表達(dá)aa9家族多糖單加氧酶基因tlaa9?4的畢赤酵母工程菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種表達(dá)AA9家族多糖單加氧酶基因TLAA9?4的畢赤酵母工程菌株；該工程菌表達(dá)的糖苷水解酶TLAA9?4對(duì)內(nèi)切纖維素酶的活性具有明顯的促進(jìn)作用，混合酶比原始內(nèi)切酶N24的降解纖維素的活性提高1.3倍。TLAA9?4多糖單加氧酶發(fā)揮其活性需要供電子體(抗壞血酸或CDH)的存在，經(jīng)薄層層析(TLC)檢測(cè)產(chǎn)生多種纖維寡糖。TLAA9?4具有良好的熱穩(wěn)定性和提高纖維素酶活力的能力，可廣泛用于纖維廢料及其它工業(yè)領(lǐng)域，具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。CGMCC No.1238620160421
【專利說明】
表達(dá)AA9家族多糖單加氧酶基因 TLAA9-4的畢赤酵母工程菌株 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物工程，具體地說是一種表達(dá)是疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces 1&111^;[1108118449家族多糖單加氧酶基因1'1^^9-4的畢赤酵母工程菌株？;[(3111&口&81:01^8 GS-CT-9-4。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 多糖單加氧酶(英語:Polysaccharide monooxygenases)，又稱多糖單氧酶)是一 種專門氧化裂解糖苷鍵，并產(chǎn)生多個(gè)纖維寡糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。 這類蛋白質(zhì)在人類的產(chǎn)業(yè)上也有所應(yīng)用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質(zhì)能降解成 可用的小分子。多糖單加氧酶具有多個(gè)家族。疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus 是一種廣泛分布于堆肥中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中50°C條件 下可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶和AA9家族多糖單加氧酶。
[0003] 疏綿狀嗜熱絲孢菌產(chǎn)生的AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-4具有氧化裂解纖維素的 作用，并且對(duì)該菌株產(chǎn)生的內(nèi)切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進(jìn)作用，可使其活性提 高1.3倍。多糖單加氧酶發(fā)揮其活性需要供電子體（抗壞血酸或CDH)的存在，經(jīng)薄層層析 (TLC)檢測(cè)產(chǎn)生多種纖維寡糖。該酶在缺乏底物的情況下可以產(chǎn)生過氧化氫，并且經(jīng)飛行質(zhì) 譜鑒定該酶氧化裂解打斷纖維素長(zhǎng)鏈C1氧化也有C4氧化。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明從疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus獲得多糖單加氧酶cDNA序 列全長(zhǎng)，命名為TLAA9-4，TLAA9-4基因DNA全長(zhǎng)984bp，包括信號(hào)肽序列，起始密碼子和終止 密碼子，無內(nèi)含子，編碼306個(gè)氨基酸。具有信號(hào)肽序列（1-2 laaMAFSTVTVFVTFLAFI SIASA)及 52個(gè)0糖基化位點(diǎn)，有6個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)。將TLAA9-4編碼的氨基酸序列在國(guó)際基因庫(kù) 中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)屬于多糖單加氧酶第AA9家族。
[0005] 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pPICZaA/TLAA9_4，利用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化 Pichiapastoris GS115,在Zeocin培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，高濃度博來 霉素篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，然后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-4。該工 程菌株接種于含BMGY培養(yǎng)基中，在28°C200rpm/min搖床培養(yǎng)6d后，多糖單加氧酶的表達(dá)量 為3.02mg/ml，分子量為39kDa，TLAA9-4最適溫度為50-55°C，在60 °C下是穩(wěn)定的，處理60min 后仍有95%以上的酶活性；70°(：處理3〇1^11后仍保持71%的活性；80°(：處理3〇1^11后保持 27 %的活性;90°C處理30min活性幾乎完全喪失。
[0006] AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-4在供電子體(抗壞血酸和CDH)和銅離子存在下能將 纖維素長(zhǎng)鏈氧化裂解為不同的纖維寡糖，并且在缺乏底物的情況下可以產(chǎn)生過氧化氫，對(duì) 內(nèi)切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進(jìn)作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力 提高1.3倍。多糖單加氧酶第一個(gè)組氨酸具有重要作用，前端連有其他氨基酸會(huì)影響其活 性。不同的多糖單加氧酶氧化裂解纖維素長(zhǎng)鏈發(fā)生在不同的連鍵位置，經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定 TLAA9-4氧化裂解纖維素長(zhǎng)鏈發(fā)生在Cl和C4位置。 (四）
【附圖說明】：
[0007] 圖1 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-4的SDS-PAGE分析 [0008]泳道1:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
[0009] 泳道2:純化的AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-4
[0010] 圖2 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-4的最適溫度
[0011] 圖3 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-4對(duì)內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進(jìn)作用
[0012] 圖4 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-1氧化裂解纖維素薄層層析檢測(cè)及供電子體(抗 壞血酸)對(duì)AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-1活性的影響
[0013] 泳道1:未加抗壞血酸的多糖單加氧酶TLAA9-1(E)
[0014] 泳道2:添加抗壞血酸的多糖單加氧酶TLAA9-1(E+Vc)
[0015] 泳道3:標(biāo)準(zhǔn)纖維寡糖分子(Μ)
[0016] 圖5 ΑΑ9家族多糖單加氧酶TLAA9-1酶解產(chǎn)物飛行質(zhì)譜分析 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1:疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosusermophilum的分離鑒定 [0018] (1)標(biāo)本采集:從堆肥中采集。
[0019] (2)分離培養(yǎng):將采集標(biāo)本取0.5克放置在PDA平板上50°C培養(yǎng)3天后，進(jìn)行分離純 化。操作步驟參考Cooney and Emerson( 1964)文獻(xiàn)。
[0020] (3)鑒定：參考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文獻(xiàn)。
[0021 ]實(shí)施例2:多糖單加氧酶基因 TLAA9-4的克隆
[0022] (1)疏綿狀嗜熱絲抱菌Thermomyces lanuginosusermophilum總RNA的提?。簠⒄?Trizol試劑盒說明。
[0023] (2)cDNA第一條鏈的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0試 劑盒說明書進(jìn)行：取1~2yg總RNA，加 RNase Free ddH20至9.5yL，將RNA樣品在75 °C變性 5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分： 10mmol/L dNTP Mixture 2yL，10XRT Buffer(Mg2+)2yL，25mmol/L MgCl24yL，01igo d(T)_ Adaptor Primer lyL，RNase Inhibiter 0.5yL,AMV Reverse Transcriptase lyL(Final Volume 20yL)，將反應(yīng)液混合后，室溫下放10min，然后42°C溫育60min，再煮沸5min以滅活 反轉(zhuǎn)錄酶。加入180yL DEPC處理的ddH20,稀釋至200yL，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備 用。
[0024] (3)PCR反應(yīng)（25yL):cDNA2yL，10XBuffer 2.5yL，10mmol/L dNTP2yL，25mmol/ LMgCl22yL，上、下游引物各2yL，Taq DNA聚合酶0.5yL(5U/yL)，ddH20 12yL。反應(yīng)條件為94 ￡€5!1^11預(yù)變性;941€4〇8,56 1€4〇8,72°(：11^11，共32個(gè)循環(huán)，72°(：延伸1〇1^11，4°(：保存。
[0025] 上游引物：5 ' -AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACATGGCTTCGTGACAAAAAT-3 '
[0026] 下游引物：5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGACCGGTCCTGGCTGGTGGTGC-3 '
[0027] (4)基因克?。喝?.5μ1 PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按照TAKARA公 司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，在表面涂有氨卞青霉素（100yg/ mL)的LB平板上生長(zhǎng)過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[0028] (5)質(zhì)粒DNA的提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。
[0029] (6)序列測(cè)定:DNA雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進(jìn)行。序列 引物為M13啟動(dòng)子引物。疏綿狀嗜熱絲孢菌TLAA9-4基因cDNA全長(zhǎng)984bp，包含起始密碼子和 終止密碼子，無內(nèi)含子，編碼306個(gè)氨基酸。將此氨基酸序列在國(guó)際基因庫(kù)中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn) 屬于多糖單加氧酶第AA9家族。該序列如下：
[0030] (A)SEQ ID NO 1 的信息
[0031] (a)序列特征:*長(zhǎng)度:984堿基對(duì);*類型:核酸;*鏈型:雙鏈;*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0032] (b)分子類型：DNA
[0033] (c)假設(shè):否
[0034] ⑷反義:否
[0035] (e)最初來源:疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus
[0036] (f)序列描述：
[0037]
[0038] (B)SEQ ID NO 2的信息
[0039] (a)序列特征:*長(zhǎng)度:306氨基酸;*類型:氨基酸;*鏈型:單鏈;*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0040] (b)分子類型：蛋白質(zhì)
[0041 ] (c)序列描述：
[0042]
[0043] 2:4:1 SSYHIPGPTL LAADTGNDGG HSASSTLATV TSRRLSTPSD AMPGNSSYGA I.SPPLKP&KG. 3 0"1 FHPVCNARFR HGSTFTLTTL VAPPART*
[0044] 實(shí)施方式3:表達(dá)載體的構(gòu)建
[0045] (1)將目的基因 CDS序列進(jìn)行信號(hào)肽分析預(yù)測(cè)，去除信號(hào)肽，根據(jù)載體信息設(shè)計(jì)引 物，引入Xholl和Xbal酶切位點(diǎn)，并補(bǔ)全序列至PpiczaA載體的Kex2蛋白信號(hào)切割位點(diǎn)，反向 引物3'端去除終止密碼子并添加兩個(gè)堿基以保證序列正常翻譯至6XHis標(biāo)簽。
[0046] 上游引物：5 ' -AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACATGGCTTCGTGACAAAAAT-3 '
[0047] 下游引物：5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGACCGGTCCTGGCTGGTGGTGC-3 '
[0048] (2)疏綿狀嗜熱絲孢菌總RNA的提取:利用Trizol試劑提取。
[0049] (3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈:取2yg總RNA，加入5X反應(yīng)緩沖液4yL，10mM dNTP 2 yL，核糖核酸酶抑制劑(40 -200uAiL)0.5yL 引物 oligodT(lygAiL)lyL，反轉(zhuǎn)錄酶（10u/yL)2 yL，42 °C反應(yīng)60min，然后85 °C lOmin終止反應(yīng)，稀釋至200yL。
[0050] (4)PCR反應(yīng)（25yL):cDNA 2yL，10XBuffer 2.5yL，10mmol/L dNTP2yL，25mmol/ LMgCl22yL，上、下游引物各2yL，Taq DNA聚合酶0.5yL(5U/yL)，ddH2〇 12yL。反應(yīng)條件為94°C 5min 預(yù)變性;941€4〇8,561€4〇8,72°(：1111丨11，共32個(gè)循環(huán)，72°(：延伸1〇111丨11，4°(：保存。
[0051 ] (5)基因克?。喝?yL PCR產(chǎn)物與pMD18 - T載體進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18T/ TLAA9-4操作步驟按TAKARA公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在涂有 AMP的LB平板上生長(zhǎng)過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[0052] (6)質(zhì)粒DNA提取:堿法提取質(zhì)粒DNA。
[0053] (7)用Xholl和Xbal對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T/TLAA9-4產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，同時(shí)用Xholl 和Xbal雙酶切酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA，DNA膠回收試劑盒回收純化TLAA9-4基因及載體pPICZ aA片斷。然后進(jìn)行體外連接，獲得重組質(zhì)粒pPICZaA/TLAA9_4,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，在含Amp的LB轉(zhuǎn)化平板上挑選單菌落，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，測(cè)序確認(rèn) 重組質(zhì)粒的讀碼框正確。
[0054] 實(shí)施例4.表達(dá)多糖單加氧酶基因 TLAA9-4的酵母工程菌株的構(gòu)建及篩選
[0055] (1)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化：將重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA/TLAA9_4用限制性內(nèi)切酶 Sac I線性化。
[0056] (2)轉(zhuǎn)化：電擊轉(zhuǎn)化酵母菌株P(guān)ichia pastoris GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法 參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。
[0057] (3)篩選：用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對(duì)應(yīng)點(diǎn)種在Zeocin平板上，28°C培養(yǎng)2 - 4d，挑取 在Zeocin平板上均生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)種于高濃度博 來霉素平板上篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
[0058] 實(shí)施方式5:畢赤酵母Pichia pastoris GS115的誘導(dǎo)表達(dá)和活性檢測(cè)
[0059] (1)將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含25mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C200rpm/min搖床培養(yǎng)24h (〇D6Q(値達(dá)到1.8)，離心收集菌體，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的BMMY培養(yǎng)基中，至0D 6Q()值為1.0， 28°C200rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24h補(bǔ)充甲醇至終濃度為0.5 %，每24h取樣，室溫10，000g離心 5min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0060] (2)酶活性檢測(cè)：酶活性測(cè)定采用酶解產(chǎn)物薄層層析法，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為 lOOyL的酶液，加入200yL的0.5%磷酸膨脹纖維素，lOOyL的醋酸緩沖液(0.2mol/L、pH 5.0) 50°C反應(yīng)48h，離心后取上清3ul到層析板上，展層后噴灑顯色液，85度20min觀察結(jié)果。蛋白 含量測(cè)定采用Bradf ord法。
[0061] (3)重組多糖單加氧酶TLAA9-4的最適反應(yīng)溫度:誘導(dǎo)表達(dá)的重組多糖單加氧酶經(jīng) 過GE公司的HisTrap FF crude金屬配體親和層析柱純化帶有組氨酸標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)， 獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組多糖單加氧酶測(cè)定其性質(zhì)。在相同PH(PH = 5)不同 的溫度條件下（30°C，40°C，50°C，60°C，70°C，80°C，90°C)多糖單加氧酶反應(yīng)36h，然后分別 加入纖維素酶，50°C下反應(yīng)半小時(shí)，DNS法測(cè)量產(chǎn)生的還原糖的量。數(shù)值測(cè)量三次求平均值， 將最高的酶活力定義為100%。
[0062]實(shí)施方式6:AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-4對(duì)內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進(jìn)作用及 供電子體的作用
[0063] (1 )AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-4對(duì)內(nèi)切纖維素酶N24活性的促進(jìn)作用
[0064] 采用DNS法，多糖單加氧酶在PH = 5,溫度50°C，200RPM的條件下，設(shè)置兩組多糖單 加氧酶與纖維素反應(yīng)36h，一組加入纖維素酶，一組不加纖維素酶，50°C下反應(yīng)30min，反應(yīng) 體系為：11^^9-45(^1^，似45(^1^，20(^1^的0.5%磷酸膨脹纖維素，10(^1^的醋酸緩沖液 (0.2mol/L、pH 5.0)，加入400yL DNS試劑，煮沸10min，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。以不 加多糖單加氧酶TLAA9-4的反應(yīng)體系中的酶活性定義為100%，分別計(jì)算多糖單加氧酶 TLAA9-4、內(nèi)切纖維素酶N24以及混合酶的相對(duì)酶活性。重復(fù)三次，取平均值。
[0065] (2)供電子體(抗壞血酸)對(duì)多糖單加氧酶TLAA9-4纖維素酶活性的影響
[0066] 設(shè)置兩組反應(yīng)體系，一組加入抗壞血酸，使其終濃度為10mM，另一組不加抗壞血 酸，在多糖單加氧酶TLAA9-4最適反應(yīng)條件下測(cè)定其氧化裂解纖維素酶活性，反應(yīng)48h后，硅 膠薄層層析分析產(chǎn)物，測(cè)定活性。
[0067] 實(shí)施方式7: AA9家族多糖單加氧酶酶解產(chǎn)物飛行質(zhì)譜分析
[0068]將AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2與磷酸膨脹纖維素混合在PH = 5的醋酸安緩沖液 中，在最適溫度條件下反應(yīng)48h，取上清做飛行質(zhì)譜。AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2氧化裂 解產(chǎn)生的多糖有多種形式，主要有C1和C4氧化，還可能有C6氧化。C1氧化C6氧化C4水和產(chǎn) 物的分子量均增加16,而C4氧化分子量變化為2。飛行質(zhì)譜測(cè)的的分子量減去對(duì)應(yīng)寡糖的分 子量再減去氧化減少的碳原子的數(shù)量和結(jié)合鈉離子的數(shù)量為氧化后的產(chǎn)物分子量。
[0069] 實(shí)施方式8:表達(dá)TLAA9-4基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-4的保藏
[0070] 表達(dá)TLAA9-4基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT-TLAA9-4的保藏單位：中國(guó)微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó) 科學(xué)院微生物研究所;保藏日期：2016年4月21日；酵母工程菌株編號(hào)為:CGMCC No . 12386; 畢赤酵母工程菌株的分類命名為:巴氏畢赤酵母Pichiapastoris。
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076]
[0077
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種表達(dá)疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosusAA9家族多糖單加氧酶基因 TLAA9-4的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR方法從疏綿狀嗜熱 絲孢菌Thermomyces lanuginosus獲得熱穩(wěn)定AA9家族糖苷水解酶基因 TLAA9-4，將該基因 克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZaA，獲得表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZaA/TLAA9_4，轉(zhuǎn)化畢赤 酵母GS115,從中篩選出表達(dá)熱穩(wěn)定多糖單加氧酶基因 TLAA9-4的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-4,該糖苷水解酶TLAA9-4對(duì)內(nèi)切纖維素酶的活性具有明顯的促進(jìn)作用，并且能夠?qū)⒘姿?膨脹纖維素氧化裂解為纖維寡糖，飛行質(zhì)譜結(jié)果鑒定氧化裂解裂解纖維素長(zhǎng)鏈主既有C1氧 化也有C4氧化。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK106085892SQ201610367109
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月26日
【發(fā)明人】李多川, 耿志剛, 陳銘
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)