專利名稱：甲烷氧化菌的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物的培養(yǎng)方法，特別是涉及一種甲烷氧化菌的快速培養(yǎng)方法。
背景技術：
甲烷氧化菌是自然界中一類非常特殊的微生物，它以甲烷為唯一的碳源及能源。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。研究表明甲烷氧化菌可以廣泛地應用于生物轉化及環(huán)境治理中。甲烷單加氧酶是甲烷氧化菌利用甲烷的關鍵酶，在該酶的作用下，甲烷氧化菌能夠利用空氣中的氧氣作為電子受體將甲烷直接氧化為甲醇。一般情況下，由于甲烷在水溶液中的溶解度較低，導致甲烷氧化菌生長速率慢、所得細胞濃度低，成為限制甲烷氧化菌工業(yè)化應用的瓶頸。提高氣液傳質(zhì)是強化甲烷氧化菌生長和甲醇生產(chǎn)的關鍵技術之一。因此，如何強化氣液傳質(zhì)，提高氣液傳質(zhì)速率，是實現(xiàn)甲烷氧化菌的高密度細胞培養(yǎng)首先需要解決的問題。傳統(tǒng)的解決辦法是增加氣速和攪拌速率。但增加氣速和攪拌速率，一方面可導致大量的泡沫生成，從而降低反應器使用效率；另一方面氣速和攪拌速率的增加必然增大動力消耗，增加操作成本。和一般好氧微生物細胞的培養(yǎng)不同，甲烷氧化菌的細胞培養(yǎng)過程，不僅需要空氣或氧氣，而且需要甲烷。甲烷與空氣或氧氣的混合比例超過一定范圍時具有爆炸危險，而且，增大氣流速度必然導致氣體的大量循環(huán)，且工藝復雜，動力消耗增加。
傳統(tǒng)的甲烷氧化菌的固體平板培養(yǎng)法操作復雜，培養(yǎng)時間長。不僅需要每天換氣，而且培養(yǎng)到菌落出現(xiàn)一般需4-6周的時間，在反復地換氣過程中又極易造成雜菌的污染。因此有必要發(fā)明一種快速、簡便的甲烷氧化菌的固體平板培養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可顯著提高甲烷氧化菌的生長速率的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所提供的甲烷氧化菌的快速培養(yǎng)方法，是在常規(guī)培養(yǎng)甲烷氧化菌的培養(yǎng)基中添加脂肪酸。
所述脂肪酸可為任意一種碳鏈長度大于10，且常溫下呈液態(tài)的脂肪酸，如油酸、亞油酸、十一酸、十二酸，十三酸、十四酸、十五酸或十六酸等。
上述培養(yǎng)方法對甲烷氧化菌的液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)同時適用。
對甲烷氧化菌進行液體培養(yǎng)時，只需將脂肪酸直接加入培養(yǎng)基中即可。脂肪酸的使用量與培養(yǎng)容器的形狀有關，其在培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分含量優(yōu)選為0.1-20％，勿使培養(yǎng)基表面覆蓋的脂肪酸層太厚。
對甲烷氧化菌進行固體培養(yǎng)時，需將經(jīng)甲烷飽和的脂肪酸涂布在固體培養(yǎng)基表面。
所述對脂肪酸用甲烷進行飽和的方法，是將脂肪酸置于充滿甲烷的密閉器皿中進行振蕩，使甲烷分子盡可能地溶解于脂肪酸中；若在50-250rpm的振速下，振蕩12-24小時即可。
在固體培養(yǎng)基表面涂布的脂肪酸層的厚度可為0.5-3mm，勿使培養(yǎng)基表面覆蓋的脂肪酸層太厚。
為獲得更好的培養(yǎng)效果，可將表面涂布有用甲烷飽和的脂肪酸的固體培養(yǎng)基在30℃下放置12-24小時，再按常規(guī)方法進行接種、培養(yǎng)。
本發(fā)明提供了一種甲烷氧化菌的快速培養(yǎng)方法。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)脂肪酸受到機械力的作用形成微小的小球，這些小球可以在氣相與菌體之間穿梭運動，從而源源不斷地將空氣中的甲烷直接供給菌體生長之用；2)脂肪酸與菌體代謝物聯(lián)合作用產(chǎn)生極為穩(wěn)定的微乳相，該微乳相的增容作用有利于甲烷氧化菌的生長。本發(fā)明人先前申請的專利(緱仲軒，邢新會等，一種培養(yǎng)甲烷氧化菌的方法，申請?zhí)?00510105989.3)中的方法只具有第一個優(yōu)點，因而培養(yǎng)效果無法與本發(fā)明的方法相比。此外，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明的方法可以成倍地提高甲烷氧化菌的生長速度，最高可達50倍。此外，在用本發(fā)明的方法對甲烷氧化菌進行固體平板培養(yǎng)時，不再需要頻繁地給固體平板補充甲烷氣體，菌體的生長速度也得到顯著提高?；谏鲜鰞?yōu)點，本發(fā)明將在甲烷氧化菌及其相關產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮巨大作用，具有廣闊的應用前景。
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為經(jīng)甲烷飽和的不同甲烷溶劑對甲烷氧化菌生長速度影響的比較試驗中培養(yǎng)第2、3、4天菌液OD600光密度值的測定結果圖2為經(jīng)甲烷飽和的不同甲烷溶劑對甲烷氧化菌生長速度影響的比較試驗中培養(yǎng)結束后細胞干重的統(tǒng)計結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為去離子水。
NMS培養(yǎng)基配方每升培養(yǎng)基中含有NaNO30.85克，KH2PO40.53克，Na2HPO42.17克，K2SO40.17克，MgSO4·7H2O 0.037克，CaCl2·2H2O 0.007克，微量元素貯存液2mL，1mmol/L H2SO40.5毫升，F(xiàn)eSO4·7H2O 11.2毫克，CuSO4·5H2O 2.5毫克(固體培養(yǎng)基再添加1.5％的瓊脂)，pH7.0。
微量元素貯存液的配方為每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042克，MnSO4·4H2O0.223g，H3BO30.062g，Na2MoO4·2H2O 0.048g，CoCl2·6H2O 0.048g，KI 0.083g。
實施例1、甲烷氧化菌的種子培養(yǎng)1)用滅菌的接種環(huán)挑取甲烷氧化菌保存液(Methylosinus trichosporium)OB3b(Sullivan JP et al.Methanotrophs，Methylosinus trichosporium OB3b，sMMO，and their application to bioremediation，Crit.Rev.Microbiol.，1998，4(24)335-373；Takeguchi M et al.，Properties of the membranes containing theparticulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b，Biometals，1998，11229-234)，用劃線的方法將其接種于NMS平板固體培養(yǎng)基表面，每天用注射器通過0.2μ的過濾器向培養(yǎng)皿中加入5-10毫升的甲烷氣體，30℃培養(yǎng)四周后，平板上有明顯的單菌落產(chǎn)生。
2)取50毫升的培養(yǎng)瓶，裝入NMS液體培養(yǎng)基10毫升，滅菌后，從步驟1)的固體平面上挑一單菌落接種到該NMS液體培養(yǎng)基中，每天用注射器通過0.2μ的過濾器加入5-10毫升的甲烷氣體，30℃、150rpm振蕩培養(yǎng)四周后，培養(yǎng)基可見混濁，用此甲烷氧化菌的常規(guī)培養(yǎng)方法獲得了甲烷氧化菌的種子。
實施例2、不同甲烷溶劑對甲烷氧化菌生長速度影響的比較1、甲烷溶劑的飽和處理取6個50毫升的培養(yǎng)瓶，分別裝入20毫升的油酸，121℃15分鐘滅菌后，通過0.2μ的過濾器加入40毫升的甲烷，在30℃的搖床上振蕩12小時(中間通過0.2μ的過濾器補充甲烷數(shù)次)，得到經(jīng)甲烷飽和的油酸。
2、經(jīng)甲烷飽和的不同甲烷溶劑對甲烷氧化菌生長速度影響的比較試驗取50毫升的培養(yǎng)瓶7個，均裝入NMS液體培養(yǎng)基10毫升，滅菌后每個培養(yǎng)瓶中分別加入1毫升上述經(jīng)甲烷飽和的不同甲烷溶劑(苯、環(huán)已烷、癸烷、辛烷、甲苯、石蠟油、油酸)，再加入500微升實施例1制備的種子液，然后用注射器通過0.2μ的過濾器加入20毫升的甲烷氣體，在30℃、150rpm下培養(yǎng)1周，以常規(guī)培養(yǎng)方法為對照，并分別于第2、3、4天記錄菌液OD600的光密度值，光密度值測定結果如圖2所示(1為常規(guī)的甲烷氧化菌培養(yǎng)結果；2為利用苯作為甲烷溶劑的培養(yǎng)結果；3為利用環(huán)已烷作為甲烷溶劑培養(yǎng)甲烷氧化菌的培養(yǎng)結果；4為利用癸烷作為甲烷溶劑的培養(yǎng)結果；5為利用辛烷作為甲烷溶劑的培養(yǎng)結果；6為利用甲苯作為甲烷溶劑的培養(yǎng)結果；7為利用石蠟油作為甲烷溶劑的培養(yǎng)結果；8為利用油酸作為甲烷溶劑的培養(yǎng)結果)，培養(yǎng)結束后，統(tǒng)計細胞干重，統(tǒng)計結果如圖2所示(1號為空白組，2號為辛烷實驗組的細胞回收率，3號為庚烷實驗組的細胞回收率，4號為石蠟油實驗組的細胞回收率，5號為油酸實驗組的細胞回收率)，實驗結果表明油酸實驗組的甲烷氧化菌的細胞濃度明顯高于其它處理組，OD600的光密度值可達到32，干細胞回收率可達13±2.85克/升。
實施例3、利用油酸進行甲烷氧化菌的固體平面培養(yǎng)取200微升實例2中的經(jīng)甲烷飽和的油酸，涂布于NMS固體平板的培養(yǎng)基表面，30℃放置20小時后，用接種環(huán)取實例1中的菌液劃線接種于固體培養(yǎng)平板上，30℃培養(yǎng)，以傳統(tǒng)的甲烷氧化菌的固體培養(yǎng)為對照。結果培養(yǎng)一周后有明顯的菌落產(chǎn)生，而對照組在4-6周后才有菌落產(chǎn)生，且操作復雜。該實驗結果表明本發(fā)明的培養(yǎng)方法也可顯著提高甲烷氧化菌固體培養(yǎng)的生長速率。
權利要求
1.一種培養(yǎng)甲烷氧化菌的方法，是在常規(guī)培養(yǎng)甲烷氧化菌的培養(yǎng)基中添加脂肪酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述脂肪酸為任意一種碳鏈長度大于10，且常溫下呈液態(tài)的脂肪酸。
3.根據(jù)權利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述脂肪酸為油酸、亞油酸、十一酸、十二酸，十三酸、十四酸、十五酸或十六酸。
4.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其中對甲烷氧化菌進行液體培養(yǎng)時，將脂肪酸直接加入培養(yǎng)基中，脂肪酸在培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分含量為0.1-20％。
5.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其中對甲烷氧化菌進行固體培養(yǎng)時，將經(jīng)甲烷飽和的脂肪酸涂布在固體培養(yǎng)基表面。
6.根據(jù)權利要求5所述的培養(yǎng)方法，其中經(jīng)甲烷飽和的脂肪酸是將脂肪酸置于充滿甲烷的密閉器皿中進行振蕩得到的，培養(yǎng)中可根據(jù)需要繼續(xù)加氣。
7.根據(jù)權利要求6所述的培養(yǎng)方法，其中所述振蕩的速度為50-250rpm，振蕩時間為12-24小時。
8.根據(jù)權利要求5所述的培養(yǎng)方法，其中所述在固體培養(yǎng)基表面涂布的脂肪酸層的厚度為0.5-3mm。
9.根據(jù)權利要求5-8任一項所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述將表面涂布有經(jīng)甲烷飽和的脂肪酸的固體培養(yǎng)基在30℃下放置12-24小時，再進行接種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲烷氧化菌的培養(yǎng)方法。該方法是在常規(guī)培養(yǎng)甲烷氧化菌的培養(yǎng)基中添加脂肪酸。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)脂肪酸受到機械力的作用形成微球，這些小球可以在氣相與菌體之間穿梭運動，從而源源不斷地將空氣中的甲烷直接供給菌體生長之用；2)脂肪酸與菌體代謝物聯(lián)合作用產(chǎn)生極為穩(wěn)定的微乳相，微乳相的增容作用有利于甲烷氧化菌的生長。此外，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明的方法可以成倍地提高甲烷氧化菌的生長速度，最高達50倍。在用該方法對甲烷氧化菌進行固體平板培養(yǎng)時，不再需要頻繁地給固體平板補充甲烷氣體，菌體的生長速度也得到顯著提高。本發(fā)明將在甲烷氧化菌及其相關產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮巨大作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N1/26GK1807597SQ20051013745
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月30日 優(yōu)先權日2005年12月30日
發(fā)明者緱仲軒, 邢新會, 吳昊, 王磊, 韓冰 申請人:清華大學