3-羥基異丁酸的生物技術(shù)制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及方法，其包括以下步驟：a）提供異丁酸，b）使異丁酸與異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶和/或異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和/或異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合接觸，c）使步驟a）的產(chǎn)物與異丁酰輔酶A脫氫酶接觸，d）使步驟b）的產(chǎn)物與甲基丙烯酰輔酶A水合酶接觸，和e）水解步驟d）的產(chǎn)物以形成3-羥基異丁酸，其中至少一種所述酶以細(xì)胞的形式使用，其相比于它的野生型，包含降低的3-羥基異丁酸脫氫酶或其變體的活性；本發(fā)明還涉及細(xì)胞，其具有至少一種選自異丁酰輔酶A合成酶/連接酶、異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、異丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶、異丁酰輔酶A脫氫酶、甲基丙烯酰輔酶A水合酶和3-羥基異丁酰輔酶A水解酶的酶，和相比于它的野生型降低的3-羥基異丁酸脫氫酶或其變體的活性，其中所述細(xì)胞此外優(yōu)選具有單加氧酶，更優(yōu)選AlkBGT型的單加氧酶或其變體；本發(fā)明進(jìn)一步涉及此類細(xì)胞用于制備3-羥基異丁酸的用途。
【專利說明】3-羥基異丁酸的生物技術(shù)制備
[0001]本發(fā)明涉及方法，其包括以下步驟:a)提供異丁酸，b)使異丁酸與異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶(Phosphotransisobutyrylase)和/或異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和/或異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合接觸，c)使步驟b)的產(chǎn)物與異丁酰輔酶A脫氫酶接觸，d)使步驟
c)的產(chǎn)物與甲基丙烯酰輔酶A水合酶接觸，和e)水解步驟d)的產(chǎn)物以形成3-羥基異丁酸，其中至少一種所述酶以細(xì)胞的形式使用，其相比于它的野生型，具有降低的3-羥基異丁酸脫氫酶或其變體的活性；本發(fā)明還涉及細(xì)胞，其具有至少一種選自異丁酰輔酶A合成酶/連接酶、異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、異丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶、異丁酰輔酶A脫氫酶、甲基丙烯酰輔酶A水合酶和3-羥基異丁酰輔酶A水解酶的酶，和相比于它的野生型降低的3-羥基異丁酸脫氫酶或其變體的活性，其中所述細(xì)胞此外優(yōu)選具有單加氧酶，更優(yōu)選AlkBGT型的烷羥化酶或其變體；本發(fā)明進(jìn)一步涉及此類細(xì)胞用于制備3-羥基異丁酸的用途。
[0002]甲基丙烯酸是最重要的工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)品之一。以它的單體甲酯形式，需要它作為聚合反應(yīng)物用于制備聚甲基丙烯酸甲酯，其對(duì)于公眾已知為商品名稱Plexiglas，并且在許多應(yīng)用領(lǐng)域中是不可或缺的。聚甲基丙烯酸酯使用的實(shí)例包括:口腔醫(yī)學(xué)，其中將它用于假體；汽車工業(yè)，其中將它用作指示儀和尾燈的玻璃；光學(xué)，尤其作為隱形眼鏡和眼鏡玻璃的材料；建筑行業(yè)，其中將 它用作聚合物混凝土和還作為雙組分粘合劑；紡織工業(yè)，作為聚丙烯纖維的組分；和在日常居家中，作為用于諸如盤和刀叉餐具的物品的材料。
[0003]甲基丙烯酸通常從化石原材料諸如油開始制備。例如，異丁烯和叔丁醇可以轉(zhuǎn)化為甲基丙烯醒，其隨后進(jìn)一步氧化為甲基丙烯酸酯(William Bauer, Jr."MethacrylicAcid and Derivatives",在 Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry 2002,ffiley-VCH, Weinheim中)。或者，甲基丙烯酸的酰胺硫酸酯/鹽，其可以從相應(yīng)的2_羥基腈開始產(chǎn)生，可以被水解來形成甲基丙烯酸。然而，使用此類方法的甲基丙烯酸的工業(yè)生產(chǎn)不僅依賴于化石原料的持續(xù)供應(yīng)，還會(huì)消耗相當(dāng)大量的侵蝕性的、環(huán)境有害的化學(xué)品。例如，通過水解甲基丙烯酸的酰胺硫酸酯/鹽生產(chǎn)I kg的甲基丙烯酸需要1.6 kg的硫酸。
[0004]為了克服作為工業(yè)合成的能源和反應(yīng)物來源的化石原材料的依賴，目前進(jìn)行了多種努力，其旨在基于可再生原材料通過生物技術(shù)產(chǎn)生工業(yè)上需要的精細(xì)化學(xué)品。在甲基丙烯酸及甲基丙烯酸甲酯的情況下，提供有關(guān)于3-羥基異丁酸的生物技術(shù)合成途徑(其可以容易地化學(xué)或酶促脫水以形成甲基丙烯酸)(William Bauer, Jr."Methacrylic Acid andDerivatives"在Ullmann’ s Encyclopedia of Industrial Chemistry 2002, ffiley-VCH,Weinheim中)?，F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)使用細(xì)菌和酵母的野生型分離群從異丁酸制備3-羥基異丁酸(Hasegawa 等，1981; Hasegawa 等，1982，WO 2007/141208 A2 和 TO 2008/119738Al) ο異丁酸唯一地用作用于通過合適的菌株例如通過裙皺假絲酵母rwgosa)制備3-羥基異丁酸的底物。上述專利申請(qǐng)WO 2007/141208 A2和WO 2008/119738 Al描述了用于從碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲醇、L-纈氨酸、L-谷氨酸、CO、合成氣體、甲烷等制備3-羥基異丁酸，以及它進(jìn)一步化學(xué)轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的遺傳修飾細(xì)胞和方法。
[0005]然而，上述的經(jīng)生物技術(shù)方法制備3-羥基異丁酸目前是不經(jīng)濟(jì)的。其中明顯的缺點(diǎn)是對(duì)于異丁酸的高原材料費(fèi)用和同時(shí)在它們轉(zhuǎn)化或使用合適的微生物過程中有時(shí)的低產(chǎn)率。
[0006]針對(duì)這一背景，本發(fā)明的目的是開發(fā)3-羥基異丁酸生物技術(shù)制備的改進(jìn)方法，其在產(chǎn)率、純度和所需資源方面優(yōu)于在現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法。
[0007]此外，本發(fā)明的目的在于開發(fā)從未取代的、尤其是不含雜原子的烷烴開始制備
3-羥基異丁酸的生物技術(shù)方法。
[0008] 此外，本發(fā)明的目的是開發(fā)從可再生原材料開始和/或在不使用或較少使用有害健康的反應(yīng)物、中間體、催化劑或副產(chǎn)物的情況下獲得3-羥基異丁酸的生物技術(shù)方法。
[0009]這些和其他目的通過本發(fā)明的主題和尤其還通過所附的獨(dú)立權(quán)利要求的主題來實(shí)現(xiàn)，其中從從屬權(quán)利要求中得到具體實(shí)施方案。
[0010]本發(fā)明的目的在第一方面通過包括以下步驟的方法實(shí)現(xiàn):
a)提供異丁酸，
b)使異丁酸與
異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶和/或 異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和/或 異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合，
c)使步驟b)的產(chǎn)物與異丁酰輔酶A脫氫酶接觸，
d)使步驟c)的產(chǎn)物與甲基丙烯酰輔酶A水合酶接觸，和
e)水解步驟d)的產(chǎn)物以形成3-羥基異丁酸，
其中以細(xì)胞的形式使用至少一種在步驟b)、c)和d)中使用的選自異丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶、異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的酶，優(yōu)選地所有的酶均以細(xì)胞的形式使用，所述酶具有相比于其野生型降低的3-羥基異丁酸脫氫酶或其變體的活性。
[0011]在第一方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，通過使異丁烷與單加氧酶，優(yōu)選烷羥化酶，更優(yōu)選AlkBGT型或其變體的一種接觸來形成異丁酸。
[0012]在第一方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，其還構(gòu)成第一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，步驟e)中的水解通過使步驟d)的產(chǎn)物與3-羥基異丁酰輔酶A水解酶接觸來實(shí)現(xiàn)。
[0013]在第一方面的第三個(gè)實(shí)施方案中，其還構(gòu)成第一個(gè)和第二個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)胞具有步驟c)中的異丁酰輔酶A脫氫酶和步驟d)中的甲基丙烯酰輔酶A水合酶，和
異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶和/或 異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和/或 異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合。
[0014]在第一方面的第四個(gè)實(shí)施方案中，其還構(gòu)成第一個(gè)至第三個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)胞還具有烷羥化酶，優(yōu)選AlkBGT型或其變體的一種。
[0015]在第一方面的第五個(gè)實(shí)施方案中，其還構(gòu)成第一個(gè)至第四個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，3-羥基異丁酸脫氫酶是XP_504911.1或其變體。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的目的通過這樣的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，所述細(xì)胞具有至少一種選自異丁酰輔酶A合成酶/連接酶、異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、異丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶、異丁酰輔酶A脫氫酶、甲基丙烯酰輔酶A水合酶和3-羥基異丁酰輔酶A水解酶的酶，和相比于它的野生型降低的3-羥基異丁酸脫氫酶或其變體的活性。
[0017]在第二方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，除了異丁酰輔酶A脫氫酶和除了甲基丙烯酰輔酶A水合酶之外，細(xì)胞具有
異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶和/或 異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和/或 異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合，
優(yōu)選還有3-羥基異丁酰CoA水解酶。
[0018]在第二方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，其還構(gòu)成第一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)胞還包含烷羥化酶，優(yōu)選AlkBGT型或其變體的一種。
[0019]在第二方面的第三個(gè)實(shí)施方案中，其還構(gòu)成第一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，
3-羥基異丁酸脫氫酶是Yali0F02607g (XP_504911)或其變體。
[0020]在第三方面中，本發(fā)明的目的通過使用權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的用于制備3-羥基異丁酸的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。
[0021]在第三方面的一個(gè)實(shí)施方案中，3-羥基異丁酸脫氫酶是XP_504911.1或其變體。
[0022]在第一、第二或第三方面的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌或低等真核細(xì)胞。
[0023]在第一、第二或第三方面的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞是選自耶羅維亞酵母屬(Jarrowia)、假絲酵母屬{Candida)、酵母屬iSaccharomyces')、裂殖酵母屬(.Schizosaccharomyces)和畢赤酵母屬iPichia)的屬的酵母細(xì)胞,并且優(yōu)選是解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia Iipolytica)。
[0024]在第四方面中，本發(fā)明的目的通過包含根據(jù)第二方面的細(xì)胞和異丁烷或異丁酸的反應(yīng)混合物來實(shí)現(xiàn)。
[0025]本發(fā)明的發(fā)明人已令人驚奇地確定了在微生物中失活的編碼鑒定為3-羥基異丁酸脫氫酶的酶的基因?qū)е?-羥基異丁酸產(chǎn)率的增加。
[0026]本發(fā)明人還已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)可以從烷反應(yīng)物尤其是異丁烷開始，通過生物技術(shù)制備3-羥基異丁酸。
[0027]實(shí)施本發(fā)明的方法首先需要準(zhǔn)備異丁酸。首先，存在使用市售的異丁酸的選擇。第二，存在使用具有合適的催化能力的分離的酶或完整的生物從其他反應(yīng)物開始制備異丁酸的選擇，例如通過培養(yǎng)天然產(chǎn)生異丁酸的生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使異丁烷或另一個(gè)合適的烷前體與合適的單加氧酶，優(yōu)選烷羥化酶(其在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中為Alk-BGT型或其變體的烷羥化酶)接觸來制備異丁酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將如本文所用的術(shù)語“烷羥化酶”理解為表示氧化還原酶，其具有氧化飽和烴，尤其異丁烷或3-羥基異丁烷的能力，以產(chǎn)生羧酸，優(yōu)選在末端碳原子上的羧酸?，F(xiàn)有技術(shù)公開了一系列合適的微生物和酶。例如，Patel 等(Journal of Applied Biochemistry, 1983, 5 (1 - 2),107 - 120)描述了 16中新的細(xì)菌菌株，其具有氧化具有C2-C4的鏈長的氣態(tài)烷烴的能力，以產(chǎn)生相應(yīng)的甲基酮、仲醇和伯醇和醛。Grant等(2011)描述了通過AlkB烷羥化酶將烷烴氧化為相應(yīng)的酸(Grant, C，Woodley, J & Baganz, F 2011, ' Whole-cell bio-oxidationof n—dodecane using th e alkane hydroxylase system of P.putida GPol expressedin E.coli', Enzyme and Microbial Technology, vol 48, n0.6-7, pp.480-486)。[0028]另一方面，存在使用合適的微生物菌株制備異丁酸的選擇，所述微生物天然地或通過遺傳修飾被賦予包括通過用合適的碳源(例如葡萄糖)補(bǔ)料生產(chǎn)異丁酸的代謝途徑。微生物的實(shí)例包括例如解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica )、裙皺假絲酵母(Candida rugosa )、法爾皮有抱漢生酵母 iHanseniaspora valbyensi51)、異常漢遜氏酵 ^iHansenula anomala)> Trichosporon aculeatum、Trichosporon fennicum.、Endomyces reessi1、Geotrichum loubier1、黃色微球 1?(#icrococcusflavus)> 藤黃色微球菌iMicrococcus luteus)^ {Micrococcus lysodeikticum)> 近平滑假絲酵母菌(Candi da parapsi 1si 51)、膜酸畢赤酵母 iPi chi a membranaefaci ens )、白球擬酵母(Torulopsi s candi da)、Cocci di oi des posadasi 1、粗球抱子菌(Cocci di oi des immi tis\大麗輪枝菌(Ver ticiIlium dahliae )、玉米赤霉(bberella zeae )、太瑞斯梭孢殼^ {Thielavia terrestris、、Metarhizium acridum、Magnaporthe oryzae.、Sordariamacrospora.、Metarhizium nisopJiae^(A jel lomyces derma ti ti dis)^毛殼菌iChaetomium g1bosum)、巴西類球抱子菌{Paracoccidioides brasiIiensis)^il球叢赤殼(Afeciria haematococca)> 四抱脈抱菌 iNeurospora嗜熱毛殼菌(Chae tomium thermophi7a? )和粗糖鏈抱霉 iNeurospora crassa )。
[0029]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過來自惡臭假單胞菌putida)飽AlkBGT系統(tǒng)或其變體的氧化還原酶AlkB氧化異丁烷來提供異丁酸。AlkB是來自惡臭假單胞菌的AlkBGT系統(tǒng)的氧化還原酶，其已知它的烷羥化酶活性。這依賴于另兩個(gè)多肽AlkG和AlkT0將AlkT表征為FAD依賴 性紅素氧還蛋白還原酶，其從NADH向AlkG轉(zhuǎn)移電子。AlkG是紅素氧還蛋白，一種含鐵的氧化還原蛋白，其功能為AlkB的直接電子供體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將如本文所用的術(shù)語“AlkBGT型的烷羥化酶”理解為表示膜結(jié)合的烷單加氧酶。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，將同一術(shù)語“AlkBGT型的烷羥化酶”理解為表示與惡臭假單胞菌Gpol的AlkB序列(數(shù)據(jù)庫代碼:CAB54050.1)具有至少75、80、85、90、92、94、96、98或99 % (優(yōu)先漸增)的序列同源性的多肽。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述術(shù)語理解為表示不依賴于細(xì)胞色素的單加氧酶。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，將術(shù)語“AlkBGT型的烷羥化酶”理解為表示不依賴于細(xì)胞色素的單加氧酶，其使用至少一種紅素氧還蛋白或同源物作為電子供體。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將該術(shù)語理解為表示與惡臭假單胞菌Gpol的AlkB的序列具有至少60、70、80、80、85、90、92、94、96、98或99 % (優(yōu)先漸增)的膜結(jié)合的、不依賴于細(xì)胞色素的烷單加氧酶，其需要至少AlkG (CAB54052.1)作為電子供體，但優(yōu)選AlkG與還原酶AlkT (CAB54063.1)的組合，其中AlkG和/或AlkT還可以是各種多肽的同源物。如本文所用的術(shù)語“序列”可以指多肽的氨基酸序列和/或其核酸編碼序列。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所用的“AlkB型的氧化還原酶”是不依賴于細(xì)胞色素的氧化還原酶，即不包括細(xì)胞色素作為輔因子的氧化還原酶。
[0030]對(duì)于該目的，存在使AlkBGT系統(tǒng)的純化組分與異丁烷接觸的選擇，尤其是AlkB。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使異丁烷與含有AlkBGT的全細(xì)胞催化劑接觸；在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，用異源AlkBGT的重組大腸桿菌菌株表達(dá)。
[0031]本發(fā)明的教導(dǎo)不僅僅可以通過使用本文描述的生物大分子的準(zhǔn)確的氨基酸或核酸序列來實(shí)現(xiàn)，還可以通過使用此類大分子的變體(其可以通過缺失、添加或取代一個(gè)或多于一個(gè)的氨基酸或核酸來獲得)來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所用的核酸序列或氨基酸序列的術(shù)語“變體”(下文中與術(shù)語“同源物”同義地且可互換使用)表示另一條核酸或氨基酸序列，其具有與對(duì)應(yīng)的原始野生型核酸或氨基酸序列70、75、80、85、90、92、94、96、98、99 %或更高百分比的同源性(此處可同義使用同一性)，其中優(yōu)選除形成催化活性中心或?qū)τ诮Y(jié)構(gòu)或折疊必需的氨基酸之外的氨基酸被取代或缺失，或后者僅被保守取代，例如谷氨酸代替天冬氨酸，或亮氨酸代替纈氨酸?，F(xiàn)有技術(shù)描述了可用于計(jì)算兩條序列同源性程度的算法，例如 Arthur Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics,第 3 版。在本發(fā)明進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸或核酸序列的變體，優(yōu)選除上述序列同源性之外，具有與野生型分子或原始分子基本上相同的酶活性。例如，有酶活性的蛋白酶多肽的變體具有與多肽酶相同或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽鍵水解的能力。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，術(shù)語“基本上相同的酶活性”表示這樣的對(duì)于野生型多肽的底物而言的活性，其明顯高于本底活性和/或與野生型多肽對(duì)于相同底物展示出的Km和/或kMt值相差少于3個(gè)、優(yōu)選2個(gè)、更優(yōu)選I個(gè)數(shù)量級(jí)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語核酸或氨基酸序列的“變體”包括核酸或氨基酸序列的至少一個(gè)活性部分/或片段。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所用的術(shù)語“活性部分”表示氨基酸序列或核酸序列，其具有少于氨基酸序列全長的序列和/或編碼少于氨基酸序列全長的序列，其中比野生型氨基酸序列長度短的氨基酸序列或編碼的氨基酸序列基本上具有與野生型多肽或其變體相同的酶活性，例如醇脫氫酶、單加氧酶或轉(zhuǎn)氨酶。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，術(shù)語核酸的“變體”包括其互補(bǔ)鏈的核酸，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下與野生型核酸結(jié)合的核酸。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，并通常依賴于探針的長度、洗滌溫度和鹽濃度。通常，更長的探針需要更高的雜交溫度 ，而更短的樣品在低的溫度下操作。雜交是否發(fā)生通常依賴于變性DNA與其環(huán)境(即低于解鏈溫度(Schmelztemperatur))中存在的互補(bǔ)鏈成環(huán)的能力。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性和相應(yīng)的條件更詳細(xì)地描述于Ausubel等1995。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所用，術(shù)語核酸的“變體”包含編碼與原始核酸相同的氨基酸序列的或在遺傳密碼簡并性的情況下該氨基酸序列的變體的任何核酸序列。
[0032]提供異丁酸后，根據(jù)本發(fā)明，使其與具有將它轉(zhuǎn)化為異丁酰CoA的能力的酶或酶系統(tǒng)接觸?？梢允巩惗∷崤c異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶的組合接觸。將如本文所用的術(shù)語“異丁酸激酶”理解為表示具有水解ATP來磷?；惗∷崮芰Φ拿?。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將如本文所用的術(shù)語“磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶”理解為表示使用輔酶A催化磷酰基化的丁酸轉(zhuǎn)化為異丁酰CoA的酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)中的合適的酶，例如:
【權(quán)利要求】
1.方法，其包括以下步驟: a)提供異丁酸， b)使異丁酸與 異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶和/或 異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和/或 異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合， c)使步驟b)的產(chǎn)物與異丁酰輔酶A脫氫酶接觸， d)使步驟c)的產(chǎn)物與甲基丙烯酰輔酶A水合酶接觸，和 e)水解步驟d)的產(chǎn)物以形成3-羥基異丁酸， 其中以細(xì)胞的形式提供至少一種在步驟b)、c)和d)中使用的選自異丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶、異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的酶，優(yōu)選地所有的酶均以細(xì)胞的形式提供，所述酶具有相比于它的野生型降低的3-羥基異丁酸脫氫酶或其變體的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過使異丁烷與單加氧酶，優(yōu)選烷羥化酶，更優(yōu)選AlkBGT型或其變體的一種接觸來形成異丁酸。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法，其中步驟d)中所述的水解通過使步驟d)的產(chǎn)物與3-羥基異丁酰輔酶A水解酶接觸來實(shí)現(xiàn)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞具有步驟c)中的異丁酰輔酶A脫氫酶和步驟d)中的甲基丙烯酰輔酶A水合酶，和 異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶和/或 異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和/或 異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞另外具有烷羥化酶，優(yōu)選AlkBGT型或其變體中的一種。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述3-羥基異丁酸脫氫酶是XP_504911.1或其變體。
7.細(xì)胞，其具有至少一種選自異丁酰輔酶A合成酶/連接酶、異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、異丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶、異丁酰輔酶A脫氫酶和甲基丙烯酰輔酶A水合酶的酶，和相比于它的野生型，降低的3-羥基異丁酸脫氫酶或其變體的活性。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中除了異丁酰輔酶A脫氫酶和除了甲基丙烯酰輔酶A水合酶之外，所述細(xì)胞具有 異丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)異丁酰酶和/或 異丁酰輔酶A合成酶/連接酶和/或 異丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合， 優(yōu)選還有3-羥基異丁酰輔酶A水解酶。
9.權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其進(jìn)一步包含烷羥化酶，優(yōu)選AlkBGT型或其變體中的一種。
10.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述3-羥基異丁酸脫氫酶是XP_504911.1或其變體。
11.權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的細(xì)胞用于制備3-羥基異丁酸的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述3-羥基異丁酸脫氫酶是XP_504911.1或其變體。
13.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的細(xì)胞或權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的用途，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞或低等真核細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1-5或13中任一項(xiàng)的方法，權(quán)利要求7-10或13中任一項(xiàng)的細(xì)胞或權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的用途，其中涉及選自耶羅維亞酵母屬(Zarr0Wa)、假絲酵母屬(6?/?t/it/a)、酵母屬裂殖酵母屬(^chizosacchaTomyces')和畢赤酵母屬{Pi chi a')的屬的酵母細(xì)胞,并且優(yōu)選涉及解脂耶羅維亞酵母(Jarrowia Iipolytica) 0
15.反應(yīng)混合物，其包含權(quán)利要求7-10或13-14中任一項(xiàng)的細(xì)胞以及異丁烷或異丁酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/52GK103958691SQ201280059674
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月5日
【發(fā)明者】T.哈斯, S.沙費(fèi)爾, M.珀特, M.維澤爾, J.C.普費(fèi)弗, C.格林, N.基爾希納, E.M.維特曼 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限公司