Ile Thr Leu290 295300Lys Asp Gln Asn Gly Lys Tyr Leu Val Thr Pro Asp Glu Ile Lys Ala305 310 315 320Gln Cys Val Glu Phe Cys Ile Ala Ala Ile Asp Asn Pro Ala Asn Asn325 330 335Met Glu Trp Thr Leu Gly Glu Met Leu Lys Asn Pro Glu Ile Leu Arg340 345 350Lys Ala Leu Lys Glu Leu Asp Glu Val Val Gly Arg Asp Arg Leu Val355 360 365Gln Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Ala Cys Cys Arg370 375 380Glu Thr Phe Arg Ile His Pro Ser Ala His Tyr Val Pro Ser His Leu385 390 395 400Ala Arg Gln Asp Thr Thr Leu Gly Gly Tyr Phe Ile Pro Lys Gly Ser405 410 415His Ile His Val Cys Arg Pro Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Ile Trp420 425 430Lys Asp Pro Leu Val Tyr Lys Pro Glu Arg His Leu Gln Gly Asp Gly435 440 445Ile Thr Lys Glu Val Thr Leu Val Glu Thr Glu Met Arg Phe Val Ser450 455 460Phe Ser Thr Gly Arg Arg Gly Cys Ile Gly Val Lys Val Gly Thr Ile465 470 475 480Met Met Val Met Leu Leu Ala Arg Phe Leu Gln Gly Phe Asn Trp Lys485 490 495Leu His Gln Asp Phe Gly Pro Leu Ser Leu Glu Glu Asp Asp Ala Ser500 505 510Leu Leu Met Ala Lys Pro Leu His Leu Ser Val Glu Pro Arg Leu Ala515 520 525Pro Asn Leu Tyr Pro Lys Phe Arg Pro530535<210>75<211>1614<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>75atgagcttta ccacatcatt accataccct tttcacatcc tactagtctt tatcctctcc 60atggcatcaa tcactctact gggtcgaata ctctcaaggc ccaccaaaac caaagaccga 120tcttgccagc ttcctcctgg cccaccagga tggcccatcc tcggcaatct acccgaacta 180ttcatgactc gtcctaggtc caaatatttc cgccttgcca tgaaagagct aaaaacagat 240atagcatgtt tcaactttgc cggcatccgt gccatcacca taaactccga cgagatcgct 300agagaagcgt ttagagagcg agacgcagat ttggcagacc ggcctcaact tttcatcatg 360gagacaatcg gagacaatta caaatcaatg ggaatttcac cgtacggtga acaattcatg 420aagatgaaaa gagtgatcac aacggaaatt atgtccgtta agacgttgaa aatgttggag 480gctgcaagaa ccatcgaagc ggataatctc atagcttacg ttcactccat gtatcaacgg 540tccgagacgg tcgatgttag agagctctcg agggtttatg gttacgcagt gaccatgcga 600atgttgtttg gaaggagaca tgttacgaaa gaaaacgtgt tttctgatga tggaagacta 660ggaaacgccg aaaaacatca tcttgaggtg attttcaaca ctcttaactg tttaccgagt 720tttagtccag cggattacgt ggaacgatgg ttgagaggtt ggaatgttga tggtcaagag 780aagagggtga cagagaactg taacattgtt cgtagttaca acaatcccat aatcgacgag 840agggtccagt tgtggaggga agaaggtggt aaggctgctg ttgaagattg gcttgatacg 900ttcattaccc taaaagatca aaacggaaag tacttggtca caccagacga aatcaaagct 960caatgcgtag aattttgtat agcagcgatt gataatccgg caaataacat ggagtggaca 1020cttggggaaa tgttaaagaa cccggagatt cttagaaaag ctctgaagga gttggatgaa 1080gtagttggaa gagacaggct tgtgcaagaa tcagacatac caaatctaaa ctacttaaaa 1140gcttgttgta gagaaacatt cagaattcac ccaagtgctc attatgtccc ttcccatctt 1200gcgcgtcaag ataccaccct tgggggttat ttcattccca aaggtagcca cattcatgta 1260tgccgccctg gactaggtcg taaccctaaa atatggaaag atccattggt atacaaaccg 1320gagcgtcacc tccaaggaga cggaatcaca aaagaggtta ctctggtgga aacagagatg 1380cgttttgtct cgtttagcac cggtcgacgt ggctgcatcg gtgttaaagt cgggacgatc 1440atgatggtta tgttgttggc taggtttctt caagggttta actggaaact ccatcaagat 1500tttggaccgt taagcctcga ggaagatgat gcatcattgc ttatggctaa acctcttcac 1560ttgtccgttg agccacgctt ggcaccaaac ctttatccaa agttccgtcc ttaa 1614<210>76<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>76ctctagattc gaacatatgg ctagctttac aacatcatta cc42<210>77<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>77cgggatcctt aaggacggaa ctttggata 29<210>78<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>78aactgcagca tgatgagctt taccacatc 29<210>79<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列sequence<400>79cgggatcctt aatggtggtg atgaggacgg aactttggat aa 42<210>80<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>80aaagctcaat gcgtagaat 19<210>81<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>81tttttagaca ccatcttgtt ttcttcttc 29<210>82<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>82tgtagcggcg cattaagc 18<210>83<21l>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物序列<400>83caaaagaata gaccgagata ggg23<210>84<211>535<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>84Met Lys Ile Ser Phe Asn Thr Cys Phe Gln Ile Leu Leu Gly Phe Ile1 5 10 15Val Phe Ile Ala Ser Ile Thr Leu Leu Gly Arg Ile Phe Ser Arg Pro20 25 30Ser Lys Thr Lys Asp Arg Cys Arg Gln Leu Pro Pro Gly Arg Pro Gly35 40 45Trp Pro Ile Leu Gly Asn Leu Pro Glu Leu Ile Met Thr Arg Pro Arg50 55 60Ser Lys Tyr Phe His Leu Ala Met Lys Glu Leu Lys Thr Asp Ile Ala65 70 75 80Cys Phe Asn Phe Ala Gly Thr His Thr Ile Thr Ile Asn Ser Asp Glu85 90 95Ile Ala Arg Glu Ala Phe Arg Glu Arg Asp Ala Asp Leu Ala Asp Arg100 105 110Pro Gln Leu Ser Ile Val Glu Ser Ile Gly Asp Asn Tyr Lys Thr Met115 120 125Gly Thr Ser Ser Tyr Gly Glu His Phe Met Lys Met Lys Lys Val Ile130 135 140Thr Thr Glu Ile Met Ser Val Lys Thr Leu Asn Met Leu Glu Ala Ala145 150 155 160Arg Thr Ile Glu Ala Asp Asn Leu Ile Ala Tyr Ile His Ser Met Tyr165 170 175Gln Arg Ser Glu Thr Val Asp Val Arg Glu Leu Ser Arg Val Tyr Gly180 185 190Tyr Ala Val Thr Met Arg Met Leu Phe Gly Arg Arg His Val Thr Lys195 200 205Glu Asn Met Phe Ser Asp Asp Gly Arg Leu Gly Lys Ala Glu Lys His210 215 220His Leu Glu Val Ile Phe Asn Thr Leu Asn Cys Leu Pro Gly Phe Ser225 230 235 240Pro Val Asp Tyr Val Asp Arg Trp Leu Gly Gly Trp Asn Ile Asp Gly245 250 255Glu Glu Glu Arg Ala Lys Val Ash Val Asn Leu Val Arg Ser Tyr Ash260 265 270Asn Pro Ile Ile Asp Glu Arg Val Glu Ile Trp Arg Glu Lys Gly Gly275 280 285Lys Ala Ala Val Glu Asp Trp Leu Asp Thr Phe Ile Thr Leu Lys Asp290 295 300Gln Asn Gly Asn Tyr Leu Val Thr Pro Asp Glu Ile Lys Ala Gln Cys305 310 315 320Val Glu Phe Cys Ile Ala Ala Ile Asp Asn Pro Ala Asn Asn Met Glu325 330 335Trp Thr Leu Gly Glu Met Leu Lys Asn Pro Glu Ile Leu Arg Lys Ala340 345 350Leu Lys Glu Leu Asp Glu Val Val Gly Lys Asp Arg Leu Val Gln Glu355 360 365Ser Asp Ile Arg Asn Leu Asn Tyr Leu Lys Ala Cys Cys Arg Glu Thr370 375 380Phe Arg Ile His Pro Ser Ala His Tyr Val Pro Pro His Val Ala Arg385 390 395 400Gln Asp Thr Thr Leu Gly Gly Tyr Phe Ile Pro Lys Gly Ser His Ile405 410 415His Val Cys Arg Pro Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Ile Trp Lys Asp420 425 430Pro Leu Ala Tyr Glu Pro Glu Arg His Leu Gln Gly Asp Gly Ile Thr435 440 445Lys Glu Val Thr Leu Val Glu Thr Glu Met Arg Phe Val Ser Phe Ser450 455 460Thr Gly Arg Arg Gly Cys Val Gly Val Lys Val Gly Thr Ile Met Met465 470 475 480Ala Met Met Leu Ala Arg Phe Leu Gln Gly Phe Asn Trp Lys Leu His485 490 495Arg Asp Phe Gly Pro Leu Ser Leu Glu Glu Asp Asp Ala Ser Leu Leu500 505 510Met Ala Lys Pro Leu Leu Leu Ser Val Glu Pro Arg Leu Ala Ser Asn515 520 525Leu Tyr Pro Lys Phe Arg Pro530 535<210>85<211>1608<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>85atgaagatta gctttaacac atgctttcaa atcttactag gatttatcgt cttcatcgca 60tcaatcactt tactaggtcg aatattctca aggccttcca aaaccaaaga ccggtgtcgc 120cagcttcctc ctggccgacc aggatggccc atcctcggca atctacccga actaatcatg 180actcgtccta ggtccaaata tttccacctt gccatgaaag agctaaaaac ggatatcgca 240tgtttcaact ttgccggaac ccacaccatc accataaact ccgacgagat cgctagagaa 300gcttttagag agcgagacgc agatttggca gaccggcctc aactttccat cgtagagtcc 360attggagaca attacaaaac aatgggaacc tcatcgtacg gtgaacattt catgaagatg 420aaaaaagtga tcacaacgga aattatgtcc gttaaaacgt tgaatatgtt ggaagctgcg 480agaaccatcg aagcggataa tctcattgct tacattcact cgatgtatca acggtcggag 540acggtcgacg ttagagaact ttcgagagtt tatggttacg cagtgaccat gagaatgttg 600tttggaagga gacatgtcac gaaagaaaac atgttttcgg atgatgggag actaggaaaa 660gccgaaaaac atcatcttga ggtgattttc aacactctaa actgtttgcc aggttttagt 720cccgtggatt acgtggaccg atggttaggt ggttggaata ttgatggtga agaggagaga 780gcgaaagtga atgttaatct tgttcgtagt tacaacaatc ccataataga cgagagggtc 840gaaatttgga gggaaaaagg tggtaaggct gctgtggaag attggcttga tacgttcatt 900acgctaaaag atcaaaacgg aaactacttg gttacgccag acgaaatcaa agctcaatgc 960gtcgaatttt gtatagcagc gatcgataat ccggcaaata acatggagtg gacacttggg 1020gaaatgttaa agaacccgga gattcttaga aaagctctga aggagttgga tgaagtagtt 1080ggaaaagaca ggcttgtgca agaatcagac atacgaaatc taaactactt aaaagcttgt 1140tgcagagaaa cattcaggat tcacccaagc gctcattatg tcccacctca tgttgcccgt 1200caagatacca cccttggggg ttattttatt cccaaaggta gccacattca tgtatgccgc 1260cctgggctag gccggaaccc taaaatatgg aaagatccat tagcatacga accggagcgt 1320cacctccaag gagacggaat cacaaaagag gttactctgg tcgaaacaga gatgcgtttt 1380gtctcattta gcactggtag acgtggctgc gtcggtgtca aagtcgggac aattatgatg 1440gctatgatgt tggctaggtt tcttcaaggt tttaactgga aactccatcg agatttcgga 1500ccgttaagcc tcgaggaaga tgatgcatca ttgcttatgg ctaagcctct tcttttgtct 1560gttgagccac gcttggcatc aaacctttat ccaaaattcc gtccttaa 1608
權(quán)利要求
1.編碼將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶的DNA。
2.權(quán)利要求1的DNA，其可將L-纈氨酸或L-異亮氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟；將酪氨酸轉(zhuǎn)變成對(duì)羥基苯乙醛肟；將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)變成苯乙醛肟；將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-乙醛肟；或?qū)㈤L(zhǎng)鏈甲硫氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟。
3.權(quán)利要求1的DNA，其編碼由獨(dú)立選自下組的氨基酸殘基組成的P450單加氧酶Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Trp、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、和His，其中所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的整體比對(duì)與得自SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或二者；SEQ ID NO39；或者SEQ ID NO54或SEQ ID NO70或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示有至少40％同一性，或者與得自SEQ IDNO9或SEQ ID NO11或二者；或者SEQ ID NO74或SEQ ID NO84或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示有至少50％同一性。
4.權(quán)利要求1的DNA，其中開放讀碼框可操作連接一種或多種調(diào)控序列，所述調(diào)控序列不同于與包含開放讀碼框外顯子的基因組基因相連的調(diào)控序列。
5.權(quán)利要求1-4的DNA，其編碼具有通式R1-R2-R3的P450單加氧酶，其中-R1、R2、和R3稱為成份序列，且-R2由150-175個(gè)或更多氨基酸殘基組成，其序列與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3；SEQ ID NO9或SEQ ID NO11；SEQ ID NO39；SEQ ID NO54或SEQ ID NO70；或者SEQ ID NO74或SEQ IDNO84中的經(jīng)比對(duì)成份序列至少60-65％同一。
6.權(quán)利要求1的DNA，其中R2的氨基酸序列由下列表示SEQ ID NO1的第334-484位氨基酸或SEQ ID NO3的第333-483位氨基酸；SEQID NO9的第339-489位氨基酸或SEQ ID NO11的第332-482位氨基酸；SEQ ID NO39的第308-487位氨基酸；SEQ ID NO54的第196-345位氨基酸或SEQ ID NO70的第192-341位氨基酸；SEQ ID NO74的第334-483位氨基酸或SEQ ID NO84的第332-481位氨基酸。
7.權(quán)利要求1的DNA，其編碼長(zhǎng)度為450-600個(gè)氨基酸殘基的P450單加氧酶。
8.權(quán)利要求1的DNA，其編碼具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3；SEQ ID NO9或SEQ ID NO11；SEQ ID NO39；SEQ ID NO54或SEQ ID NO70；SEQ ID NO74或SEQ ID NO84的氨基酸序列的P450單加氧酶。
9.權(quán)利要求1的DNA，其具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4；SEQID NO9或SEQ ID NO12；SEQ ID NO40；SEQ ID NO75或SEQ IDNO85的核苷酸序列。
10.由權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的DNA所編碼的、可將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟的P450單加氧酶。
11.一種植物，其基因組DNA中包含并表達(dá)權(quán)利要求4的DNA。
12.用于分離編碼P450單加氧酶的cDNA的方法，所述酶可將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟；該方法包括(1)由表達(dá)這種單加氧酶的植物組織構(gòu)建cDNA文庫(kù)；(2)使用根據(jù)SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、或SEQ ID NO4；SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、或SEQ ID NO12；SEQ ID NO39或SEQ ID NO40；SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO70、或SEQ ID NO71；或者SEQ ID NO74、SEQ ID NO75、SEQ ID NO84、或SEQ ID NO85設(shè)計(jì)的至少一種寡核苷酸由該cDNA文庫(kù)擴(kuò)增P450單加氧酶cDNA的部分；(3)任選使用根據(jù)SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、或SEQ ID NO4；SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、或SEQ ID NO12；SEQ ID NO39或SEQ ID NO40；SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO70、或SEQ ID NO71；或者SEQ ID NO74、SEQ ID NO75、SEQ ID NO84、或SEQ IDNO85設(shè)計(jì)的另一種寡核苷酸在嵌套PCR反應(yīng)中由該cDNA文庫(kù)擴(kuò)增P450單加氧酶cDNA的部分；(4)使用在步驟(2)或(3)中獲得的DNA作為探針篩選由表達(dá)P450單加氧酶的植物組織構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，所述酶可將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟；和(5)鑒定并純化包含編碼蛋白質(zhì)的開放讀碼框的載體DNA，所述蛋白質(zhì)的特征為氨基酸序列與得自SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或二者；SEQ ID NO39；SEQ ID NO54或SEQ ID NO70或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示有至少40％同一性，或者與得自SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或二者；或者SEQ ID NO74或SEQ ID NO84或二者整體比對(duì)的氨基酸序列顯示有至少50％同一性；(6)任選進(jìn)一步處理純化的DNA。
13.通過一種或多種寡核苷酸的雜交來(lái)選擇具有期望性狀的植物的標(biāo)記輔助育種方法，其中至少一種所述寡核苷酸的序列構(gòu)成權(quán)利要求1的DNA的成份序列。
14.純化的重組P450單加氧酶的生產(chǎn)方法，所述酶可將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟，該方法包括在巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)中表達(dá)相應(yīng)基因。
15.獲取轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(1)將包含P450單加氧酶的至少部分開放讀碼框的DNA穩(wěn)定整合到能夠再生成完整植株的植物細(xì)胞或組織中，所述酶可將脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟；并(2)選擇轉(zhuǎn)基因植物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中導(dǎo)致P450單加氧酶在植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
17.權(quán)利要求15的方法，其中導(dǎo)致內(nèi)源P450單加氧酶在植物中的表達(dá)降低。
18.權(quán)利要求15的方法，其中導(dǎo)致芥子油苷或含氰苷的含量或分布改變。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼CYP79家族的細(xì)胞色素P450單加氧酶的DNA，該家族可催化脂肪族或芳香族氨基酸或長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是催化L－纈氨酸和L－異亮氨酸的轉(zhuǎn)變的酶諸如木薯酶CYP79D1和CYP79D2、催化酪氨酸的轉(zhuǎn)變的酶諸如海韭菜酶CYP79E1和CYP79E2、催化色氨酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)肟吲哚－3－乙醛肟的酶諸如擬南芥酶CYP79A2和蔓菁酶CYP79B5、及催化長(zhǎng)鏈甲硫氨酸同源物的轉(zhuǎn)變的酶諸如擬南芥酶CYP79F1和CYP79F2。所述DNA或其部分在植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可用于操作相應(yīng)芥子油苷或含氰苷的生物合成。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1396953SQ01804098
公開日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2001年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月13日
發(fā)明者M·D·安德森, B·L·莫勒, J·S·尼爾森, U·威特斯托克, C·H·漢森, B·A·哈爾基爾, M·D·米凱爾森, P·坎普巴斯克, S·巴克 申請(qǐng)人:辛根塔參與股份公司, 皇家獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)大學(xué)