專(zhuān)利名稱(chēng)：脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物及血紅素肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物及血紅素肽的制備方法，具體涉 及以豬血紅細(xì)胞為原料，通過(guò)溶血、控制蛋白酶酶解、等電離心分離制備脫血紅素 豬血血紅蛋白酶解物及血紅素肽，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于歷史和傳統(tǒng)的原因，我國(guó)每年出欄和屠宰豬的數(shù)量極其龐大根據(jù)國(guó)家統(tǒng) 計(jì)局的數(shù)據(jù)，我國(guó)2004年豬的出欄量為6.4億頭，除了越200萬(wàn)頭活豬出口，絕大多 數(shù)出欄的豬都宰國(guó)內(nèi)屠宰。以每頭豬收集豬血2,2公斤計(jì)算，則2004年我國(guó)就有140 萬(wàn)噸豬血產(chǎn)量。豬血血紅蛋白是血液中重要的組成部分，約占豬血蛋白總量的65%。 血紅蛋白中富含血紅素，100g豬血血紅蛋白含血紅素鐵40mg，如不將血紅素與血紅 蛋白分離，而直接將血紅蛋白添加到食品中易導(dǎo)致食品氧化劣變，且產(chǎn)品顏色變深， 這嚴(yán)重制約了豬血資源的開(kāi)發(fā)利用。目前除有小部分血紅蛋白用于生產(chǎn)附加值劍氐 的產(chǎn)品，如血豆腐、血腸及詞用血粉，但其它大部分血紅蛋白均直接排放廢棄，造 成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。從血紅蛋白分離血紅素和蛋白的方法大多是采用 有機(jī)溶劑法，該方法導(dǎo)致有機(jī)溶劑殘留，蛋白難以回收利用，環(huán)境污染較大。后來(lái) 亦有學(xué)者(Houlier、 Synowiecki、 Ockerman)采用酶水解法來(lái)提取血紅細(xì)胞中的血紅 蛋白，酶解后的產(chǎn)物采用活性碳吸附法脫血紅素。采用該方法血紅細(xì)胞的蛋白質(zhì)回 收率僅為60-70%，酶解產(chǎn)物有較重的苦味，且血紅素難以回收利用，這影響了該法 的推廣應(yīng)用。后有學(xué)者采用CMC吸附法從血紅蛋白酶解產(chǎn)物中提取血紅素，雖避免 了添加有機(jī)溶劑，但在提取過(guò)程中需加入大量的水(9倍)，蛋白質(zhì)回收的能耗增大， 實(shí)際應(yīng)用受到限制。
測(cè)定蛋白質(zhì)回收率、血紅素回收率和水解度的公式如下
蛋白質(zhì)回收率=脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物中蛋白含量/豬血血紅細(xì)胞中總蛋白含 量X1000/0
血紅素回收率=血紅素肽中血紅素含量/豬血血紅細(xì)胞中血紅素總量乂100% 水解 度=上清液中氨態(tài)氮含量/上清液中總氮含量乂100%

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述能耗大、脫血紅素豬血血紅蛋白酶 解物回收率低或血紅素肽回收率低、環(huán)境污染較大以及酶解產(chǎn)物有較重的苦味等缺 陷，提供一種脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物和血紅素肽的制備方法，使脫血紅素血
紅蛋白酶解物的蛋白質(zhì)回收率達(dá)80% 85 % ，血紅素肽的血紅素回收率達(dá)到90%-93 %，血紅素含量達(dá)到25% 30%。本發(fā)明采用綠色生產(chǎn)工藝，原料利用率高。
本發(fā)明所述的脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物及血紅素肽的制備方法包括如下步
驟
(1 )豬血血紅蛋白加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為12.4% 17.5% ，調(diào)節(jié)溶液pH值到7.1 7.8，加入胰酶和Protamex或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶進(jìn)行水解，當(dāng)水解度達(dá)到 25% 31%時(shí)終止反應(yīng)；
(2) 將步驟(1)得到的水解產(chǎn)物在3000g 4000g條件下離心10min 20min，分 別得到上清液和沉淀；
(3) 將步驟(2)離心得到的上清液調(diào)pH至3.5 5.2， 30。C 5(TC水浴保溫10 60min后，3000g 4000g離心10min 20min，分別得到上清液和沉淀；
(4) 將步驟(2)和(3)離心得到的沉淀合并，用0.2 0.5倍重量的蒸餾水洗滌， 在3000g 4000g離心10min 20min,分別得到上清液和沉淀；
(5) 將步驟(3)和(4)離心得到的上清液調(diào)pH為7.0，濃縮，噴霧干燥，得到 淡黃色粉狀脫血紅素血紅蛋白酶解物。豬血血紅蛋白的蛋白質(zhì)回收率可達(dá)80% 85 %，產(chǎn)物無(wú)苦味，其蛋白質(zhì)的含量為90% 93%;(6)將步驟(4)離心得到的沉淀置于-5。C -2(TC條件下凍藏12h 24h， 25。C解凍 后加0.5倍重量的蒸餾水洗滌，在3000g 4000g條件下離心10min 20min，棄去 上清液，得到沉淀，將沉淀在同樣條件下凍藏、洗滌、離心，重復(fù)2 4次，將沉 淀干燥得血紅素肽。
在步驟(1)中，用2MNaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.1 7.8。 在步驟(1)中，用95。C 10(TC加熱5min 10min終止酶解反應(yīng)。 在步驟(3)中，用2MHCl將溶液pH值調(diào)節(jié)到3.5 5.2。 在步驟(5)中，用2MNaOH將上清液pH值調(diào)節(jié)到7.0。
在步驟(6)中，采用冷凍干燥法將沉淀干燥為黑色粉末，此時(shí)血紅素含量達(dá)25% 30%，肽或蛋白質(zhì)的含量70% 75%。
所述豬血血紅蛋白溶液可以采用現(xiàn)有技術(shù)得到，本發(fā)明采用下述方法制備得 到檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33%擰檬酸鈉并混合均勻抗凝，然后經(jīng) 過(guò)3000g 4000g、 5。C 10。C離心10min 20min，下層沉淀為血紅細(xì)胞。血紅細(xì)胞 加1.0 1.5倍體積的水再經(jīng)20Mpa 60Mpa均質(zhì)或超聲波功率為1000W 1500W 超聲處理2min 5min得到豬血血紅蛋白溶液。
所述的蛋白酶均為食品級(jí)蛋白酶，其混合蛋白酶具體比例(U/U)如下
胰酶Protamex = 1 2 : 9;
胰酶木瓜蛋白酶=1 2 : 8。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明通過(guò)高壓均質(zhì)或超聲處理對(duì)血 紅細(xì)胞進(jìn)行溶血處理，采用復(fù)合蛋白酶對(duì)血紅蛋白進(jìn)行高效可控水解，采用等電點(diǎn) 沉淀法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物與血紅素肽的高效分離，制備了符合食品工業(yè)應(yīng)用要求 的脫血紅素酶解血紅蛋白粉和血紅素肽。該方法反應(yīng)條件溫和，無(wú)二次污染，蛋白 質(zhì)回收率最高可達(dá)85%，比目前文獻(xiàn)報(bào)道的最好水平提高了 10% 15%。血紅素回 收率達(dá)到93%左右，血紅素肽中血紅素含量達(dá)到25% 30%，兩種產(chǎn)物均無(wú)不良風(fēng) 味。
具體實(shí) 式
實(shí)施例l
第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33%檸檬酸鈉并混合均勻抗凝， 3000g、 5。C離心20min，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.5倍體積的水后， 20MPa均質(zhì)溶血得到豬血血紅蛋白溶液。
第二步將豬血血紅蛋白溶液加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量至12.4%，混合均勻后用2M NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.]，加入胰酶和Protamex進(jìn)行水解，比例(U/U)為胰 酶:Protamex = 1:9。當(dāng)水解度達(dá)到30。/。時(shí)，IO(TC加熱5min終止酶解反應(yīng)。 第三步將7K解產(chǎn)物在3000g條件下離心20min，分別得到沉淀和上清液。
第四步:將第三步得到上清液調(diào)pH至3.5， 30'C水浴30min后，在3000g離心20min， 分別得到上清液和沉淀。
第五步將第三步和第四步的沉淀合并，加0.2倍重量的蒸餾水洗滌，在3000g離 心20min，分別得到上清液和沉淀。
第六步將第四步和第五步的上清液合并，調(diào)pH值至7.0，濃縮、噴霧干燥得到淡 黃色脫血紅素酶解物。其蛋白質(zhì)含量為91.5%，蛋白回收率為80.6%。 第七步將第五步所得沉淀置于-5"凍藏12h，解凍后加0.5倍重量的蒸餾水洗滌， 在3000g條件下離心20min，棄去上清液，得到沉淀，將該沉淀按該步驟中上述操 作重復(fù)處理2次，得血紅素肽。
第八歩采用冷凍干燥法將第七步所得血紅素肽干燥為黑色粉末，血紅素的回收率 達(dá)90.6 % ，血紅素肽中血紅素含量為26.8 % 。
實(shí)施例2
第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33%檸檬酸鈉并混合均勻抗凝，然 后經(jīng)過(guò)4000g、 I(TC離心IO分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅細(xì)胞加1.4倍體積 的水再經(jīng)60Mpa均質(zhì)溶血得到豬血血紅蛋白溶液。
第二步將豬血血紅蛋白溶液加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為13.5%，混合均勻后用2M
NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.3，加入胰酶和Protamex，比例為胰酶:Protamex = 2:9，
當(dāng)水解度達(dá)到28%時(shí)，95'C加熱10min終止酶解反應(yīng)。
第三步將水解產(chǎn)物在3500g離心15min，分別得到沉淀和上清液。
第四步將第三步的上清液調(diào)pH至4.0， 40。C水浴30min后，3500g條件下離心
15min，分別得到上清液和沉淀。
第五步將第三步和第四步的沉淀合并，加0.3倍重量的蒸餾水洗滌，在4000g條 件下離心10min，分別得到上清液和沉淀。
第六步將第四步和第五步的上清液合并，調(diào)pH值為7.0，濃縮，噴霧干燥得到淡 黃色產(chǎn)物。其蛋白質(zhì)含量為90.2%，蛋白回收率為82.1%。
第七步將第五步所得沉淀置于-10'C凍藏12h，解凍后加0.5倍重量的蒸餾水洗滌， 在3000g條件下離心20min，棄去上清液，得到沉淀，將該沉淀按該步驟中上述操 作重復(fù)處理3次，得血紅素肽產(chǎn)品。
第八步將第七步所得血紅素肽冷凍干燥得黑色粉末，血紅素含量為25.9%，血紅 素的回收率達(dá)91.2%。
實(shí)施例3
第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33%檸檬酸鈉并混合均勻抗凝， 3500g、 5"C離心15分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞。血紅細(xì)胞加1.3倍體積的水經(jīng)超 聲波功率為1100W超聲3min溶血得到豬血血紅蛋白溶液。
第二步豬血血紅蛋白溶液加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為16.5%，用2MNaOH將溶液
pH值調(diào)節(jié)到7.4，加入胰酶和木瓜蛋白酶，比例為胰酶:木瓜蛋白酶二 2:8 (U/U)，
當(dāng)水解度達(dá)到26%時(shí)，IO(TC加熱10min終止酶解反應(yīng)。
第三步將酶解產(chǎn)物在4000g離心10min，分別得到沉淀和上清液。
第四步將第三步的上清液調(diào)pH至4.5， 5(TC水浴10min后，在3500g離心15min，
分別得至l讓清液和沉淀。
第五步將第三步和第四步的沉淀合并，加0.5倍重量的蒸餾水洗滌，在4000g條 件下離心10min，分別得到上清液和沉淀。
第六步將第四步和第五步的上清液合并，調(diào)pH值為7.0，濃縮，噴霧干燥得到淡 黃色產(chǎn)物。其蛋白質(zhì)含量為90.5%，蛋白回收率為84.3%。
第七步將第五步所得沉淀置于-2(TC凍藏12h，解凍后加0.5倍重量的蒸餾水洗滌， 在3500g條件下離心15min，棄去上清液，得到沉淀。將該沉淀按該步驟中上述操 作重復(fù)處理4次，得血紅蛋白肽。
第八步將第七步所得血紅蛋白肽冷凍干燥為黑色粉末。黑色粉末的血紅素含量為 26.4%,血紅素的回收率達(dá)92.7%。
實(shí)施例4
第一步檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33%檸檬酸鈉并混合均勻抗凝， 3500g、 5。C離心15分鐘，得到下層沉淀血紅細(xì)胞。血紅細(xì)胞加1.1倍體積的水經(jīng)超 聲波功率為1500W超聲2min溶血得到豬血血紅蛋白溶液。
第二步豬血血紅蛋白溶液加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為17.5%，混合均勻后用2M
NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)到7.7，加入胰酶和木瓜蛋白酶，比例為胰酶木瓜蛋白酶
=1:8 (U/U)，當(dāng)水解度為25%時(shí)，IO(TC加熱8min終止酶解反應(yīng)。
第三步將酶解產(chǎn)物在4000g離心20min，分別得到沉淀和上清液。
第四步..將第三步的上清液調(diào)pH至5.0， 40。C水浴40min后，4000g離心10min，
分別得到上清液和沉淀。
第五步將第三步和第四步的沉淀合并，加0.2倍重量的蒸餾水洗滌，在4000g離 心15min，分別得到上清液和沉淀。
第六步將第四步和第五步的上清液合并，調(diào)pH值為7.0， ？農(nóng)縮，噴霧干燥得到淡 黃色產(chǎn)物。淡黃色產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量為91.4%，蛋白回收率為84.1%。
第七步將第五步所得沉淀置于-2(TC凍藏24h，解凍后加0.5倍重量的蒸餾水洗滌， 在3000g離心18min，棄去上清液，得到沉淀，將該沉淀按該步驟中上述操作重復(fù) 處理3次，得血紅蛋白肽。
第八步將第七步所得血紅蛋白肽冷凍千燥為黑色粉末。黑色粉末中血紅素含量為 29.9%，血紅素的回收率達(dá)90.4%。
權(quán)利要求
1、一種脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物及血紅素肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)豬血血紅蛋白溶液加水調(diào)整其蛋白質(zhì)含量為12.4％～17.5％，調(diào)節(jié)溶液pH值到7.1～7.8，加入胰酶和Protamex或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶進(jìn)行酶解，當(dāng)水解度達(dá)到25％～31％時(shí)終止酶解反應(yīng)；(2)將步驟(1)得到的酶解產(chǎn)物在3000g～4000g條件下離心10min～20min，分別得到上清液和沉淀；(3)將步驟(2)離心得到的上清液調(diào)pH至3.5～5.2，30℃～50℃水浴10min～60min后，在3000g～4000g條件下離心10min～20min，分別得到上清液和沉淀；(4)將步驟(2)和(3)離心得到的沉淀合并，用0.2～0.5倍重量的蒸餾水洗滌，在3000g～4000g離心10mm～20min，分別得到上清液和沉淀；(5)將步驟(3)和(4)離心得到的上清液合并，調(diào)pH至7.0，濃縮，噴霧干燥，得到淡黃色粉狀脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物；(6)將步驟(4)離心得到的沉淀置于-5℃～-20℃條件下凍藏12h～24h，解凍后加0.5倍重量的蒸餾水洗滌，在3000g～4000g條件下離心10min～20min，棄去上清液，得到沉淀，將該沉淀按步驟(6)中上述操作重復(fù)處理2～4次，冷凍干燥，得血紅素肽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的混合蛋白酶的比例(U/U) 為胰酶Protamex = 1 2 : 9或S夷酶木瓜蛋白酶=1 2 : 8。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(1)中，用2MNaOH 調(diào)節(jié)溶液pH至7.1 7.8。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)中，在95。C 10(TC條 件下加熱5min 10min后終止酶解反應(yīng)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(3)，用2MHCl將溶液pH值調(diào)節(jié)到3.5 5.2。 '
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(5)，用2MNaOH將上清 液pH值調(diào)節(jié)到7.0。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述豬血血紅蛋白采用下述方法 制備得到檢疫合格的生豬經(jīng)空心刀采血，加入0.33%檸檬酸鈉并混合均勻抗凝， 經(jīng)過(guò)3000g 4000g、 5。C 10。C離心10min 20min，得到下層沉淀血紅細(xì)胞，血紅 細(xì)胞加1.0 1.5倍體積的水再經(jīng)20Mpa 60Mpa均質(zhì)或超聲波功率為1000W 1500W超聲處理2min 3min，溶血得到豬血血紅蛋白溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物和血紅素肽的制備方法。該方法以豬血紅細(xì)胞為原料，通過(guò)溶血、復(fù)合蛋白酶酶解、等電離心分離制備脫血紅素豬血血紅蛋白酶解物及血紅素肽。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，脫血紅素酶解物的蛋白質(zhì)回收率達(dá)80～85％，血紅素肽中血紅素回收率達(dá)到90～93％以上，血紅素含量達(dá)到25～30％。兩種產(chǎn)物均無(wú)不良風(fēng)味，可直接添加于食品。
文檔編號(hào)A23J3/00GK101194665SQ20071003182
公開(kāi)日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者劉通迅, 春 崔, 趙強(qiáng)忠, 趙謀明, 郭善廣 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)