雙調(diào)蛋白特異性-雙螺旋寡核糖核苷酸,包含雙螺旋寡核糖核苷酸的雙螺旋寡核糖核苷酸 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與呼吸道疾病相關(guān)的基因特異性-雙鏈寡核糖核苷酸和一種包 含所述雙鏈寡核糖核苷酸的高效雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，在本發(fā)明中，該雙鏈寡核糖核 苷酸結(jié)構(gòu)包含一親水性化合物和疏水性化合物，它們通過一個簡單的共價鍵或者由連接 物-介導(dǎo)的一個共價鍵結(jié)合在雙鏈RNA (siRNA)的兩端，從而使上述雙鏈寡核糖核苷酸被有 效的傳遞到細胞內(nèi)，且該雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)通過其在水溶液中相互間的疏水作用可被 轉(zhuǎn)化成納米粒。所述雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)中的該雙鏈寡核糖核苷酸對雙調(diào)蛋白具有較好 的特異性，是一種特別好的雙調(diào)蛋白特異性-siRNA(amphiregulin_specific siRNA)，其中 雙調(diào)蛋白基因是一種與呼吸道疾病相關(guān)的基因。
[0002] 此外，本發(fā)明還涉及一種制備所述雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)的方法和一種用于預(yù)防 或治療呼吸道疾病尤其是慢性阻塞性肺疾?。–OPD)和/或特發(fā)性肺纖維變性（IPF)的藥 物組合物，該藥物組合物包括上述雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)。
【背景技術(shù)】
[0003] 在治療疾病藥物的發(fā)展中和靶標(biāo)確認中，抑制基因表達的技術(shù)是一個重要的工 具。為靶基因?qū)胍晦D(zhuǎn)基因的技術(shù)，作為抑制靶基因表達的傳統(tǒng)技術(shù)，已經(jīng)被公開，該 技術(shù)包括在啟動子的反義鏈方向?qū)朕D(zhuǎn)基因的方法（Sheehy et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.，USA, 85:8805-8808, 1988 ;Smith et al.，Nature, 334:724-726, 1988)和在啟動 子的有義鏈方向?qū)朕D(zhuǎn)基因的方法（Napoli et al.，Plant Cell，2:279-289，1990;van der Krol et al. , Plant Cell, 2:291-299, 1990 ；US Patent No. 5, 034, 323 ；US Patent No. 5, 231, 020 ；and US Patent No. 5, 283, 184) 〇
[0004]同時，最近報道了轉(zhuǎn)錄后的基因沉默或者RNA干擾（RNAi)是由一個具有20-25 個堿基對的雙鏈RNA片段的累積引起的，該雙鏈RNA是由RNA模板合成的（Hami 1 ton& Baulcumbe, Science, 286:950-952, 1999)。上述雙鏈DNA片段被命名為"短干擾核糖核 酸（在下文中用siRNA指代）"。此后，siRNA被證實是抑制各種生命有機體的基因表達 的一個重要的因素，包括哺乳動物（Fire et al.，Nature, 391:806-811，1998 ;Timmons& Fire, Nature, 395:854, 1998 ；Kennerdell&Carthew, Cell, 95:1017-1026, 1998 ；Elbashir et al., Nature, 411:494-497, 2001 ;TO 99/32619)。此外，已知雙鏈 siRNA 被細胞內(nèi) 的RISC (RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物）蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)化為單鏈RNA，然后結(jié)合到目標(biāo)mRNA上使 目標(biāo) mRNA 失活（Novina&Sharp, Nature, 430:161-164, 2004)。利用上述 siRNA 來抑制 基因表達的技術(shù)，被用來抑制靶細胞內(nèi)的靶基因的表達，和觀察由此引發(fā)的改變，也被有 利地用在致力于鑒定靶細胞內(nèi)的靶基因的功能的研宄上。特別地，抑制易傳染病毒或癌 細胞中的靶基因的功能這種方式被認為可有效的用于治療相關(guān)疾病的方法的發(fā)展。在 實驗動物上進行的體外研宄和體內(nèi)研宄結(jié)果表明，靶基因被siRNA誘導(dǎo)沉默是有可能的 (McCaffrey et al.,Nature Biotechnology, 21:639-644, 2003 ；Giladi et al., Molecular Therapy，8:769-776, 2003 ;Konishi et al.，epatology，38:842-850, 2003 ;Sen et al.，Virus Research，96:27-35, 2003 ;Yokota et al.，EMBO Reports，4:602-608, 2003; Song et a 1. , Nature Medicine，9:347-351，2003 ;McCaffrey et al.，Nature，418:38-39, 2002)。例如，國際專利公開號為WO 03/070969的專利中公開了一 種通過利用siRNA抑制Bcl2蛋白質(zhì)在癌細胞中的表達來治療癌細胞的方法，國際專利公開 號為W0 04/009769的專利中公開了一種通過利用siRNA抑制血管原性VEGF蛋白的表達來 治療癌細胞的方法。
[0005]同樣地，因為siRNA可以以序列特異性的方式互補地結(jié)合在革El mRNA上來調(diào)節(jié) 靶基因的表達，siRNA與傳統(tǒng)的抗體藥物或化學(xué)藥物（小分子藥物）相比，可以被有利 地用在非常廣范圍的應(yīng)用中。（Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 200613(4):664-670)。
[0006] siRNA具有極好的效果且可被用在廣泛范圍內(nèi)的應(yīng)用中，但為了使siRNA發(fā)展到 治療藥物中，還需要改善siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性和細胞內(nèi)的傳遞有效性，從而有效地將siRNA 傳送到它的革El細胞中（Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006Jan ;11 (1-2):67-73)〇
[0007] 為了改善siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性并解決與siRNA的先天性免疫刺激相關(guān)的問題，對 以下技術(shù)的研宄已在積極進行中：通過修改siRNA上的一些核苷酸或siRNA骨架的方法 來改善其體內(nèi)穩(wěn)定性從而使siRNA對核酸酶具有抵抗性的技術(shù)，或是利用載體比如病毒載 體、脂質(zhì)體或者納米顆粒的技術(shù)。
[0008] 包含病毒載體如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的傳送系統(tǒng)具有高轉(zhuǎn)染效能，但攜帶了免 疫原性和致瘤性的風(fēng)險。另一方面，相比于病毒載體，非病毒載體包括納米顆粒被評估具有 低細胞內(nèi)傳遞效能，但也有其優(yōu)勢，包括體內(nèi)高安全性，靶向特異性傳送，有效的攝入和包 裹RNA寡核苷酸進入細胞或組織，以及低細胞毒性和低免疫刺激性。因此，相比于病毒傳送 系統(tǒng)，這些非病毒載體被認為是一種有前景的傳送方法（Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J Clin Invest. 2007December 3 ；117 (12):3623 - 3632)〇
[0009] -種利用非病毒傳送系統(tǒng)中的納米載體的方法里，納米顆粒是用各種多聚物制成 的，比如脂質(zhì)體，一種陽離子多聚物復(fù)合物及類似物，siRNA被附載在這些納米顆粒上（即 納米載體），然后被傳送至細胞內(nèi)。上述方法中，主要用到聚合的納米顆粒，聚合微胞，陽 離子脂質(zhì)體和類似物。在它們當(dāng)中，由陽離子脂質(zhì)構(gòu)成的陽離子脂質(zhì)體與細胞中內(nèi)涵體 的陰離子脂質(zhì)相互作用使內(nèi)涵體不穩(wěn)定，從而將siRNA傳送至細胞內(nèi)（Proc. Natl. Acad. Sci. 15 ；93 (21):11493-8, 1996)〇
[0010] 此外，已知可以在siRNA過客鏈（有義鏈）的末端區(qū)域結(jié)合一個化合物或類似物 來增加siRNA的體內(nèi)效能，以改善其藥代動力學(xué)特征（Naturell ;432 (7014) : 173-8, 2004)。 在這個例子中，siRNA的穩(wěn)定性會根據(jù)結(jié)合在siRNA有義鏈（過客鏈）或反義鏈（引導(dǎo)鏈） 的末端的化合物的性質(zhì)而有所不同。例如，在陽離子化合物存在的條件下，結(jié)合了多聚化合 物如聚乙二醇（PEG)的siRNA與siRNA的陰離子磷酸基團相互作用形成一個復(fù)合物，從而 得到具有更好的siRNA穩(wěn)定性的載體（J Control Release 129 (2): 107-16, 2008)。特別地， 由多聚物復(fù)合物制成的微胞相比于其它藥物傳送系統(tǒng)比如微球或者納米顆粒，微胞體積很 小，大小分布高度一致，且自發(fā)形成。因此，這些微胞在易于把握制劑的質(zhì)量，容易確保微胞 的再現(xiàn)性方面有優(yōu)勢。
[0011] 進一步地，為了改善siRNA在細胞內(nèi)的傳送效能，一項利用siRNA配合物來確 保siRNA的穩(wěn)定性并增加siRNA的細胞膜滲透性的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來了（Korean Patent Registration No. 883471)，上述siRNA配合物是由一親水性的化合物（例如，聚乙二醇 (PEG))，該化合物是生物相容的多聚物，通過一個簡單的共價鍵或一個連接物-介導(dǎo)的共 價鍵結(jié)合到siRNA上而得到的。然而，即使經(jīng)過化學(xué)修飾并結(jié)合到聚乙二醇（PEG)上， siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性依然低且不容易被傳送至目標(biāo)器官內(nèi)。為了解決這些缺點，包含結(jié) 合在寡核糖核苷酸上的親水化合物和疏水化合物的雙鏈寡核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，尤其是雙鏈 寡核糖核苷酸如siRNA，已經(jīng)被改進了。這些結(jié)構(gòu)通過疏水化合物的疏水作用形成了被命 名為SAMiRNA(自動組裝的微胞抑制性RNA)的自動組裝的納米顆粒（see Korean Patent Registration No. 1224828)。SAMiRNA技術(shù)相比于傳統(tǒng)的傳送技術(shù)的優(yōu)勢在于能得到體積 很小的勾質(zhì)的納米顆粒。
[0012] 同時，已知雙調(diào)蛋白與上皮生長因子受體結(jié)合激活上皮生長因子受體（EGFR)通 路，與細胞的增值有關(guān)。據(jù)報道稱雙調(diào)蛋白的表達可以被雙調(diào)蛋白特異性-siRNA抑制，且 上述抑制作用展示出對特定類型的乳腺癌的治療效果（Cancer Res. 2008 ;68:225-2265)。 而且，據(jù)報道稱炎癥乳腺癌中的細胞滲入可被一種雙調(diào)蛋白特異性-shRNA抑制（J Cell Physiol. 2011226(10) :2691-2701)，當(dāng)雙調(diào)蛋白的表達被shRNA抑制時，暴露在香煙煙霧 中的大鼠的肺動脈重構(gòu)就被抑制了（Arch Biochem Biophys，l ;508(1):93_100)。已知雙調(diào) 蛋白涉及氣道平滑肌（ASM)增生和血管生成，特別地，雙調(diào)蛋白刺激了哮喘病人體內(nèi)的氣 道重構(gòu)（J Korean Med Sci 2008;23:857-863)，且雙調(diào)蛋白和由急性哮喘引發(fā)的組織重構(gòu) 中分泌過量的上皮生長因子（EGF)，均涉及哮喘病人的氣道重構(gòu)（J Alergy Clin Immunol 2009 ；124:913-920)〇
[0013] 慢性阻塞性肺疾?。ㄏ挛闹杏?C0PD"指代）是一種典型的肺疾病哮喘重疊癥，由 于它涉及不可逆的氣道阻塞，所以不同于哮喘。呼吸道疾病顯示出逐漸遞增的且不完全可 逆的氣流限制，該氣流限制與由反復(fù)感染、有害氣體的吸入或吸煙引發(fā)的肺的非正常炎癥 反應(yīng)有關(guān)（Am J Respir Crit Care Med, 163:1256-1276, 2001)。C0PD 的嚴(yán)重性已受到全 世界的重視。在1990年C0PD是排名第六的死因，但到2020年，C0PD有望成為排名第三的 死因。coro是發(fā)生率上升中的前十大死因中唯一的一種疾病。它也有望成為排名第四的 因傷住院的原因，從而使社會和經(jīng)濟負擔(dān)迅速增大（Lancet, 349:1498-1504, 1997)。慢性 肺阻塞性疾?。–0PD)是因由氣道和軟組織炎癥造成的細支氣管和軟組織病變引起的，其 特點是閉塞性支氣管炎和肺氣腫（軟組織損傷）。C0PD的實例包括慢性阻塞性支氣管炎， 慢性細支氣管炎和肺氣腫。在C0PD的病例中，嗜中性粒細胞的數(shù)量增加，分泌細胞因子如 GM-CSF，TNF-a，IL-8或MIP-2。此外，氣道發(fā)生炎癥，肌肉壁變厚，粘液分泌增加引發(fā)氣道 阻塞。當(dāng)氣道被阻塞時，肺泡將擴大并受到損傷，從而使得肺泡的二氧化碳交換氧氣的能力 遭到破壞，形成呼吸衰竭。在韓國，8%的45歲及以上的成年人患有慢性阻塞性肺疾病，但 是人們的注意力還是在肺癌上。在治療慢性非阻塞性肺疾病的傳統(tǒng)方法中，主要用到具有 抗炎活性或支氣管擴張效果的治療藥物，而用基因治療藥物對慢性非阻塞性肺疾病做基本 預(yù)防和治療是很少的。具有抗炎活性的代表性治療藥物包括糖皮質(zhì)激素，白三烯修飾物，茶 堿及類似物。在它們當(dāng)中，糖皮質(zhì)激素具有很好的效果，但由于其副作用它的服用方式是吸 入，且糖皮質(zhì)激素沒有選擇性地抑制炎癥反應(yīng)，它抑制所有的免疫反應(yīng)，因此在一些病例中 甚至抑制了必要的免疫反應(yīng)。白三烯修飾物具有很少的副作用，但效果有限，因此不能單獨 使用來控制哮喘。因為這個原因，白三烯修飾物作為輔助藥物用得最多。茶堿治療慢性非阻 塞性肺疾病的效果不是很好，且可引發(fā)副作用。因此，為了預(yù)防和治療慢性阻塞性肺疾病， 急需一種新的具有很好的療效且引發(fā)的副作用少的治療藥物。
[0014] 同時，特發(fā)性肺纖維化（下文表示為"IPF"）是這樣一種疾病，當(dāng)發(fā)生各種致使肺 硬化的改變而引發(fā)肺組織結(jié)構(gòu)的重大改變時，慢性炎性細胞滲入肺泡壁，使肺功能逐漸被 損害，導(dǎo)致死亡。目前能夠有效治療IPF的方法還未知，患有IPF的病人預(yù)后不佳，平均存 活時間為診斷后3-5年。據(jù)報道稱，在國外IPF的發(fā)生率大概是每十萬個人中有3-5個人 患有IPF。而且，已知IPF發(fā)生在50歲以上年紀(jì)的人身上，且男性發(fā)病率比女性高。
[0015]目前IPF發(fā)展的原因還沒有被明確指出，據(jù)報道稱IPF在吸煙者身上的發(fā)病率高， 抗抑郁藥，胃食管的回流引起的慢性肺吸入，金屬粉塵，木肩或者溶劑的吸入等等都是與 IPF發(fā)展有關(guān)的危險因素。然而，在大部分IPF病人中未能發(fā)現(xiàn)具有一定因果關(guān)系的因素。
[0016] 已知，當(dāng)IPF沒有得到治療時，它會持續(xù)惡化，約50 %或50%以上的IPF病人會在 診斷后的3-5年內(nèi)去世。而且，當(dāng)IPF完全發(fā)展為纖維癥后，任何治療都不能緩解它了。因 此，當(dāng)IPF在早期得到治療時，治療IPF的可能性就會高。作為IPF的治療藥物，目前已知 的類固醇和硫唑嘌呤的結(jié)合物，或環(huán)磷酰胺未顯示出特別的效果。此外，各種纖維化抑制劑 已嘗試性的用于動物試驗和少數(shù)病人身上，但未證明有顯著的效果。特別地，對于IPF晚期 病人的非肺移植的治療方法，目前還沒有被報道過。因此，急需發(fā)展一種更有效的IPF治療 藥物。
[0017][現(xiàn)有技術(shù)文獻]
[0018][專利文件]
[0019]專利文件 1:U. S. Pat. No. 5, 034, 323
[0020] 專利文件 2: U. S. Pat. No. 5, 231，020
[0021] 專利文件 3: U. S. Pat. No. 5, 283, 184
[0022] 專利文件4:韓國專利授權(quán)公報883471號
[0023] 專利文獻5:韓國公開專利第2009-0042297號
[0024][非專利文件]
[0025]非專利文件 1:Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 85:8805-8808, 1988
[0026]非專利文件 2: Smith et al.，Nature, 334:724-726, 1988
[0027]非專利文件 3:Plant Cell, 2:279-289, 1990
[0028]非專利文件 4:Plant Cell, 2:291-299, 1990

【發(fā)明內(nèi)容】

[0029] 本發(fā)明旨在解決發(fā)生在現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種能以對 雙調(diào)蛋白具有特異性的方式高效地抑制雙向蛋白基因的表達的新穎的雙鏈寡核糖核苷酸， 尤其指siRNA，一種包含所述新穎寡核糖核苷酸的雙鏈