專(zhuān)利名稱(chēng)：使用短干擾核酸(siNA)的RNA干擾介導(dǎo)的BTB和CNC同系物1，堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子1 ...的制作方法
使用短干擾核酸(SiNA)的RNA干擾介導(dǎo)的BTB和CNC同系物1，堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子1 (Bachl )基因表達(dá)的抑制本申請(qǐng)要求于2009年3月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/161,699的利益。上文列出的申請(qǐng)包括附圖在此整體引入本文作為參考。序列表
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背景技術(shù)：
Bachl是血紅素氧合酶-1 (H0-1)和其他Nrf2依賴(lài)性II期基因的轉(zhuǎn)錄阻遏物。轉(zhuǎn)錄因子Bachl屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的cap’ η' collar (CNC)和堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈超家族(稱(chēng)為CNC-bZip)。此外，Bachl代表在其N(xiāo)末端區(qū)域中所謂的廣泛復(fù)合物(broad complex), 軌道跟蹤(tram-track)、bric-a-brac (BTB)結(jié)構(gòu)域(也稱(chēng)為痘病毒和鋅指(ΡΟΖ)結(jié)構(gòu)域)。 ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域涉及通過(guò)與共阻遏物相互作用的轉(zhuǎn)錄阻遏；這些ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域促進(jìn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和與其他蛋白質(zhì)的同和/或異寡聚體的形成。Bachl和Nrf2(CNC-bZip 家族的另一個(gè)成員，也稱(chēng)為NF-E2相關(guān)因子_2，核因子(紅細(xì)胞樣衍生的2)樣2)與蛋白質(zhì)的Maf家族成員形成異二聚體；這些異二聚體與在基因啟動(dòng)子區(qū)中的Maf識(shí)別元件(MARE， Maf相關(guān)抗氧化劑反應(yīng)元件)結(jié)合，且調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[Dhakshinamoorthyj.等人(2005) J. Biol. Chem. 280，第 16891-16900 頁(yè)；Ogawgi，K.等人(2001)，EMBO J. 20，第沘；35-2843 頁(yè); Reichard, J. F.等人(2007) Nucleic Acids Res. 35，第 7074-7086 頁(yè)；Reichard, J. F.等人(2008) J. Biol. Chem.沘3，第22363-22370頁(yè)]。雖然Nrf2是II期基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)物(例如血紅素氧合酶-1 (H0-1)、NAD (P)H醌氧化還原酶-1 (NQ01 )、谷氨酸半胱氨酸連接酶、修飾因子亞單位(GCLM)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽過(guò)氧化酶、硫氧還蛋白及其他)JfiBachl充當(dāng)這些基因中的許多的阻遏物。Bachl阻遏H0-1的能力看起來(lái)顯著超過(guò)轉(zhuǎn)錄刺激物，包括Nrf2 ；在核中Bachl和Nrf2之間的平衡調(diào)節(jié)ARE依賴(lài)性基因轉(zhuǎn)錄?？傊?可獲得的數(shù)據(jù)暗示抑制Bachl阻遏足以誘導(dǎo)H0-1表達(dá)，甚至在不存在刺激的情況下。Bachl在許多細(xì)胞和組織中表達(dá)，包括肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，以及巨噬細(xì)胞。由于 Bachl廣泛表達(dá)，H0-1 (誘導(dǎo)型H0)的表達(dá)在基本條件下，在細(xì)胞培養(yǎng)中或在體內(nèi)正常、未損傷的組織中一般很低；然而，H0-1表達(dá)在大多數(shù)組織中通過(guò)損傷或應(yīng)激上調(diào)。H0-1(及其他 II期基因)的表達(dá)水平減少已在COPD患者的肺中檢測(cè)到，暗示H0-1在慢性肺疾病中是不充分上調(diào)的。最近，幾個(gè)團(tuán)體已報(bào)道在健康與COPD受試者比較中，Nrf2及其調(diào)節(jié)物Keapl、 DJ-I 和 Bachl 的差異表達(dá)水平[Slebos，D. J 等人，(2004)Eur. Respir. J. 23，第 652-653 頁(yè)；1&^8仕611丨，？等人，(2003宂111·· Respir. J. 21，第971-976頁(yè)]。在正常與疾病肺比較中，Nrf2依賴(lài)性II期基因的表達(dá)顯著不同，其中在嚴(yán)重肺氣腫肺中觀察到H0-1、NQ01和 GLCM 顯著更低的表達(dá)水平[Goven，D.等人，(2008)Thorax，63，第 916-924 頁(yè)；Malhotrgi, D. 等人(2008)，Am. J. Respir. Crit Care Med.，178，第 592-604頁(yè)；Suzuki, Μ·等人(2008) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 39，第673-682頁(yè).]?？傊朔谓M織表達(dá)數(shù)據(jù)支持下
9述假設(shè)在COPD肺中在Nrf2活性的調(diào)節(jié)劑包括正(DJ-I)和負(fù)(Keapl和Bachl)因子之間改變的平衡，導(dǎo)致Nrf2依賴(lài)性抗氧化劑的喪失。作為這種異常應(yīng)答的部分，Bachl表達(dá)是升高的，并且HO-I表達(dá)在晚期COPD或嚴(yán)重肺氣腫患者中伴隨地下調(diào)。關(guān)于這種靶的主要指示是COPD ；關(guān)于這種靶的次要指示包括嚴(yán)重哮喘和囊性纖維化，及其他呼吸性疾病例如呼吸性疾病，例如但不限于嗜酸粒細(xì)胞性咳嗽、支氣管炎、肉瘤樣病、肺纖維化、鼻炎和竇炎，給出氧化性應(yīng)激在這些疾病的發(fā)病機(jī)理中的潛在作用?？寡趸瘎C(jī)制的重要性通過(guò)增加的炎癥、氣道高反應(yīng)性突出顯示，并且Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生在使用Nrf2缺陷小鼠的哮喘模型中觀察到。此外，HO-I的藥理學(xué)上調(diào)已顯示在變應(yīng)性疾病的動(dòng)物模型中和在囊性纖維化細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)中的有利效應(yīng)[Rangasamy，Τ.等人(2005) J. Exp. Med. 202，第 47-59 頁(yè)；Williams, Μ. A 等人，(2008) J. Immunol. 181，第 4545-4559 M ；Xia, Ζ. W.等人(2006) J. Immunol. 177，第 5936-5945 頁(yè)；Xia, Ζ. W.等人(2007) Am. J. Pathol. 171，第 1904-1914 頁(yè)；Zhou, H.等人(2004) Am. J. Respir. Crit Care Med. 170，第633-640頁(yè)]。各種機(jī)制包括炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失調(diào)和氧化性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(上皮和內(nèi)皮細(xì)胞)，促成COPD中的肺泡破壞和肺損害。氧化性應(yīng)激(定義為氧化劑種類(lèi)的產(chǎn)生和細(xì)胞抗氧化劑能力之間的失調(diào))在COPD患者中是增加的，特別是在惡化過(guò)程中，并且ROS至COPD病理生理學(xué)的促成是充分確定的[Demedts，I. K.等人(2006)Respir. Res. 7，第 53-57 頁(yè)；Macnee, W (2007) Clin. Chest Med. 28，第 479-513 頁(yè)；Barnes, P. J
(2008)Proc. Am. Thorac. Soc. 5，第857-864頁(yè)]。Nrf2途徑的激活暗示為抗氧化劑防御的恢復(fù)和氧化劑應(yīng)激負(fù)荷中的減少的可行方法，這將通過(guò)炎癥中的減少和這些患者中類(lèi)固醇治療作用可能地增強(qiáng)提供臨床益處。在不存在氧化劑應(yīng)激的情況下，Bachl與Maf識(shí)別元件(MAREs)結(jié)合為具有小 Maf蛋白質(zhì)家族成員(MafK或MafG)的異二聚體，并且抑制H0_1及其他II期基因的表達(dá)。 Bachl/ MafK異二聚體以高親和力與H0-1啟動(dòng)子中存在的MARE序列簇結(jié)合；包含2-3 MARE 基序的這些序列定位于H0-1啟動(dòng)子的增強(qiáng)子El (268 bp，定位于約-4 1Λ)和E2 (161 bp，定位于約-10 1Λ)內(nèi)。轉(zhuǎn)錄激活因子Nrf2通常(即基本條件)通過(guò)氧化還原調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)Keapl保留在細(xì)胞質(zhì)中；氧化性應(yīng)激導(dǎo)致Nrf2-Keapl復(fù)合物的解離和Nrf2后續(xù)易位至核。Nrf2/Maf異二聚體隨后與MARE/ARE序列結(jié)合且誘導(dǎo)II期基因的轉(zhuǎn)錄。在氧化性應(yīng)激的條件下，或如果細(xì)胞內(nèi)游離血紅素濃度升高，那么血紅素與Bachl的結(jié)合將引起B(yǎng)achl/ MafK與MARE序列解離，且誘導(dǎo)Bachl的核輸出和降解[Ozono, R. (2006) Curr. Pharm. Biotechnol. 7，第87-93頁(yè)]。因此，Nrf2/MafK與MAREs結(jié)合，并且H0-1及其他II期基因轉(zhuǎn)錄被打開(kāi)。Nrf2途徑的小分子激活物，特別是通過(guò)破壞Nrf2/Keapl的相互作用且從而允許 Nrf2易位到核內(nèi)，以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，已顯示針對(duì)吸煙誘導(dǎo)的肺破壞是保護(hù)性的。具體而言， 三萜類(lèi)⑶DO-Im (這在體內(nèi)和體外強(qiáng)烈上調(diào)H0-1及其他II期Nrf2依賴(lài)性基因)已顯示顯著減少肺氧化性應(yīng)激標(biāo)記、肺泡細(xì)胞凋亡和后續(xù)肺破壞、和肺動(dòng)脈血壓[Sussan，Τ. Ε.等人
(2009)Proc. Nat. Acad. Sci. 106，第 250 - 255 頁(yè)]。通過(guò)增加H0-1的表達(dá)和活性(和至較少程度的其他II期基因)，靶向Bachl將恢復(fù)針對(duì)在COPD肺中的過(guò)度氧化性應(yīng)激負(fù)荷的保護(hù)機(jī)制。具體而言，這應(yīng)導(dǎo)致減少的結(jié)構(gòu)細(xì)胞(包括肺泡上皮和內(nèi)皮細(xì)胞)凋亡和增加的炎癥消退?？傊?，這些活性將增加細(xì)胞保護(hù)，保存肺結(jié)構(gòu)且有利于COPD肺中的修復(fù)，從而減慢疾病進(jìn)展。因此，需要靶向Bachl的新治療。通過(guò)RNA干擾(下文“RNAi”)改變基因表達(dá)具體而言Bachl基因表達(dá)是用于滿足這個(gè)需要的一種方法。RNAi通過(guò)短雙鏈RNA (“dsRNA”)分子誘導(dǎo)。短dsRNA分子稱(chēng)為“短干擾RNA”或“siRNA”或“RNAi抑制劑”，沉默與siRNA共享序列同源性的信使RNAs (“mRNAs”) 的表達(dá)。這可以經(jīng)由通過(guò)包含siRNA的內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，通常稱(chēng)為RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC)介導(dǎo)的mRNA切割發(fā)生。靶RNA的切割一般發(fā)生于與siRNA雙鏈體的引導(dǎo)序列互補(bǔ)的區(qū)域中部(Elbashir等人，2001，Dev. , 15,188)0此外，RNA干擾還可以涉及小 RNA(例如微小RNA或miRNA)介導(dǎo)的基因沉默，推測(cè)通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)且從而阻止靶基因序列的轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞機(jī)制(參見(jiàn)例如，Allshire, 2002, Science, 297，1818-1819 ；Volpe等人， 2002，Science, 297，1833-1837 Jenuwein, 2002，Science, 297，2215-2218 ；和 Hall 等人， 2002，Science, 297,2232-2237)。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了使用小核酸分子通過(guò)RNA干擾(RNAi)用于調(diào)節(jié)Bachl基因表達(dá)的化合物、組合物和方法，所述Bachl基因特別是與炎性和/或呼吸性疾病或狀況的發(fā)展或維持相關(guān)的那些Bachl基因。特別地，本發(fā)明的特征在于小核酸分子，即短干擾核酸(SiNA)分子，包括但不限于短干擾 RNA (siRNA)、雙鏈 RNA (dsRNA)、微小 RNA (miRNA)、短發(fā)夾 RNA (shRNA)和環(huán)狀 RNA 分子，以及用于調(diào)節(jié)Bachl基因和/或涉及Bachl基因表達(dá)和/或活性的途徑的其他基因表達(dá)的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括彼此具有互補(bǔ)性的第一條鏈和第二條鏈的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中至少一條鏈包括下述的至少15個(gè)核苷酸其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸是任選化學(xué)修飾的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所有核苷酸都是未修飾的。在其他實(shí)施方案中，SiNA 分子的一條或兩條鏈中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20或21個(gè)修飾的核苷酸)是修飾的。修飾包括核酸糖修飾、堿基修飾、 主鏈(核苷酸間鍵)修飾、非核苷酸修飾和/或其任何組合。在一些情況下，嘌呤和嘧啶核苷酸是差別修飾的。例如，嘌呤和嘧啶核苷酸在2’-糖位置上可以是差別修飾的(S卩，至少一個(gè)嘌呤具有與在2’-糖位置上在相同或不同鏈中的至少一個(gè)嘧啶不同的修飾)。在其他情況下，至少一個(gè)修飾的核苷酸是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或2’ -0-烷基核苷酸。在一些實(shí)施方案中，SiNA分子具有在一條或兩條鏈上的1、2、3或4個(gè)核苷酸的3’ 突出端。在其他實(shí)施方案中，SiNA缺乏突出端(S卩，具有平端)。優(yōu)選地，SiNA分子具有在有義和反義鏈上的2個(gè)核苷酸的3’突出端。突出端可以是修飾或未修飾的。在突出端中的修飾核苷酸的例子包括但不限于2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸或2’ -脫氧核苷酸。反義鏈中的突出端核苷酸可以包括與Bachl靶序列中的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。同樣地，有義鏈中的突出端可以包括在Bachl靶序列中的核苷酸。在某些情況下，本發(fā)明的SiNA 分子具有其為2’ -0-烷基核苷酸的在反義鏈上的2個(gè)3’突出端核苷酸，和其為2’ -脫氧核苷酸的在有義鏈上的2個(gè)3’突出端核苷酸。在某些實(shí)施方案中，SiNA分子具有帽(在本文中也稱(chēng)為“末端帽”。帽可以存在于 5’ -末端(5’ -帽)或3’ -末端(3’ -帽)處，或可以存在于2個(gè)末端上，例如在SiNA的有義鏈的5’和3’末端處。 在某些實(shí)施方案中，提供了雙鏈短干擾核酸(SiNA)分子，其中所述分子具有有義鏈和反義鏈且包括式(A):
其中，所述上部鏈?zhǔn)撬鲭p鏈核酸分子的有義鏈，并且所述下部鏈?zhǔn)撬鲭p鏈核酸分子的反義鏈；其中所述反義鏈包括SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144、SEQ ID NO :145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO :147、SEQ ID NO :148 或 SEQ ID NO :150 的至少 15 個(gè)核苷酸，并且所述有義鏈包括與所述反義鏈具有互補(bǔ)性的序列； 每個(gè)N獨(dú)立地是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸； 每個(gè)B是存在或不存在的末端帽；
(N)代表突出端核苷酸，其各自獨(dú)立地是未修飾或化學(xué)修飾的； [N]代表其為核糖核苷酸的核苷酸； Xl和X2獨(dú)立地是0 - 4的整數(shù)； X3是17 - 36的整數(shù)； X4是11 - 35的整數(shù)；和
)(5是1 - 6的整數(shù)，條件是X4和)(5的總和是17-36。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于式(A)的雙鏈短干擾核酸(SiNA)；其中 (a) N5i4位置中的一個(gè)或多個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷
基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；
(I3)^i4位置中的一個(gè)或多個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；
(c) Nx3位置中的一個(gè)或多個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；和
(Cl)^i3位置中的一個(gè)或多個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于式(A)的雙鏈短干擾核酸(SiNA)；其中 (a) N5i4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷
酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；
(I3)N5i4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；
(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；和
(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于式(A)的雙鏈短干擾核酸(SiNA)；其中 (a) Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -0-烷基核苷酸；
(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和
(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于式(A)的雙鏈短干擾核酸(SiNA)；其中
(a)Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；
(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -0-烷基核苷酸；
(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和
(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于式(A)的雙鏈短干擾核酸(SiNA)；其中
(a)Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；
(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸；
(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和
(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈短干擾核酸(SiNA)分子；其中所述 siNA 是
其中
每個(gè)B是如

圖10中所示的反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷； A是腺苷；
Δ是2，-0-甲基-腺苷；e是2，-0-甲基-鳥(niǎo)苷；Π是2，-0-甲基-尿苷；和
核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈短干擾核酸(SiNA)分子；其中所述 siNA 是
其中
每個(gè)B是如圖10中所示的反向脫堿基帽； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷；
14J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷； A是腺苷； U是尿苷；
A是2’ -0-甲基-腺苷； S是2’-0_甲基-鳥(niǎo)苷； Π是2’ -0-甲基-尿苷；和核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈短干擾核酸(SiNA)分子；其中所述 siNA 是
其中
每個(gè)B是如圖10中所示的反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷 C是胞苷 U是尿苷
Δ是2，-0-甲基-腺苷；e是2，-0-甲基-鳥(niǎo)苷；Π是2，-0-甲基-尿苷；和
核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中所述 siNA 是
5 ‘…Bcι; AcAcUGcu.mcruGAiiuTTB — 3 ‘ ( fj"X ) (SMQ 10 NO:71)
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其中
每個(gè)B是如圖10中所示的反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷；A是腺苷； U是尿苷；
A是2’ -0-甲基-腺苷； S是2’-0_甲基-鳥(niǎo)苷； Π是2’ -0-甲基-尿苷；和核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈短干擾核酸(SiNA)分子；其中所述 siNA 是
其中
每個(gè)B是如圖10中所示的反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷； A是腺苷； U是尿苷；
Δ是2，-0-甲基-腺苷；e是2，-0-甲基-鳥(niǎo)苷；Π是2，-0-甲基-尿苷；和
核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中所述 siNA 是
其中
每個(gè)B是如圖10中所示的反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷； G是鳥(niǎo)苷； U是尿苷； C是胞苷；A是2’-ο-甲基-腺苷； S是2’-0-甲基-鳥(niǎo)苷； π是2’ -O-甲基-尿苷；和核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙鏈短干擾核酸(SiNA)分子；其中所述 siNA 是
權(quán)利要求
1. 一種包括彼此具有互補(bǔ)性的第一條鏈和第二條鏈的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子， 其中至少一條鏈包括下述的至少15個(gè)核苷酸其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸是任選化學(xué)修飾的。
2.權(quán)利要求1的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所有所述核苷酸是未修飾的。
3.權(quán)利要求1的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中至少一個(gè)核苷酸是化學(xué)修飾的核苷酸。
4.權(quán)利要求3的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾的核苷酸是2’-脫氧-2’-氟核苷酸。
5.權(quán)利要求3的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾的核苷酸是2’-脫氧核苷酸。
6.權(quán)利要求3的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述化學(xué)修飾的核苷酸是2’-0-烷基核苷酸。
7.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其包括具有有義鏈和反義鏈的式(A)其中，所述上部鏈?zhǔn)撬鲭p鏈核酸分子的有義鏈，并且所述下部鏈?zhǔn)撬鲭p鏈核酸分子的反義鏈；其中所述反義鏈包括SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144、SEQ ID NO :145、SEQ ID NO :146, SEQ ID NO 147, SEQ ID N0:148、或 SEQ ID NO :150 的至少 15 個(gè)核苷酸，并且所述有義鏈包括與所述反義鏈具有互補(bǔ)性的序列； 每個(gè)N獨(dú)立地是未修飾或化學(xué)修飾的核苷酸； 每個(gè)B是存在或不存在的末端帽；(N)代表突出端核苷酸，其各自獨(dú)立地是未修飾或化學(xué)修飾的； [N]代表其為核糖核苷酸的核苷酸； Xl和X2獨(dú)立地是0 - 4的整數(shù)； X3是17 - 36的整數(shù)； X4是11 - 35的整數(shù)；和)(5是1 - 6的整數(shù)，條件是X4和)(5的總和是17-36。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a) ^i4位置中的一個(gè)或多個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；(I3)^i4位置中的一個(gè)或多個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；(c) Nx3位置中的一個(gè)或多個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合；和(Cl)^i3位置中的一個(gè)或多個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a) N5i4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；(I3)N5i4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸；和(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸、2’ -0-烷基核苷酸、2’ -脫氧核苷酸或核糖核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a)Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -0-烷基核苷酸；(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a)Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是2’ -0-烷基核苷酸；(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子；其中(a) Nx4位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；(b)Nx4位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸；(c)Nx3位置中的每個(gè)嘧啶核苷酸獨(dú)立地是2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸；和(d)Nx3位置中的每個(gè)嘌呤核苷酸獨(dú)立地是核糖核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中X5是3。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中Xl是2，并且X2是2。
15.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中X5是3，Xl是2，并且X2是2。
16.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中)(5= 1、2或3 ;X1和X2各自 =1 或2;X3 = 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30，和 X4 = 15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
17.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中)(5= 1 ;X1和X2各自=2 ； X3 = 19，和 X4 = 18。
18.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中)(5= 2 ;X1和X2各自=2 ； X3 = 19，和 X4 = 17。
19.根據(jù)權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中)(5是3，Xl是2，X2是2，X3 是19，并且X4是16。
20.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是
21.根據(jù)權(quán)利要求20的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
22.—種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中siNA是
23.根據(jù)權(quán)利要求22的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾
24.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是i “ -ΙUc c AAnQA λΟGj^AGU UC b r r I義義其中每個(gè)B是反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷； C是胞苷； U是尿苷；Δ是2，-0-甲基-腺苷；e是2，-0-甲基-鳥(niǎo)苷；Π是2，-0-甲基-尿苷；和核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾
26.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是.JJD :...■ Li K., ... '.λ、-.7、....1.1 rZt1.Λ i.l 一 1 .bi(《j？I ^ll iC,^ IlJ -Ni ( ). "7 I )-(1 Iil f ,■"■ ,. , '··- ■ , *■■ * -. /··'..V ' " ··· *J1i、— ^ r -. --^ > L. I i^j j i. "ΙαΙ 、 ': - ·- - a^.‘其中每個(gè)B是反向脫堿基帽部分； C是2’ -脫氧-2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷；J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷； A是腺苷； U是尿苷；A是2’ -O-甲基-腺苷； S是2’-0_甲基-鳥(niǎo)苷； U是2’ -O-甲基-尿苷；和 核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
28.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是
29.根據(jù)權(quán)利要求觀的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
30.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是
31.根據(jù)權(quán)利要求30的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
32.一種雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述siNA是5 # - BG.u ΛΑΛG^rUjiiuC么U:::Cι u了TB -3 ‘ i {( % S1- 11> 1 7身其中每個(gè)B是反向脫堿基帽部分； c是2’ -脫氧_2’ -氟胞苷； u是2’ -脫氧-2’ -氟尿苷； J是2’ -脫氧腺苷； G是2’脫氧鳥(niǎo)苷； T是胸苷； G是鳥(niǎo)苷； A是腺苷；Δ是2，-0-甲基-腺苷；e是2，-0-甲基-鳥(niǎo)苷；Π是2，-0-甲基-尿苷；和核苷酸間鍵合是化學(xué)修飾或未修飾的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，其中所述核苷酸間鍵合是未修飾的。
34.一種藥物組合物，其包括在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的權(quán)利要求1、7、20、 22、24、沈、28、30或32中任一項(xiàng)的雙鏈短干擾核酸(siNA)。
35.一種藥物組合物，其包括在氣溶膠制劑中的權(quán)利要求1、7、20、22、24、沈、28、30或 32的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子。
36.一種治療患有狀況的人受試者的方法，所述狀況通過(guò)Bachl的作用或通過(guò)Bachl 作用的喪失介導(dǎo)，所述方法包括給所述受試者施用有效量的權(quán)利要求7的雙鏈短干擾核酸 (siNA)分子。
37.一種治療患有狀況的人受試者的方法，所述狀況通過(guò)Bachl的作用或通過(guò)Bachl作用的喪失介導(dǎo)，所述方法包括給所述受試者施用有效量的權(quán)利要求20、22、M、26J8、30或32的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述狀況是呼吸性疾病。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述狀況是呼吸性疾病。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述呼吸性疾病選自C0PD、囊性纖維化、哮喘、嗜酸粒細(xì)胞性咳嗽、支氣管炎、肉瘤樣病、肺纖維化、鼻炎和竇炎。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述呼吸性疾病選自C0PD、囊性纖維化、哮喘、嗜酸粒細(xì)胞性咳嗽、支氣管炎、肉瘤樣病、肺纖維化、鼻炎和竇炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于研究、診斷和治療響應(yīng)Bach1基因表達(dá)和/或活性調(diào)節(jié)和/或調(diào)節(jié)Bach1基因表達(dá)途徑的性狀、疾病和病狀的化合物、組合物和方法。具體而言，本發(fā)明涉及能夠介導(dǎo)針對(duì)Bach1基因表達(dá)的RNA干擾(RNAi)或介導(dǎo)針對(duì)Bach1基因表達(dá)的RNA干擾(RNAi)的雙鏈核酸分子，包括小核酸分子，例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNA)分子。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102439151SQ201080022135
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日
發(fā)明者沙 J., 皮克林 V., 斯特拉普斯 W. 申請(qǐng)人:默沙東公司