專利名稱：人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白hel-89及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的人類附睪表達(dá) 蛋白HEL-89及其編碼基因與應(yīng)用
背景技術(shù)：
本世紀(jì)人類的發(fā)展面臨著兩個(gè)嚴(yán)峻的問題一方面，全球人口在急速膨脹，預(yù)計(jì)在 2050年將達(dá)到90億；另一方面，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，大約15%的夫婦存在著不育問題，發(fā) 達(dá)國家不育癥的發(fā)病率在最近IO年飚升，歐洲發(fā)達(dá)國家可高達(dá)30%，其中男性因素約占一 半。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，隨著環(huán)境污染和性傳播疾病等致病因素的增加，本世紀(jì)，不育癥將 成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大疾病。但男性不育并未引起社會(huì)和醫(yī)學(xué)界的足夠重 視，因此有關(guān)男性生殖健康的研究進(jìn)展緩慢，明顯落后于其它學(xué)科。缺少分子生物學(xué)層面診 斷與治療不育癥的有效方法。由于精子發(fā)育障礙不能自然受精，需要醫(yī)生通過做試管嬰兒 獲取后代。利用此種技術(shù)獲取后代，不僅耗費(fèi)了寶貴的時(shí)間與資金，而且存在很多影響健康 的潛在因素，失去了正常生育過程中精卵天然結(jié)合、優(yōu)勢選擇遺傳后代的機(jī)會(huì)。給家庭與社 會(huì)帶來了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 全世界人口的急劇增長造成了資源耗竭和環(huán)境惡化，成為人類健康與生存的嚴(yán)重 威脅。當(dāng)前世界人口已超過60億，據(jù)專家估計(jì)，中國資源環(huán)境能支撐的最大人口容量為 15-16億。目前可供人類選擇的避孕措施還很有限，離"高效、安全、可逆"的標(biāo)準(zhǔn)還相差較 遠(yuǎn)。發(fā)展安全有效、先進(jìn)實(shí)用的避孕節(jié)育新技術(shù)、新產(chǎn)品，以滿足不同人群、不同層次的避孕 用藥的個(gè)性化要求是近年來國內(nèi)外避孕節(jié)育技術(shù)發(fā)展的總趨勢。 附睪是精子成熟的重要器官，睪丸產(chǎn)生的精子需要通過與附睪管腔微環(huán)境相互作 用才能獲得運(yùn)動(dòng)、受精、防御和維持正常胚胎發(fā)育以及防御等生物學(xué)功能。附睪內(nèi)大約有 200余種分泌蛋白與精子相互作用，參與精子成熟過程，但是人們對(duì)這些蛋白的功能知之甚 少。與精子成熟相關(guān)的附睪蛋白的研究將有助于推動(dòng)男性生殖醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展，為男性不 育癥的診斷和治療以及開發(fā)新型避孕藥物提供侯選分子靶標(biāo)，同時(shí)有可能對(duì)附睪環(huán)節(jié)的男 性避孕帶來新的思路和突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新的人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89。
—種人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或 將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列 2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)或多肽。 本發(fā)明的人附睪分泌蛋白命名為HEL-89，由198個(gè)氨基酸殘基組成。HEL-89蛋 白存在有1個(gè)N-十四烷?；稽c(diǎn)和8個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括1個(gè)cAMP-and cGMP依賴型蛋 白激酶磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨 酸激酶磷酸化位點(diǎn)。而且，在分子中還可以找到硫氧環(huán)蛋白結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89的基因。它 是下列核苷酸序列之一序列表中序列1的DNA序歹lj， GenBank注冊(cè)號(hào)為EU668325 ;
編碼序列表中SEQ ID No. 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸； 與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA序列。 序列表中的SEQID No. l，全長cDNA序列為948bp，定位于人13號(hào)染色體上，編碼 198個(gè)氨基酸，編碼蛋白為HEL-89，不含有信號(hào)肽，其開放閱讀框?yàn)?97bp，是一個(gè)完整的讀 碼框。 本發(fā)明的第三方面，提供了采用基因工程技術(shù)制備具有人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋 白HEL-89活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn) 導(dǎo)的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明的第四方面，提供了與上述人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89特異性結(jié)
合的抗體，以及由此開發(fā)的用于附睪功能異常所致的不育癥的輔助診斷。 本發(fā)明的第五方面，提供了檢測樣本中是否存在人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白
HEL-89的方法，它包括將待測樣品與分泌蛋白的特異性抗體在一定條件下共同作用，觀
察是否形成抗原抗體復(fù)合物，有抗原抗體復(fù)合物形成就提示樣品中存在分泌蛋白。 本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明蛋白和其編碼序列的用途。例如本發(fā)明蛋白可
被作為診斷不育癥的分子靶點(diǎn)，或作為有效藥物成分用于治療不育癥，或作為開發(fā)新型避
孕藥物的靶分子，或被用于篩選促進(jìn)人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89活性的激動(dòng)劑，或
被用于篩選抑制人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89活性的拮抗劑，或被用于肽指紋圖譜
鑒定。根據(jù)人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89的編碼序列或其片段，可設(shè)計(jì)引物或探針用
于PCR或核酸雜交，或者用于制備基因芯片。本發(fā)明蛋白還可用于藥物組合物，以此作為有
效活性成分，用于生產(chǎn)一種對(duì)抗病原微生物感染以及腫瘤等疾病的藥物。 本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的蛋白、
核苷酸序列、構(gòu)建物或細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。 本發(fā)明的蛋白能夠在附睪內(nèi)特異性表達(dá)，定位于精子頂體區(qū)域，因此可能與精卵 識(shí)別穿透明帶有關(guān)。因?yàn)樗且环N天然的蛋白多肽，可以預(yù)見可能具有較少的副作用，本發(fā) 明的其他優(yōu)點(diǎn)可從以下的詳細(xì)描述獲知。


圖1. HEL-89蛋白在人精子上的免疫熒光定位 紅色熒光顯示精子核；綠色熒光顯示HEL-89蛋白在精子上的定位； A組陽性對(duì)照，A3顯示HEL-75蛋白結(jié)合于整個(gè)精子(文章已發(fā)表)； B組陰性對(duì)照。 C組HEL_89蛋白定位，C3.顯示HEL-89蛋白結(jié)合在精子頂體區(qū)域。 比例尺5mm。 圖2HEL-89基因組織表達(dá)圖譜 1附睪頭2附睪體3附睪尾4睪丸5心6肝7脾8腎9胃10陰性對(duì)照
圖3. HEL-89蛋白在附睪液表達(dá)的western blot結(jié)果 M -Marker ;1 :陽性對(duì)照，HEL-75蛋白；2 :陰性對(duì)照，小鼠血清;3 :HEL_89蛋白
本發(fā)明的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的變異 形式，這些變異形式包括(但并不限于)相對(duì)于天然蛋白的氨基酸序列有若干個(gè)(通常為 1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳的1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和取代。另 外，所述缺失或插入(增加)也可發(fā)生在C末端和/或N末端(通常有20個(gè)以內(nèi)，較佳地 為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi)的氨基酸缺失或增加)，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的 氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置換表是 本領(lǐng)域所熟知的。下列5組各自含有能相互保守置換的氨基酸；脂族甘氨酸(G)、丙氨酸 (A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I);芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);堿性精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性天冬
氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，該術(shù)語還包括了蛋白的片段或衍生物，條件是該片段或衍生
物保留了所希望的蛋白生物活性。 本發(fā)明的核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì) 于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引 物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA文庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。 這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得 到有關(guān)序列。 本發(fā)明中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法將包含編碼本發(fā)明的蛋白的核苷
酸序列插入到載體中，這些方法包括但不限于體外重組DNA技術(shù)，體內(nèi)重組技術(shù)等。 上述載體可用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)脑撕驼婧思?xì)胞，以使其能夠表達(dá)所編碼的本
發(fā)明的蛋白，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞，或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是
高等真核細(xì)胞，如昆蟲細(xì)胞等?？刹捎玫霓D(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法、
顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)等。 本發(fā)明的蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其他特性通過 各種方法分離和純化表達(dá)產(chǎn)物，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包 括但不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用常規(guī)的蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、聲 波破菌、超離心、分子篩層析、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種層析技術(shù) 及這些方法的結(jié)合。 本發(fā)明還包括對(duì)蛋白或其片段具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，還包括具 有免疫活性的抗體片段或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分 的抗體。 本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如重組抗 體、純化的基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生， 本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。
發(fā)明人通過研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于成熟精子的頂體區(qū)(圖1)， RT-PCR結(jié) 果顯示該基因主要在附睪及睪丸表達(dá)量較高(圖2)。發(fā)明人在大腸桿菌中表達(dá)了人HEL-89 蛋白，用其免疫小鼠，獲得了其多抗血清。發(fā)明人用Western blot在附睪體部檢測到一條 20KD條帶(圖3)。
本發(fā)明的藥物組合可根據(jù)各種需要制成各種劑型，通常可將藥物組合物制成可注 射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、溶液載體的固體 形式，脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中，本發(fā)明的藥物組合物可由醫(yī)師根據(jù) 患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用， 為了提高用藥效果，本發(fā)明的蛋白也可以與其他藥物共同使用。 下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍，除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組 DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下面文獻(xiàn)中有完 整的描述例如Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版(1989);《DNA克隆》第I和第II巻 (D. N. Glover編輯，1985);《寡核苷酸合成》(M. J. Gait編輯，1984);《核酸雜交》(B. D. H謙s 和S。 J。 Higgins編輯。1984);《蛋白質(zhì)純化；原理和實(shí)踐》第2版(Spring-Verlag，N. Y.)， 以及《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》I-IV巻(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)或者，可以按照試 劑生產(chǎn)商所提供的說明書進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l.采用基因工程技術(shù)制備人類附睪表達(dá)蛋白HEL-89
基因克隆及序列分析 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫進(jìn)行大規(guī)模測序篩選，獲取表達(dá)序列標(biāo) 簽(EST)，利用Unigene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子克隆，獲得人HEL-89全長cDNA。使用E鄧asy Translate tool (http://us. expasy. orghttp://us. expasy. org)， InterProScan(http:// www. ebi.ac.uk/Tools/http://www. ebi.ac.uk/Tools/) 禾口 Protein 代 roteinblast(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/)等預(yù)測HEL-89肽序列及假定功能。SignalP (http: 〃www. cbs. dtu. dkhttp:〃www. cbs. dtu. dk) ， PS0RTII和WoLFPSORT (http: 〃psort. nibb. ac. jp)等軟件分析預(yù)測該蛋白 的信號(hào)肽及胞內(nèi)定位。ProfileScan(http:〃myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCANhttp:〃 myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN)預(yù)測N端糖基化和磷酸化位點(diǎn)。
對(duì)獲得的人HEL-89全長cDNA，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測HEL-89編碼區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異 引物FOl :5， -TTGGTACCGACGACGACGACAAG GCCTCCGGTAACGCGCG-3， ， F02 :5， -GCGGCGAATTCA TTGTGTTTGGAGAAATA-3'，上下游引物兩端分別引進(jìn)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Kpnl和EcoRI。引物 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫為模板， PCR擴(kuò)增HEL-89基因片段。PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性10min， (94。C，40s ;55。C，45s ;70。C， 30s) 30個(gè)循環(huán)，7(TC延伸10min，4t:保存。反應(yīng)結(jié)束后，1. 0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測并分離 回收目的片段，插入克隆載體pMD-18T中進(jìn)行測序鑒定。
重組HEL-89蛋白表達(dá)及純化 測序鑒定后HEL-89基因通過KpnI和EcoRI位點(diǎn)克隆至表達(dá)載體pET_32b (+)中， 使其與融合標(biāo)簽閱讀框一致。重組表達(dá)載體pET32b(+)-HEL-89轉(zhuǎn)入E. coli BL21(DE3)感 受態(tài)細(xì)胞，利用菌落PCR篩選陽性克隆，工程菌株在lmM IPTG，32t:條件下誘導(dǎo)4h后，N端 帶有His-tag的重組蛋白通過"兩步鎳親和層析法"對(duì)重組HEL-89蛋白進(jìn)行分離純化。簡 單地說，"第一步親和層析"用于純化重組Trx-HEL-89融合蛋白。然后融合蛋白用重組腸激
6酶裂解，釋放融合標(biāo)簽。最后，運(yùn)用"第二步親和層析"回收重組HEL-89蛋白。純化后的重 組蛋白用Bradford (Bradford 1976)法進(jìn)行定量，然后用冷凍干燥進(jìn)行保存。
實(shí)施例2.抗HEL-89多克隆抗血清的制備 用重組HEL-89蛋白免疫BALB/C小鼠制備多抗。簡單地說，每只老鼠于第1天注 射50iig重組蛋白與等量的完全福氏佐劑(CFA)。然后在第15，30和45天注射25iig重組 蛋白和等量的不完全福氏佐劑(IFA)加強(qiáng)免疫。第60天從眼球取血，分離血清后用ELASA 和western blot分析抗體的效價(jià)和特異性。ELISA分析表明抗體效價(jià)達(dá)到1 : 10000。 Westernblot顯示對(duì)重組蛋白和從人附睪液中抽取的天然HEL-89都具有良好的特異性。
實(shí)施例3.人HEL-89mRNA組織表達(dá)譜研究 為了確定HEL-89的表達(dá)模式，采用半定量RT-PCR分析HEL-89基因在人附睪 頭、體、尾，睪丸，心，肝，脾，肺，腎，胃等組織中的表達(dá)差異。用TRIzol(Tiangen， Beijing, China)抽提總RNA， lug總RNA用20UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)和0. 3ugoligodT18 (Promega) 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后，2ul合成的cDNA利用基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20ul反應(yīng)體系含 有2ul 10XPCR buffer(with MgCl2)，2ul dNTP Mix(10mmol/L) ， lul每個(gè)引ul (25umol/ L)，lul Taq DNA聚合酶(2. 5U/ul) ， 2ulcDNA模板以及l(fā)lulddH20。 PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4。C， lOmin ;94。C， lmin ;54。C (對(duì)HEL-89)/49°C ( P-actin) 30s ;72。C ， lmin (35循環(huán));72。C延 伸7min。 e-actin的表達(dá)作為內(nèi)參。所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖電泳分析。結(jié)果顯 示，該基因主要在附睪及睪丸組織表達(dá)量較高。
實(shí)施例4.人HEL-89蛋白在組織的免疫熒光定位 取人睪丸、附睪組織冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光染色，其中一抗為鼠抗rHEL-89多抗
(1 : 400)，二抗為FITC-標(biāo)記羊抗鼠IgG(1 : 200)，細(xì)胞核用PI染色。染色后所有的切片
用80%甘油封片，然后用共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2A0BS)觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以小鼠
免疫前血清替代一抗作為陰性對(duì)照。 實(shí)施例5.人附睪蛋白提取物與Western blot 將從人附睪液中提取的總蛋白抽提物20ug，用15% SDS-PAGE分離，然后濕轉(zhuǎn)到 PVDF膜上進(jìn)行western blot。鼠抗人HEL-89多抗為一抗(1 : 5000) ， 二抗為HRP-標(biāo)記羊 抗鼠IgG(l : 500)。辣根過氧化酶的活性用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒分析Western blot顯示抗人HEL-89多抗對(duì)重組蛋白和從人附睪液中抽取的天然HEL-89都具有良好的特 異性。 實(shí)施例6.人HEL-89蛋白在精子的免疫熒光定位 收集精子用PBS洗滌后涂布于1X明膠包被的載玻片上，自然晾干，然后用甲醇 固定10分鐘。含有精子的載玻片用3% BSA在室溫下封閉1小時(shí)，然后添加鼠抗HEL-89 多抗(1 : 200)，4。C過夜。免疫前小鼠血清做陰性對(duì)照。用PBST(PBS containing 0.1% Tween-20)洗滌三次，加入對(duì)應(yīng)的FITC-標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(1 : 200)。載玻片用PBST 洗滌三次，然后用80%甘油封片。用Olympus BX-52顯微鏡觀察，HEL-89蛋白結(jié)合在精子 頂體區(qū)域。 實(shí)施例7. HEL-89重組蛋白的抗菌活性 運(yùn)用克隆菌落形成單位(CFU)分析抗菌活性。簡單地說，過夜培養(yǎng)的E.coli XL-lblue生長到對(duì)數(shù)期(0D600 = 0. 4-0. 5)后用10mM PBS(pH 7. 4)稀釋。大約2X 106CFU/ml細(xì)菌在與12. 5 100ug/ml的HEL-89混合，37。C培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后的15，30，60and 120min分別在取樣。將樣品用10mM PBS(pH 7.4)做系列稀釋，每個(gè)稀釋度取lOOul涂布于 LB瓊脂平板，37t:培養(yǎng)過夜至形成單菌落。統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)，抗菌活性用細(xì)菌存活的百分?jǐn)?shù)表 示，公式為％存活=(蛋白處理后存活克隆數(shù)/未經(jīng)蛋白處理后存活的克隆數(shù))X100。
實(shí)驗(yàn)以10mM PBS(pH 7. 4)代替蛋白處理細(xì)菌作為陰性對(duì)照。
實(shí)施例8HEL-89與精子運(yùn)動(dòng)性以及體外受精的關(guān)系研究 利用HEL-89多抗封閉正常人精子，然后進(jìn)行精子運(yùn)動(dòng)性和體外受精分析。實(shí)驗(yàn)按 照vitro life標(biāo)準(zhǔn)試劑盒提供的方法進(jìn)行。簡單地說，精子先用SpermRinse-30于37°C、 5% C02培養(yǎng)1小時(shí)獲能。然后按照1 : 200加入鼠抗rHEL-89多抗，于37°C、6% C02培養(yǎng) 2小時(shí)進(jìn)行封閉。封閉后的精子分成兩部分， 一部分直接利用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)分析精子的運(yùn) 動(dòng)性。另一部分用G-Fert洗滌2次，并調(diào)整至終濃度為1. 0X 107cells/ml。加入100ug精 子樣品于35mm的培養(yǎng)皿中，然后覆蓋石蠟油放入37°C、6% C02和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)待用。 經(jīng)G-MOPS處理后成熟卵母細(xì)胞加入預(yù)先準(zhǔn)備好的受精滴中，在37°C 、6% C02和飽和濕度培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察受精情況，每日記錄胚胎發(fā)育情況。以上所有實(shí)驗(yàn)同時(shí)用免疫前小鼠血清 作為陰性對(duì)照。
序列表
〈110〉李建遠(yuǎn) 〈120〉人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89及其編碼基因與應(yīng)用
〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>948
〈212>DNA
〈213>Homo sapiens
〈220〉
〈221>CDS
〈222>(60). (656)
〈400〉 1 cgcgggtcca cgcgtgtgat cgtccgtgcg tctagccttt
atg gcc tec ggt aac gcg cgc ate gga aag cca
Met Ala Ser Gly Asn Ala Arg lie Gly Lys Pro
1 5 10 gcc aca gcg gtg gtt gat ggc gcc ttc aaa gag
Ala Thr Ala Val Val Asp Gly Ala Phe Lys Glu
20 25 tac aaa ggg aag tec gtg gtc etc ttt ttc tac
Tyr Lys Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr
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0117]948
0118]〈210>2
0119]〈211>198
0120]〈212>PRT
0121]〈213>Homo sapiens
0122]〈400>2
MetAlaSerGlyAsnAlaArglieGly LysProAlaProAsp PheLys151015AlaThrAlaValValAspGlyAlaPhe LysGluValLysLeu SerAsp202530TyrLysGlyLysTyrValValLeuPhe PheTyrProLeuAsp PheThr354045PheValCysProThrGlulielieAla PheSerAsnArgAla GluAsp505560PheArgLysLeuGlyCysGluValLeu GlyValSerValAsp SerGin65707580PheThrHisLeuAlaTrplieAsnThr ProArgLysGluGly GlyLeu859095GlyProLeuAsnlieProLeuLeuAla AspValThrArgArg LeuSer100105110GluAspTyrGlyValLeuLysThrAsp GluGlylieAlaTyr ArgGly115120125LeuPhelielieAspGlyLysGlyVal LeuArgGinlieThr ValAsn130135140AspLeuProValGlyArgSerValAsp GluAlaLeuArgLeu ValGin145150155160AlaPheGinTyrThrAspGluHisGly GluValCysProAla GlyTrp165170175LysProGlySerAspThrlle Lys Pro Asn Val Asp Asp Ser Lys Glu
180185190TyrPheSerLysHisAsn19權(quán)利要求
一種人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89，其特征在于，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的序列2衍生的蛋白質(zhì)和通過化學(xué)方法合成的蛋白質(zhì)。
2. —種人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的核苷酸序列；與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白的DNA 序列。
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的真核和原核表達(dá)載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因的細(xì)胞系。
5. 針對(duì)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)所制備的各種抗體以及以該抗體為活性成分的試劑。
6. 針對(duì)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)提供的藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的蛋 白、核苷酸序列、構(gòu)建物或細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白在不育癥診斷中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白在不育癥治療中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因在開發(fā)新的避孕藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白在制備新的抗生素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種新的人附睪特異表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-89及其制備和應(yīng)用。公開了本發(fā)明編碼HEL-89蛋白的氨基酸序列，提供攜帶編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體。定位于成熟精子的頂體區(qū)，RT-PCR顯示該基因主要在附睪及睪丸表達(dá)量較高。用Western blot在附睪檢測到一條20KD左右條帶。HEL-89蛋白可作為免疫性避孕藥的研發(fā)，以及男性不育癥的臨床診斷與治療的靶蛋白。基于HEL-89蛋白開發(fā)的相應(yīng)基因或蛋白檢測方法，將廣泛用于生殖醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK101724043SQ20081030514
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者李建遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:李建遠(yuǎn)