專(zhuān)利名稱(chēng)：人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白hel-213及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種新的人類(lèi)附睪表達(dá) 精子結(jié)合蛋白HEL-213及其編碼基因與應(yīng)用
背景技術(shù)：
本世紀(jì)人類(lèi)的發(fā)展面臨著兩個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題一方面，全球人口在急速膨脹，預(yù)計(jì)在 2050年將達(dá)到90億；另一方面，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，大約15%的夫婦存在著不育問(wèn)題，發(fā) 達(dá)國(guó)家不育癥的發(fā)病率在最近IO年飚升，歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家可高達(dá)30%，其中男性因素約占一 半。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，隨著環(huán)境污染和性傳播疾病等致病因素的增加，本世紀(jì)，不育癥將 成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大疾病。但男性不育并未引起社會(huì)和醫(yī)學(xué)界的足夠重 視，因此有關(guān)男性生殖健康的研究進(jìn)展緩慢，明顯落后于其它學(xué)科。缺少分子生物學(xué)層面診 斷與治療不育癥的有效方法。由于精子發(fā)育障礙不能自然受精，需要醫(yī)生通過(guò)做試管嬰兒 獲取后代。利用此種技術(shù)獲取后代，不僅耗費(fèi)了寶貴的時(shí)間與資金，而且存在很多影響健康 的潛在因素，失去了正常生育過(guò)程中精卵天然結(jié)合、優(yōu)勢(shì)選擇遺傳后代的機(jī)會(huì)。給家庭與社 會(huì)帶來(lái)了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 全世界人口的急劇增長(zhǎng)造成了資源耗竭和環(huán)境惡化，成為人類(lèi)健康與生存的嚴(yán)重 威脅。當(dāng)前世界人口已超過(guò)60億，據(jù)專(zhuān)家估計(jì)，中國(guó)資源環(huán)境能支撐的最大人口容量為 15-16億。目前可供人類(lèi)選擇的避孕措施還很有限，離"高效、安全、可逆"的標(biāo)準(zhǔn)還相差較 遠(yuǎn)。發(fā)展安全有效、先進(jìn)實(shí)用的避孕節(jié)育新技術(shù)、新產(chǎn)品，以滿(mǎn)足不同人群、不同層次的避孕 用藥的個(gè)性化要求是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外避孕節(jié)育技術(shù)發(fā)展的總趨勢(shì)。 附睪是精子成熟的重要器官，睪丸產(chǎn)生的精子需要通過(guò)與附睪管腔微環(huán)境相互作 用才能獲得運(yùn)動(dòng)、受精、防御和維持正常胚胎發(fā)育以及防御等生物學(xué)功能。附睪內(nèi)大約有 200余種分泌蛋白與精子相互作用，參與精子成熟過(guò)程，但是人們對(duì)這些蛋白的功能知之甚 少。與精子成熟相關(guān)的附睪蛋白的研究將有助于推動(dòng)男性生殖醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展，為男性不 育癥的診斷和治療以及開(kāi)發(fā)新型避孕藥物提供侯選分子靶標(biāo)，同時(shí)有可能對(duì)附睪環(huán)節(jié)的男 性避孕帶來(lái)新的思路和突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新的人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213。
—種人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213，它具有序列表中序列2的氨基酸序列 或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序 列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)或多肽。 本發(fā)明的人附睪分泌蛋白命名為HEL-213 ;由199個(gè)氨基酸殘基組成。HEL-213蛋 白存在有3個(gè)N糖基化位點(diǎn)，3個(gè)N-十四烷?；稽c(diǎn)和13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括1個(gè)cAMP 依賴(lài)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。 而且，分子中含有1個(gè)Microbodies C-terminal targeting signal 。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼人附睪分泌蛋白HEL-213的基因。它是下列核苷 酸序列之一 序列表中序列1的DNA序歹lj， GenBank注冊(cè)號(hào)為FJ237361 ;
編碼序列表中SEQ ID No. 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸； 與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA序列。 序列表中的SEQ ID No. l，全長(zhǎng)c DNA序列為907bp，定位于人14號(hào)染色體上，編 碼199個(gè)氨基酸，編碼蛋白為HEL-213,含有信號(hào)肽，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?00bp，是一個(gè)完整的 讀碼框。 本發(fā)明的第三方面，提供了采用基因工程技術(shù)制備具有人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋 白HEL-213活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或 轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明的第四方面，提供了與上述人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213特異性結(jié)
合的抗體，以及由此開(kāi)發(fā)的用于附睪功能異常所致的不育癥的輔助診斷。 本發(fā)明的第五方面，提供了檢測(cè)樣本中是否存在人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白
HEL-213的方法，它包括將待測(cè)樣品與分泌蛋白的特異性抗體在一定條件下共同作用，觀
察是否形成抗原抗體復(fù)合物，有抗原抗體復(fù)合物形成就提示樣品中存在分泌蛋白。 本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明蛋白和其編碼序列的用途。例如本發(fā)明蛋白可
被作為診斷不育癥的分子靶點(diǎn)，或作為有效藥物成分用于治療不育癥，或作為開(kāi)發(fā)新型避 孕藥物的靶分子，或被用于篩選促進(jìn)人類(lèi)附睪表達(dá)蛋白HEL-213活性的激動(dòng)劑，或被用于 篩選抑制人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213活性的拮抗劑，或被用于肽指紋圖譜鑒定。 根據(jù)人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213的編碼序列或其片段，可設(shè)計(jì)引物或探針用于 PCR或核酸雜交，或者用于制備基因芯片。本發(fā)明蛋白還可用于藥物組合物，以此作為有效 活性成分，用于生產(chǎn)一種對(duì)抗病原微生物感染以及腫瘤等疾病的藥物。
本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的蛋白、 核苷酸序列、構(gòu)建物或細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。 本發(fā)明的蛋白能夠在附睪內(nèi)特異性表達(dá)，定位于精子頭后部，因此可能與精卵識(shí) 別有關(guān)。因?yàn)樗且环N天然的蛋白多肽，可以預(yù)見(jiàn)可能具有較少的副作用，本發(fā)明的其他優(yōu) 點(diǎn)可從以下的詳細(xì)描述獲知。


圖1. HEL-213蛋白在人精子上的免疫熒光定位 紅色熒光顯示精子核；綠色熒光顯示HEL-213蛋白在精子上的定位； A組陽(yáng)性對(duì)照，A3顯示HEL-75蛋白結(jié)合于整個(gè)精子(文章已發(fā)表)； B組陰性對(duì)照。 C組HEL_213蛋白定位，C3.顯示HEL-213蛋白結(jié)合在精子頭后部。 比例尺5mm。 圖2 HEL-213基因組織表達(dá)圖譜 l附睪頭2附睪體3附睪尾4睪丸5心6肝7脾8腎9胃10陰性對(duì)照 圖3. HEL-213蛋白在附睪液表達(dá)的western blot結(jié)果 M -Marker ;1 :陽(yáng)性對(duì)照，HEL-75蛋白；2 :陰性對(duì)照，小鼠血清;3 :HEL_213蛋白
本發(fā)明的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的變異 形式，這些變異形式包括(但并不限于)相對(duì)于天然蛋白的氨基酸序列有若干個(gè)(通常為 1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳的1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和取代。另 外，所述缺失或插入(增加)也可發(fā)生在C末端和/或N末端(通常有20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地 為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi)的氨基酸缺失或增加)，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的 氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置換表是 本領(lǐng)域所熟知的。下列5組各自含有能相互保守置換的氨基酸；脂族甘氨酸(G)、丙氨酸 (A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I);芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);堿性精氨酸(R)、賴(lài)氨酸(K)、組氨酸(H);酸性天冬
氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，該術(shù)語(yǔ)還包括了蛋白的片段或衍生物，條件是該片段或衍生
物保留了所希望的蛋白生物活性。 本發(fā)明的核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì) 于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引 物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA文庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。 這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得 到有關(guān)序列。 本發(fā)明中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法將包含編碼本發(fā)明的蛋白的核苷
酸序列插入到載體中，這些方法包括但不限于體外重組DNA技術(shù)，體內(nèi)重組技術(shù)等。 上述載體可用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)脑撕驼婧思?xì)胞，以使其能夠表達(dá)所編碼的本
發(fā)明的蛋白，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞，或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是
高等真核細(xì)胞，如昆蟲(chóng)細(xì)胞等?？刹捎玫霓D(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法、
顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)等。 本發(fā)明的蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其他特性通過(guò) 各種方法分離和純化表達(dá)產(chǎn)物，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包 括但不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用常規(guī)的蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、聲 波破菌、超離心、分子篩層析、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種層析技術(shù) 及這些方法的結(jié)合。 本發(fā)明還包括對(duì)蛋白或其片段具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，還包括具 有免疫活性的抗體片段或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分 的抗體。 本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化
的基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生，本發(fā)明
的抗體也可以是單克隆抗體。此類(lèi)單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備。 發(fā)明人通過(guò)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于成熟精子的頭后區(qū)(圖l)，在附睪的
頭、體及睪丸，心、肝、脾、腎表達(dá)量較高，在胃組織沒(méi)有表達(dá)(圖2)。發(fā)明人在大腸桿菌中表
達(dá)了人HEL-213蛋白，用其免疫小鼠，獲得了其多抗血清。發(fā)明人用Western blot在附睪
5體部檢測(cè)到一條20KD左右條帶(圖3)。 本發(fā)明的藥物組合可根據(jù)各種需要制成各種劑型，通?？蓪⑺幬锝M合物制成可注 射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、溶液載體的固體 形式，脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中，本發(fā)明的藥物組合物可由醫(yī)師根據(jù) 患者種類(lèi)、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用， 為了提高用藥效果，本發(fā)明的蛋白也可以與其他藥物共同使用。 下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍，除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組 DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下面文獻(xiàn)中有完 整的描述例如Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版(1989);《DNA克隆》第I和第II巻 (D. N. Glover編輯，1985);《寡核苷酸合成》(M. J. Gait編輯，1984);《核酸雜交》(B. D. H謙s 和S。 J。 Higgins編輯。1984);《蛋白質(zhì)純化；原理和實(shí)踐》第2版(Spring-Verlag，N. Y.)， 以及《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》I-IV巻(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)或者，可以按照試 劑生產(chǎn)商所提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l.采用基因工程技術(shù)制備人類(lèi)附睪表達(dá)蛋白HEL-213
基因克隆及序列分析 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序篩選，獲取表達(dá)序列 標(biāo)簽(EST)，利用Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子克隆，獲得人HEL-213全長(zhǎng)cDNA。使 用 Expasy Translate too 1 (http://us. expasy.orghttp://us. expasy.org)， InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/http://www.ebi.ac.uk/Tools/) 禾口 Protein代roteinblast (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/BUVST/http: //www. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/)等預(yù)測(cè)HEL 213肽序列及假定功能。SignalP(http:〃www. cbs. dtu. dkhttp:〃www. cbs. dtu. dk) ，PSORTII和WoLFPSORT (http: 〃psort. nibb. ac. jp)等軟件分 析預(yù)測(cè)該蛋白的信號(hào)肽及胞內(nèi)定位。ProfileScan(http:〃myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/ PFSCANhttp:〃myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN)預(yù)測(cè)N端糖基化和磷酸化位點(diǎn)。
對(duì)獲得的人HEL-213全長(zhǎng)cDNA，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)HEL-213編碼區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)特 異引物FOl :5' -TTGGTACCGACGACGACGACAAG GAGACCTTTCCTCTGCTGC-3'，F(xiàn)02 :5' - GCGGCGA ATTCCAACTTAGAGCCACAAAC-3'，上下游引物兩端分別引進(jìn)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)Kpnl和EcoRI。 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫(kù)為 模板，PCR擴(kuò)增HEL-213基因片段。PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性10min， (94。C，40s ;55。C，45s ; 70°C ， 30s) 30個(gè)循環(huán)，70°C延伸lOmin， 4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并 分離回收目的片段，插入克隆載體pMD-18T中進(jìn)行測(cè)序鑒定。
重組HEL-213蛋白表達(dá)及純化 測(cè)序鑒定后HEL-213基因通過(guò)Kpnl和EcoRI位點(diǎn)克隆至表達(dá)載體pET-32b(+)中， 使其與融合標(biāo)簽閱讀框一致。重組表達(dá)載體pET32b(+)-HEL-213轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)感 受態(tài)細(xì)胞，利用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，工程菌株在ImM IPTG，32t:條件下誘導(dǎo)4h后，N端 帶有His-tag的重組蛋白通過(guò)〃 兩步鎳親和層析法〃 對(duì)重組HEL-213蛋白進(jìn)行分離純化。
6簡(jiǎn)單地說(shuō)， 〃 第一步親和層析〃 用于純化重組Trx-HEL-213融合蛋白。然后融合蛋白用重 組腸激酶裂解，釋放融合標(biāo)簽。最后，運(yùn)用〃 第二步親和層析〃 回收重組HEL-213蛋白。純 化后的重組蛋白用Bradford (Bradford 1976)法進(jìn)行定量，然后用冷凍干燥進(jìn)行保存。
實(shí)施例2.抗HEL-213多克隆抗血清的制備 用重組HEL-213蛋白免疫BALB/C小鼠制備多抗。簡(jiǎn)單地說(shuō)，每只老鼠于第1天注 射50iig重組蛋白與等量的完全福氏佐劑(CFA)。然后在第15，30和45天注射25iig重組 蛋白和等量的不完全福氏佐劑(IFA)加強(qiáng)免疫。第60天從眼球取血，分離血清后用ELASA 和western blot分析抗體的效價(jià)和特異性。ELISA分析表明抗體效價(jià)達(dá)到1 : 10000。 Westernblot顯示對(duì)重組蛋白和從人附睪液中抽取的天然HEL-213都具有良好的特異性。
實(shí)施例3.人HEL-213 mRNA組織表達(dá)譜研究 為了確定HEL-213的表達(dá)模式，采用半定量RT-PCR分析HEL-213基因在人附睪 頭、體、尾，睪丸，心，肝，脾，肺，腎，胃等組織中的表達(dá)差異。用TRIzol(Tiangen， Beijing, China)抽提總RNA， lug總RNA用20UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)和0. 3ugoligodT18 (Promega) 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后，2ul合成的cDNA利用基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20ul反應(yīng)體系含 有2ul 10XPCR buffer(with MgCl2)，2ul dNTP Mix(10mmol/L) ， lul每個(gè)引ul (25umol/ L)，lul Taq DNA聚合酶(2. 5U/ul) ， 2ulcDNA模板以及l(fā)lulddH20。 PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4。C， lOmin ;94。C， lmin ;54。C (對(duì)HEL-213)/49°C ( P-actin) 30s ;72。C ， lmin (35循環(huán));72。C延 伸7min。 e-actin的表達(dá)作為內(nèi)參。所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖電泳分析。結(jié)果顯 示，該基因的mRNA在人附睪頭、體、睪丸、心、肝、脾、腎組織均有表達(dá)，在胃組織沒(méi)有表達(dá)。
實(shí)施例4.人HEL-213蛋白在組織的免疫熒光定位 取人睪丸、附睪組織冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光染色，其中一抗為鼠抗rHEL-213多
抗(l : 400)，二抗為FITC-標(biāo)記羊抗鼠IgG(1 : 200)，細(xì)胞核用PI染色。染色后所有的
切片用80%甘油封片，然后用共聚焦顯微鏡(LeicaTCSSP2 AOBS)觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以小
鼠免疫前血清替代一抗作為陰性對(duì)照。 實(shí)施例5.人附睪蛋白提取物與Western blot 將從人附睪液中提取的總蛋白抽提物20ug，用15% SDS-PAGE分離，然后濕轉(zhuǎn)到 PVDF膜上進(jìn)行western blot。鼠抗人HEL-213多抗為一抗(1 : 5000) ， 二抗為HRP-標(biāo) 記羊抗鼠IgG(l : 500)。辣根過(guò)氧化酶的活性用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒分析 Westernblot顯示抗人HEL-213多抗對(duì)重組蛋白和從人附睪液中抽取的天然HEL-213都具 有良好的特異性。 實(shí)施例6.人HEL-213蛋白在精子的免疫熒光定位 收集精子用PBS洗滌后涂布于1%明膠包被的載玻片上，自然晾干，然后用甲醇固 定10分鐘。含有精子的載玻片用3% BSA在室溫下封閉1小時(shí)，然后添加鼠抗HEL-213多抗 (1 : 200)，4。C過(guò)夜。免疫前小鼠血清做陰性對(duì)照。用PBST(PBScontaining0. l%Tween_20) 洗滌三次，加入對(duì)應(yīng)的FITC-標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(1 : 200)。載玻片用PBST洗滌三次，然 后用80%甘油封片。用Olympus BX-52顯微鏡觀察，HEL-213蛋白結(jié)合在精子的頭后部，可 能與精卵識(shí)別有關(guān)。 實(shí)施例7. HEL-213重組蛋白的抗菌活性 運(yùn)用克隆菌落形成單位(CFU)分析抗菌活性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，過(guò)夜培養(yǎng)的E.coliXL-lblue生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期(0D600 = 0. 4-0. 5)后用10mM PBS(pH7. 4)稀釋。大約2X 106CFU/ ml細(xì)菌在與12. 5 100ug/ml的HEL-213混合，37。C培養(yǎng)。在開(kāi)始培養(yǎng)后的15， 30， 60和 120min分別在取樣。將樣品用10mMPBS(pH7. 4)做系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取lOOul涂布于 LB瓊脂平板，37t:培養(yǎng)過(guò)夜至形成單菌落。統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)，抗菌活性用細(xì)菌存活的百分?jǐn)?shù)表 示，公式為％存活=(蛋白處理后存活克隆數(shù)/未經(jīng)蛋白處理后存活的克隆數(shù))X100。 實(shí)驗(yàn)以10mMPBS(pH 7.4)代替蛋白處理細(xì)菌作為陰性對(duì)照。
實(shí)施例8 HEL-213與精子運(yùn)動(dòng)性以及體外受精的關(guān)系研究 利用HEL-213多抗封閉正常人精子，然后進(jìn)行精子運(yùn)動(dòng)性和體外受精分析。實(shí)驗(yàn) 按照vitro life標(biāo)準(zhǔn)試劑盒提供的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說(shuō)，精子先用SpermRinse-30于37°C 、 5%0)2培養(yǎng)1小時(shí)獲能。然后按照l(shuí) : 200加入鼠抗rHEL-213多抗，于37。C、6XC02培養(yǎng) 2小時(shí)進(jìn)行封閉。封閉后的精子分成兩部分， 一部分直接利用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)分析精子的運(yùn) 動(dòng)性。另一部分用G-Fert洗滌2次，并調(diào)整至終濃度為1. 0X 107cells/ml。加入lOOul精 子樣品于35mm的培養(yǎng)皿中，然后覆蓋石蠟油放入37°C、6% C02和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)待用。 經(jīng)G-MOPS處理后成熟卵母細(xì)胞加入預(yù)先準(zhǔn)備好的受精滴中，在37°C 、6% C02和飽和濕度培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察受精情況，每日記錄胚胎發(fā)育情況。以上所有實(shí)驗(yàn)同時(shí)用免疫前小鼠血清 作為陰性對(duì)照。
序列表
〈110〉李建遠(yuǎn) 〈120〉人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213及其編碼基因與應(yīng)用
〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 5 〈210>1 〈211>907 〈212>DNA 〈213>Homo sapiens 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (112) . (711) 〈400>1 agcggtgtga cctagagcag gcatggaatt ttgggtgtca ccaggtaaac agagccctca 60
gcatctg朋t 3ga朋ctg朋C3gg朋cag3 3gagattec3 ctecatctga g atg gag 117
Met Glu 1
acc ttt cct ctg ctg ctg etc age ctg ggc ctg gtt ctt gca gaa gca 165
Thr Phe Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu Val Leu Ala Glu Ala
5 10 15 tea g朋age sea atg朋g ate att朋a g朋g朋ttt sea gac g朋gag 213
Ser Glu Ser Thr Met Lys lie lie Lys Glu Glu Phe Thr Asp Glu Glu
20 25 30
80082]3tgc朋tatg￡lCEltggCElElgtggcc朋g朋CElg3CCattgag261
0083]MetGinTyrAspMetAlaLysSerGlyGinGluLysGinThrlieGlu
0084]35404550
0085]atettaEltg朋cccgatectgttagttaaa朋t3CCageetcageEltg309
0086]lieLeuMetAsnProlieLeuLeuValLysAsnThrSerLeuSerMet
0087]556065
0088]tec朋ggatgatEltgtcttecttactgttc3gaElgtttacat357
0089]SerLysAspAspMetSerSerThrLeuLeuThrPheArgSerLeuHis
0090]707580
0091]tat朋tg￡lCccc朋ggg￡i朋cElgttcgggt朋tg￡lCaaagagtgttgc405
0092]TyrAsnAspProLysGlyAsnSerSerGlyAsnAspLysGluCysCys
0093]859095
0094]朋tg￡lCEltggtctgg3gagttteag朋gCEl朋ctcgtgc453
0095]AsnAspMetThrValTrpArgLysValSerGluAlaAsnGlySerCys
0096]100105110
0097]朋gtggage朋t朋cttcatecgcagetecg朋gtgEltgcgc￡igg501
0098]LysTrpSerAsnAsnPhelieArgSerSerThrGluValMetArgArg
0099]115120125130
0100]gtcC3C￡lgggcccccagetgc朋gtttgteCElg朋tcctggcateage549
0101]ValHisArgAlaProSerCysLysPheValGinAsnProGlylieSer
0102]135140145
0103]tgctgtgagageetag朋ctgg朋朋tgtgtgcCElgttcact597
0104]CysCysGluSerLeuGluLeuGluAsnThrValCysGinPheThrThr
0105]150155160
0106]ggcc朋ttcccc￡lggtgcc朋taccatElgtgtt3CCteattagag645
0107]GlyLysGinPheProArgCysGinTyrHisSerValThrSerLeuGlu
0108]165170175
0109]朋gatettggtgctgggtcattctctgEltgagetggttagtt693
0110] 0111 ]Lyslie 180LeuThrValLeuThr 185GlyHisSerLeuMet 190SerTrpLeuVal
0112]tgtggctct朋gttgteaatcccacaga gctttaggac tagggtctta741
0113]CysGlySerLysLeu
0114]195
0115]cteaagaagg acctcttctt gttcattcttgttteaacct ttcctteate tctectcttt801
0116]agcacteteg tgaactcctg attetttettcteactggag gagtg朋3朋tcc朋朋ttg861
0117]tggateattc朋ttea朋gt tetgactgac907
0118]〈210>2
0119]〈211>199
0120]〈212>PRT0121]〈213>Homo sapiens
0122]〈400〉2
0123]MetGluThrPheProLeuLeuLeuLeuSerLeuGlyLeuValLeuAla
0124]151015
0125]GluAlaSerGluSerThrMetLyslielieLysGluGluPheThrAsp
0126]202530
0127]GluGluMetGinTyrAspMetAlaLysSerGlyGinGluLysGinThr
0128]354045
0129]lieGlulieLeuMetAsnProlieLeuLeuValLysAsnThrSerLeu
0130]505560
0131]SerMetSerLysAspAspMetSerSerThrLeuLeuThrPheArgSer
0132]65707580
0133]LeuHisTyrAsnAspProLysGlyAsnSerSerGlyAsnAspLysGlu
0134]859095
0135]CysCysAsnAspMetThrValTrpArgLysValSerGluAlaAsnGly
0136]100105110
0137]SerCysLysTrpSerAsnAsnPhelieArgSerSerThrGluValMet
0138]115120125
0139]ArgArgValHisArgAlaProSerCysLysPheValGinAsnProGly
0140]130135140
0141]lieSerCysCysGluSerLeuGluLeuGluAsnThrValCysGinPhe
0142]145150155160
0143]ThrThrGlyLysGinPheProArgCysGinTyrHisSerValThrSer
0144]165170175
0145]LeuGluLyslieLeuThrValLeuThrGlyHisSerLeuMetSerTrp
0146]180185190
0147]LeuValCysGlySerLysLeu
0148]19權(quán)利要求
一種人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213，其特征在于，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的序列2衍生的蛋白質(zhì)和通過(guò)化學(xué)方法合成的蛋白質(zhì)。
2. —種人類(lèi)附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的核苷酸序列；與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白的DNA 序列。
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的真核和原核表達(dá)載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因的細(xì)胞系。
5. 針對(duì)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)所制備的各種抗體以及以該抗體為活性成分的試劑。
6. 針對(duì)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)提供的藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的蛋 白、核苷酸序列、構(gòu)建物或細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白在不育癥診斷中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白在不育癥治療中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因在開(kāi)發(fā)新的避孕藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白在制備新的抗生素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了一種新的人附睪特異表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-213及其制備和應(yīng)用。公開(kāi)了本發(fā)明編碼HEL-213蛋白的氨基酸序列，提供攜帶編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體。該蛋白定位于成熟精子的頂體區(qū)，在附睪的頭、體及睪丸，心、肝、脾、腎表達(dá)量較高，在胃組織沒(méi)有表達(dá)。用Western blot在附睪檢測(cè)到一條20KD左右條帶。HEL-213蛋白可作為免疫性避孕藥的研發(fā)，以及男性不育癥的臨床診斷與治療的靶蛋白?；贖EL-213蛋白開(kāi)發(fā)的相應(yīng)基因或蛋白檢測(cè)方法，將廣泛用于生殖醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101724054SQ20081030516
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者李建遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:李建遠(yuǎn)