含4’-硫代修飾的核苷酸的核糖核酸及相關(guān)方法
【專利說明】含4' -硫代修飾的核苷酸的核糖核酸及相關(guān)方法
[0001] 本申請(qǐng)依據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求2013年3月14日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?61/785,098的權(quán)益，該案的內(nèi)容通過引用并入本文中。
[0002] 背景
[0003] 本發(fā)明涉及包含4' -硫代修飾的核苷酸殘基的信使核糖核酸（mRNA)、包含這些 mRNA的組合物及其制備和使用方法。
[0004] 已經(jīng)提出使用信使RNA的基因療法作為治療多種疾病的方法。先前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)過 引入信使RNA(mRNA)作為在宿主內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的一種手段的觀點(diǎn)。Yamam〇t〇，A.等人， Eur. J. Pharm. 71:484-489 (2009) ;Debus，H.等人，J. Control Rel. 148:334-343 (2010)。 然而，成功地施用mRNA以在體內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)典型地需要對(duì)mRNA進(jìn)行包裝（如使mRNA與 聚合物或脂質(zhì)載體形成復(fù)合物）。參見例如，國際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO 2011/06810和TO 2012/170930。施用未包裝的（裸）mRNA需要將化學(xué)修飾的核苷酸并入mRNA內(nèi)以產(chǎn)生更穩(wěn) 定并且更有益的治療劑。參見例如，MKormann等人，Nature Biotech. 29:154-159(2011); K.Kariko, Molecular Therapy 16(11):1833 - 1840(2008)〇
[0005] 施用編碼能夠在體內(nèi)產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)的mRNA可以提供優(yōu)于施用編碼該治療 性蛋白質(zhì)的DNA以及直接施用該治療性蛋白質(zhì)的顯著益處。然而，盡管編碼治療性蛋白質(zhì) 的治療性mRNA的研發(fā)是藥物療法的一個(gè)頗具前景的進(jìn)步，但此類治療的效用仍受到mRNA， 特別是編碼全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的那些mRNA的體內(nèi)弱穩(wěn)定性的限制。
[0006] 明確地說，在基因替代療法中使用的mRNA的穩(wěn)定性較弱會(huì)使得體內(nèi)所編碼的治 療性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生不足或不太理想。在施用了編碼治療性蛋白質(zhì)的mRNA之后，該mRNA可 能發(fā)生降解，例如在體內(nèi)暴露于一種或多種核酸酶之后發(fā)生降解。核糖核酸酶（例如內(nèi)切 核糖核酸酶和外切核糖核酸酶）是能夠催化RNA降解成較小組分并由此使mRNA無法產(chǎn)生 治療性蛋白質(zhì)的一類核酸酶。因此，核酸酶（例如RNA酶）能夠縮短例如以合成方式制備 或重組制備的mRNA的循環(huán)半衰期。在核酸溶解降解之后，mRNA不能翻譯，并因此無法發(fā)揮 預(yù)期的治療益處，這會(huì)顯著降低mRNA基因療法的功效。
[0007] 概述
[0008] 本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的經(jīng)過修飾的mRNA，用于更穩(wěn)定、更穩(wěn)固并且持續(xù)地在體 內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。本發(fā)明部分是基于認(rèn)識(shí)到，用于在體內(nèi)產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)的mRNA的穩(wěn)定性 可以通過并入核糖部分中的4'氧被硫取代的經(jīng)過修飾的核糖核苷酸而得到進(jìn)一步提高。 盡管先前 S. Hoshika 等人（Nuc. Ac. Res. Supp. 3:209-210 (2003))和 M. Takahashi, M.等人 (Nuc. Ac. Res. 37:1353-1362(2009))已經(jīng)報(bào)導(dǎo)用硫取代核糖核苷酸的核糖部分中的4'氧， 但兩篇報(bào)導(dǎo)都涉及含4'-硫代殘基的至多15個(gè)殘基長(zhǎng)的短合成RNA區(qū)段用于RNA干擾；也 已經(jīng)報(bào)導(dǎo)包含4' -硫代修飾的核苷酸的具有19-21個(gè)殘基的短RNA用于RNA干擾（Dande 等人，J. Med. Chem. 49:1624-1634(2006))及適配體開發(fā)（長(zhǎng)度達(dá)59個(gè)殘基；Hoshika等 人，Nuc. Ac. Res. 32:3815-3825 (2004) ;Kato 等人，Nuc. Ac. Res. 33:2942-2951 (2005); Minakawa 等人，Bioorg. Med. Chem. 16:9450-9456 (2008))。然而，這些報(bào)導(dǎo)都未預(yù)測(cè)將 4' -硫代核糖核苷酸并入全長(zhǎng)mRNA( 即，編碼全長(zhǎng)功能性治療性蛋白質(zhì)并且任選地含有一 個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)的mRNA)中的作用，這種全長(zhǎng)mRNA具有比現(xiàn)有技術(shù)中所測(cè)試的任何干擾 RNA或適配體長(zhǎng)得多的長(zhǎng)度，并且不是以均一的雙鏈體狀態(tài)存在，而且呈現(xiàn)的構(gòu)象具有較大 非螺旋和/或單鏈組分。更重要的是，在本發(fā)明之前，尚不了解并入了 4'-硫代修飾的核苷 酸的mRNA是否能成功地用于在體內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。如本文（包括實(shí)施例）中所描述，本發(fā)明 人已經(jīng)成功地合成了并入一個(gè)或多個(gè)4'-硫代修飾的核苷酸（例如，4'-硫代-ATP、4'_硫 代-UTP、4' -硫代-GTP和/或4' -硫代-CTP)的全長(zhǎng)mRNA。盡管在mRNA的長(zhǎng)度方面存 在問題，但本發(fā)明人能夠合成并入了多達(dá)100%的4' -硫代-ATP、100%的4' -硫代-UTP、 100%的4'-硫代-GTP和/或100%的4'-硫代-CTP的全長(zhǎng)mRNA。如實(shí)施例中所示，此類 修飾的mRNA比未修飾的mRNA穩(wěn)定，并且意外的是，此類廣泛修飾似乎不會(huì)影響修飾的mRNA 在體內(nèi)有效翻譯的能力。
[0009] 因此，本發(fā)明提供了允許更好地控制例如mRNA的穩(wěn)定性、免疫原性及翻譯效率的 mNRA，及包含這些mRNA和任選地載體的組合物，以及使用這些mRNA和組合物在體內(nèi)誘導(dǎo)治 療性蛋白質(zhì)的表達(dá)以治療疾病和/或病癥的方法。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種具有編碼區(qū)和任選地一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū) 的mRNA分子，其中所述mRNA包含至少一個(gè)并入了 4'-硫代取代呋喃糖環(huán)的核苷酸殘基。在 一些實(shí)施方案中，提供的mRNA含有的核苷酸殘基中有至少約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%并入了 4'-硫代取代呋喃糖環(huán)。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA含有的 核苷酸殘基中100%并入了 4' -硫代取代呋喃糖環(huán)。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA含 有多達(dá)約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的4'-硫代4了？。在一些實(shí) 施方案中，提供的 mRNA 含有多達(dá)約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的4'-硫代-UTP。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA含有多達(dá)約5%、10%、15%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %或100 %的4' -硫代-GTP。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA含有多達(dá) 約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的4'-硫代-〇?。在一些實(shí)施方案 中，提供的mRNA含有本文所描述的各種4' -硫代修飾的NTP的組合。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA包含非編碼區(qū)。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA 包含多聚腺苷酸尾和/或多聚尿苷酸尾。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA包含5'帽結(jié)構(gòu)。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA另外包含至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸殘基。在一些實(shí) 施方案中，所述至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸殘基選自5-甲基-胞苷、假尿苷和2-硫代尿苷中 的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸殘基并入了 4' -硫代呋喃 糖環(huán)。在一些實(shí)施方案中，多達(dá) 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的非標(biāo) 準(zhǔn)核苷酸殘基并入了 4' -硫代呋喃糖環(huán)。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA的長(zhǎng)度是至少60個(gè)殘基。在一些實(shí)施方案中，提 供的mRNA的長(zhǎng)度是至少約70個(gè)、約80個(gè)、約90個(gè)、約100個(gè)、約150個(gè)、約200個(gè)、約300 個(gè)、約400個(gè)、約500個(gè)、約1，OOO個(gè)、約1，500個(gè)、約2, OOO個(gè)、約2, 500個(gè)、約3, OOO個(gè)、約 3, 500個(gè)、約4, 000個(gè)、約4, 500個(gè)或約5, 000個(gè)殘基。
[0014] 本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供了包含至少一個(gè)mRNA分子和載體的組合物，所述 mRNA分子具有編碼區(qū)和任選地一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)，其中所述mRNA包含至少一個(gè)并入了 4' -硫代取代呋喃糖環(huán)的核苷酸殘基。在一些實(shí)施方案中，提供的組合物包含至少一個(gè) mRNA和載體，所述mRNA具有編碼區(qū)和任選地一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)，其中所述mRNA包含至 少一個(gè)并入了 4' -硫代取代呋喃糖環(huán)的核苷酸殘基，并且所述mRNA的長(zhǎng)度是至少60個(gè)殘 基。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一個(gè)mRNA分子，所述mRNA分子具有編碼 區(qū)和任選地一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)，其中所述mRNA包含至少一個(gè)并入了 4'-硫代取代呋喃糖 環(huán)的核苷酸殘基，并且與基于聚合物的載體或脂質(zhì)納米粒子形成復(fù)合物。
[0015] 本發(fā)明另外提供在體內(nèi)產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括向受試者施用至 少一個(gè)mRNA分子，或包含此類mRNA和載體的組合物，所述mRNA分子具有編碼區(qū)和任選地 一個(gè)或多個(gè)非編碼區(qū)，其中所述mRNA包含至少一個(gè)并入了 4'-硫代取代呋喃糖環(huán)的核苷酸 殘基。本發(fā)明還提供了治療需要治療性蛋白質(zhì)的受試者的方法，所述方法包括施用至少一 個(gè)mRNA分子，或包含此類mRNA和載體的組合物，所述mRNA分子具有編碼區(qū)和任選地非編 碼區(qū)，其中所述mRNA包含至少一個(gè)并入了 4' -硫代取代呋喃糖環(huán)的核苷酸殘基。在一些 實(shí)施方案中，提供的方法中施用的mRNA是至少60個(gè)殘基長(zhǎng)度。本文所描述的各種修飾的 mRNA可以用于產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)或用于治療各種疾病、病癥或病況。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種使用本文所描述的修飾的mRNA來產(chǎn)生蛋 白質(zhì)的方法。這種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法可以用于體外無細(xì)胞系統(tǒng)、體外基于細(xì)胞的系統(tǒng)或體 內(nèi)系統(tǒng)中。在各種實(shí)施方案中，適合的mRNA包含至少一個(gè)并入了 4'-硫代取代呋喃糖環(huán)的 核苷酸殘基。在一些實(shí)施方案中，適合的mRNA包含的核苷酸殘基（例如ATP、CTP、GTP、UTP， 和 / 或非標(biāo)準(zhǔn) NTP)中有至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 并入了 4'_硫代取代呋喃糖環(huán)。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA包含多聚腺苷酸尾和/或多聚尿 苷酸尾。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA的長(zhǎng)度是至少60個(gè)殘基。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所提供的mRNA分子的用途，所述mRNA分子用于 制造能夠在體內(nèi)產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)的藥物。
[0018] 在一些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備所提供的mRNA的方法。在一 些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在體外合成所提供的mRNA的方法。在一些其 它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備（例如在體外合成）所提供的mRNA的方法，所 述mRNA包含的核苷酸殘基（例如ATP、CTP、GTP、UTP，和/或非標(biāo)準(zhǔn)NTP)中有至少約5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%并入了4'-硫代取代呋喃糖環(huán)。在一些 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備（例如在體外合成）所提供的mRNA的方法，所述 mRNA的長(zhǎng)度是至少約60個(gè)、約70個(gè)、約80個(gè)、約90個(gè)、約100個(gè)、約150個(gè)、約200個(gè)、約 300個(gè)、約400個(gè)、約500個(gè)、約1，000個(gè)、約1，500個(gè)、約2, 000個(gè)、約2, 500個(gè)、約3, 000 個(gè)、約3, 500個(gè)、約4, 000個(gè)、約4, 500個(gè)或約5, 000個(gè)殘基。
[0019] 本發(fā)明的其它目的和優(yōu)勢(shì)將部分陳述于以下說明中，并且部分將從該說明易于了 解，或者可以通過本發(fā)明的實(shí)踐來學(xué)習(xí)。借助于所附權(quán)利要求書中特別指出的要素和組合， 將認(rèn)識(shí)并獲得本發(fā)明的目的和優(yōu)勢(shì)。
[0020] 應(yīng)了解，前述大體說明和以下詳細(xì)說明都只是示例性和解釋性的，而不是對(duì)所要 求保護(hù)的發(fā)明的限制。附圖結(jié)合于本說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，示出了本發(fā)明的 若干實(shí)施方案并且結(jié)合說明一起用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明的原理。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述
[0022] 這些圖只是用于說明而非限制性目的。
[0023] 圖1顯示了示例性4' -硫代RNA堿基的分子結(jié)構(gòu)：4' -硫代-腺苷、4' -硫代-鳥 苷、4' -硫代-胞苷、4' -硫代-尿苷、4' -硫代-5-甲基-胞苷、4' -硫代-假尿苷及4' -硫 代-2-硫代尿苷。
[0024] 圖2顯示了在用修飾的FFL mRNA和未修飾的FFL mRNA轉(zhuǎn)染后，通過HEK 293T細(xì) 胞中FFL熒光素酶的產(chǎn)生進(jìn)行的熒光素酶檢測(cè)。
[0025] 圖3顯示了有關(guān)修飾的FFL mRNA和未修飾的FFL mRNA的穩(wěn)定性研究的結(jié)果。
[0026] 圖4顯示了在施用修飾的FFL mRNA和未修飾的FFL mRNA后，通過小鼠肝中FFL 熒光素酶的產(chǎn)生進(jìn)行的熒光素酶檢測(cè)。
[0027] 發(fā)明詳述
[0028] 如本文中所使用，術(shù)語"mRNA"用于指包括編碼區(qū)和任選地非編碼區(qū)的修飾和/或 未修飾的RNA。術(shù)語"編碼區(qū)"是指mRNA中可以翻譯成氨基酸鏈（即，由肽鍵連接的兩個(gè)或 更多個(gè)氨基酸）的一部分或區(qū)域。氨基酸鏈又稱為肽或多肽，其可以折疊成蛋白質(zhì)（例如， 治療性蛋白質(zhì)）。術(shù)語"非編碼區(qū)"是指mRNA中典型地不被翻譯的一部分或區(qū)域。非編碼 區(qū)典型地包括5'非翻譯區(qū)和/或3'非翻譯區(qū)，包括但不限于，多聚腺苷酸尾或多聚尿苷酸 尾。
[0029] "非標(biāo)準(zhǔn)核堿基"是除天然堿基腺嘌呤（A)、胞嘧啶（C)、鳥嘌呤（G)、胸腺嘧啶（T) 或尿嘧啶（U)外的堿基部分。非標(biāo)準(zhǔn)核堿基是特定核堿基（A、C、G、T或U)的類似物，其在 核酸雙螺旋中的堿基配對(duì)特性以及在核酸雙螺旋（包括局部RNA-DNA螺旋，如在RNA聚合 酶轉(zhuǎn)錄DNA模板期間形成的RNA-DNA螺旋）中通過DNA或RNA聚合酶并入的位點(diǎn)與先前所 列的五個(gè)核堿基之一極其類似，不過T的類似物一般也會(huì)是U的類似物，并且反之亦然。結(jié) 合術(shù)語包括但不限于"核苷"、"堿基"、"核苷酸"或"殘基"的術(shù)語使用的術(shù)語"非標(biāo)準(zhǔn)"應(yīng)與 該術(shù)語結(jié)合"核堿基"使用時(shí)相同的方式解釋。
[0030] 如本文中所使用，術(shù)語"治療性蛋白質(zhì)"包括在施用給受試者時(shí)會(huì)對(duì)受試者的健康 和幸福提供有益作用的任何蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，受試者體內(nèi)該蛋白質(zhì)的缺陷、缺乏 或異常表達(dá)引起疾病或病況。"治療性蛋白質(zhì)"還可以指并非通常存在或并非通常以足量存 在于受試者體內(nèi)以實(shí)現(xiàn)希望的治療作用的蛋白質(zhì)。
[0031] 如本文中所使用，術(shù)語"輔助脂"是指包括膽固醇在內(nèi)的任何中性或兩性離子型脂 質(zhì)材料。不希望受特定理論束縛，輔助脂可以使脂質(zhì)雙層/納米粒子內(nèi)的穩(wěn)定性、剛性和/ 或流動(dòng)性增加。
[0032] 本發(fā)明的mRNA采用了特定的化學(xué)修飾的堿基取代入信使核糖核酸分子中以在施 用給受試者后增強(qiáng)該信使核糖核酸分子的生物特性，在所述化學(xué)修飾的堿基中，核苷酸殘 基的核糖部分中的4'氧被硫置換。圖1中描繪了用于并入本發(fā)明的mRNA中的示例性4'-硫 代修飾的核苷酸殘基（顯示了含有硫代取代呋喃糖環(huán)的修飾的核苷酸殘基）。在一些實(shí)施 方案中，呋喃糖環(huán)的4'-硫代修飾改善了對(duì)外切核酸酶、內(nèi)切核酸酶和/或人血清中的其它 RNA降解酶的抗性。這種穩(wěn)定性可以使RNA的半衰期增加。因此，舉例來說，施用在呋喃糖 環(huán)中具有4'-硫代修飾的mRNA或包含此類mRNA的組合物引起細(xì)胞對(duì)具有改善的生物特性 (例如半衰期增加）的mRNA的吸收，而這又促成體內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的增加。
[0033] 在某些實(shí)施方案中，RNA中至少1 %的腺苷核苷酸殘基在呋喃糖環(huán)中具有4' -硫 代修飾。舉例來說，mRNA 中約 1-5%、5-15%、15-30%、30-50%、50-75%、75-90%、90-99% 或99-100%的腺苷可以是4' -硫代-腺苷。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，mRNA中至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的腺苷殘基是4' -硫 代-腺苷。在一些實(shí)施方案中，mRNA中約100%的腺苷殘基是4' -硫代-腺苷。
[0035] 在某些實(shí)施方案中，RNA中至少1%的鳥苷核苷酸殘基在呋喃糖環(huán)中具有4' -硫 代修飾。舉例來說，mRNA 中約 1-5%、5-15%、15-30%、30-50%、50-75%、75-90%、90-99% 或99-100%的鳥苷可以是4' -硫代-鳥苷。
[0036] 在一些實(shí)施方案中，mRNA中至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的鳥苷殘基是4' -硫 代-鳥苷。在一些實(shí)施方案中，mRNA中約100%的鳥苷殘基是4' -硫代-鳥苷。
[0037] 在某些實(shí)施方案中，RNA中至少1 %的尿苷核苷酸殘基在呋喃糖環(huán)中具有4' -硫 代修飾。舉例來說，mRNA 中約 1-5%、5-15%、15-30%、30-50%、50-75%、75-90%、90-99% 或99-100%的尿苷可以是4' -硫代尿苷。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，mRNA中至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的尿苷殘基是4' -硫 代-尿苷。在一些實(shí)施方案中，mRNA中約100%的尿苷殘基是4' -硫代-尿苷。
[0039] 在某些實(shí)施方案中，RNA中至少1 %的胞苷核苷酸殘基在呋喃糖環(huán)中具有4' -硫 代修飾。舉例來說，mRNA 中約 1-5%、5-15%、15-30%、30-50%、50-75%、75-90%、90-99% 或99-100%的胞苷可以是4' -硫代-胞苷。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，mRNA中至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、 約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的胞苷殘基是4' -硫 代-胞苷。在一些實(shí)施方案中，mRNA中約100%的胞苷殘基是4' -硫代-胞苷。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA中的每個(gè)4' -硫代修飾的核苷酸都是4' -硫 代-尿苷。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA中的每個(gè)4' -硫代修飾的核苷酸都是4' -硫 代-胞苷。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA中的每個(gè)4' -硫代修飾的核苷酸獨(dú)立地是 4' -硫代-尿苷或4' -硫代-胞苷。在一些實(shí)施方案中，提供的mRNA包含至少5、10、15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、