用于合成寡核糖核苷酸的離子標記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及寡核苷酸如寡核糖核苷酸的化學(xué)合成。在另一個方面，本發(fā)明涉及化學(xué)式(II)的化合物，用于制備這些化合物的方法，以及其在寡核苷酸如寡核糖核苷酸的化學(xué)合成中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于在溶液體系中合成寡聚物的方法，包括但不限于寡肽、寡糖和寡核苷酸，尤其是寡核糖核苷酸以及寡脫氧核糖核苷酸，以及用于本文提供的方法中的離子標記接頭。
【專利說明】用于合成寡核糖核苷酸的離子標記
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求對2012年2月23日提交的美國臨時申請?zhí)?1/602373和2011年8月23日提交的國際PCT申請?zhí)朠CT/CA2011/000950的優(yōu)先權(quán)，上述兩者的全部內(nèi)容以引用
方式結(jié)合于本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及寡核苷酸的化學(xué)合成，尤其是寡核糖核苷酸，尤其是溶液相合成(solution phase synthesis)。
【背景技術(shù)】
[0004]對于合成寡核苷酸的需求呈指數(shù)增長，這是因為基因組測序、功能基因組學(xué)、和基于PCR的檢測方法消耗大量的DNA寡核苷酸。另外，目前正在進行臨床試驗的基于新DNA和RNA的治療平臺(如反義和siRNA基因沉默策略)的潛在成功可以導(dǎo)致對于短合成DNA和RNA分子的前所未有的需求。
[0005]作為潛在療法的RNA干擾(RNAi)是治療人疾病的一種全新的方式[Manoharan, Curr.0pin.Chem.Biol.8, 570-579 (2004)]。然而，在 RNAi 技術(shù)的發(fā)展中，實現(xiàn)靶向組織和細胞遞送、體內(nèi)穩(wěn)定、和RNA的成本有效的大規(guī)模合成是顯著的瓶頸。基于主流RNAi的療法的現(xiàn)實正在迅速來臨而對于這些化合物的大規(guī)模的需求可能很快就會超過制造商的能力。因此，需要開發(fā)這樣的合成策略，其使得能夠快速、高純度和/或成本有效地大規(guī)模合成RNA寡聚物。
[0006]目前用于DNA和RNA合成的方法依靠在固體載體上逐步添加單體亞磷酸胺單兀[Caruthers, M.H.et a`l.Methods in Enzymologyl54,287-313(1987)；Alvarado-Urbina, G.et al.Science214, 270-274 (1981)]。從 3’ -端至 5，-端的鏈延伸是優(yōu)選的，其是通過將具有3’-磷(III)基團(以其活化形式)的核苷單元偶聯(lián)于另一核苷單元的自由5’-羥基來實現(xiàn)。作為固相載體，可以使用500至K)00人可控孔度玻璃(CPG，controlled pore glass)載體或有機聚合物載體,如primer聚苯乙烯載體PS200。鏈延伸開始于借助于有機酸來切割5’-O-二甲氧基三苯甲基，因而釋放親核性5'-羥基。然后，在有活化劑存在的情況下，允許將此末端親核體偶聯(lián)于受保護的核苷3' -O-亞磷酰胺單體。在RNA合成的情況下，需要2’-羥基的適當保護。在稱作‘帽化(capping)’的過程中乙?；魏挝捶磻?yīng)的5’-羥基。最常用的用于此目的的基團是乙酰酯。因此，借助于乙酸酐的‘帽化’會酯化任何未反應(yīng)的5’ -羥基并停止副產(chǎn)物的積累。然后，新產(chǎn)生的亞磷酸三酯3'，5'-鍵被氧化以提供所期望的和更加穩(wěn)定的磷酸三酯。重復(fù)上述過程直到獲得具有所期望長度和序列的寡聚物。自固體載體切割寡聚物以及從糖、磷酸酯和核堿基(nucleobase)除去保護基團，從而提供所期望的目標寡聚物，其然后通過離子交換高壓液相層析(HPLC)、離子對反相HPLC、或聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離自較短的失敗序列。然后通過質(zhì)譜分析來表征全長寡聚物。其時，可以在DNA微陣列或“基因芯片”上并行地合成大量的 DNA 寡聚物[Ramsay G., Nature Biotechnology!^, 40-44 (1998)]。
[0007]相同的迭代法(iterative method)可以應(yīng)用于在溶液中DNA和RNA寡核苷酸的合成，例如如最近由Donga等描述的，其中利用離子型可溶性載體[例如，Donga, R.A.et al., J.0rg.Chem.JX, 7907-7910 (2006) ；Donga, R.A.et al., Can.J.Chem.85, 274-282 (2007)]。離子型可溶性載體的使用便于，相對于在寡核苷酸合成循環(huán)中使用的所有其它試劑，選擇性沉淀增長的寡核苷酸。
[0008]到目前為止，已經(jīng)有許多嘗試來設(shè)計保護基團和方法，其實施為構(gòu)建高質(zhì)量寡核糖核苷酸所需要的條件[關(guān)于評論，參見Beaucage, S.L.Curr.0pin.Drug Discov.Devel.1X，203-16 (2008) ；Reese,C.B.0rganic & BiomolecularChemistry, 3851-3868 (2005)]。事實上，多年來，RNA合成一直被視為遠比DNA合成更復(fù)雜，這是因為難以發(fā)現(xiàn)相容的2’ -保護基團，其(a)提供較高的逐步偶聯(lián)產(chǎn)率，(b)在整個鏈裝配中是穩(wěn)定的，以及(c)在合成結(jié)束時可以被選擇性地除去，而沒有發(fā)生磷酸二酯鍵異構(gòu)化或降解。
[0009]最廣泛使用的2’-保護基團是2’-0_叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS) [Ogilvie1K.K.et al.Tetrahedron Lettersl5.2861-2867 (1974) I。在有氣離子存在的情況下，在RNA鏈裝配結(jié)束時，除去此保護基團。其它基于甲硅烷基醚的保護基團(描述用于核苷的保護)是三異丙基甲硅烷基(TIPS)、甲基二異丙基甲硅烷基(MDIPS)、環(huán)狀烷基甲硅烷基和其它甲娃烷基基團[Ogilvie, K.K.et al.J.0f Carbohydrates, Nucleosides, Nucleotides3, 197-227 (1976) ；Damha M.J, Ogilvie Κ.K.(1993), Oligoribonucleotidesynthesis:the silyl-phosphoramidite method.1n:Protocols for Oligonucleotidesand Analogs: Synthesis and Properties, Methods in Molecular Biology(AgrawalS, ed.) Vol.20.Totowa, NJ: The Humana Press Inc.pp.81 - 114]。其中，TIPS 保護已被描述主要用于5’ -O-單甲氧基三苯甲基N2-異丁酰基鳥苷衍生物，這是因為通過硅膠層析可以更容易地彼此 分離2’和3’ -O-TIPS異構(gòu)體[Damha M.J, OgilvieK.K.(1993), Oligoribonucleotide synthesis: the silyl-phosphoramidite method.1n:Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties, Methodsin Molecular Biology(Agrawal S, ed.) Vol.20.Totowa, NJ:The Humana Press Inc.pp.81 - 114 ；Damha, M.J.et al.Tetrahedron Letters45, 6739-6742(1992) I。相對于TIPS、TBDPS和其它體積較大的甲硅烷基醚，TBDMS基團的較小的空間體積將有利于TBDMS保護基團，相比于用于RNA合成的其它保護基團，其已得到最廣泛使用。借助于亞磷酰胺縮合程序偶聯(lián)的2’ -O-TBDMS單體已允許寡核糖核苷酸的高效合成[Ogilvie，K.K.etal.Proc.Natl.Acad.Science (USA), 85, 5764-5768 (1988) ；Usman, N.et al.J.Am.Chem.Soc.109,7845 - 7854(1987)]。
[0010]用于2’ -羥基的保護的甲硅烷基醚的潛在缺點在于，在質(zhì)子溶劑、親核性催化劑、或堿性條件的影響下，它們被廣泛承認的經(jīng)歷2’至3’異構(gòu)化的能力。例如，在有甲醇、咪唑、吡啶/水、或氨水存在的情況下，TBDMS基團從02’遷移至03’位置(反之亦然)，從而產(chǎn)生核苷02’和03’甲娃烷基區(qū)域異構(gòu)體(位置異構(gòu)體,regioisomer)的混合物[Ogilvie, K.K.and Entwistle, D.ff.Carbohydrate Res.8￡, 203-210(1981) ；0gilvie, Κ.K.(1983)Proceedings of the5th International Round Table on Nucleosides, Nucleotidesand Their Biological Applications, (Rideout, J.L.et al.eds.), Academic, London,pp.209-256) ；Damha M.J, Ogilvie Κ.K.(1993),Oligoribonucleotide synthesis: thesi Iyl-phosphoramidite method.1n:ProtocoIs for Oligonucleotides andAnalogs: Synthesis and Properties, Methods in Molecular Biology(Agrawal S,ed.)Vol.20.Totowa, NJ: The Humana Press Inc.pp.81 - 114]。
[0011]甲硅烷基異構(gòu)化是其它o-甲硅烷基醚保護基團的特征。在甲醇中，尿苷和7-去氮鳥苷的ο-TIPS衍生物也經(jīng)歷異構(gòu)化，雖然比它們的O-TBDMS對應(yīng)物更緩慢[Ogilvie, K.K.et al.J.0r Carbohydrates, Nucleosides, Nucleotides莖，197-227(1976) ；Seela, F.and Mersmann, K., Helvetica Chimica Acta, 76, 1435-1449 (1993) I。在乙醇氨水條件下，5’ -O-單甲氧基三苯甲基-N2-異丁?；?2’ -O-TIPS鳥苷經(jīng)歷異構(gòu)化以產(chǎn)生可以通過層析加以分離的2’ /3’ -TIPS區(qū)域異構(gòu)體的混合物。這提供了一種方法來將更多的不需要的3’ -異構(gòu)體轉(zhuǎn)化(回收利用)成更有用的2’ -異構(gòu)體[Damha M.J, OgilvieK.K.(1993),Oligoribonucleotide synthesis: the silyl-phosphoramidite method.1n:Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties, Methodsin Molecular Biology (Agrawal S, ed.) Vol.20.Totowa, NJ: The Humana Press Inc.pp.81 - 114]o
[0012]在干非質(zhì)子溶劑中，2’ -0-甲硅烷基基團通常并不遷移到03’。當嚴格遵守這些條件時，可以以區(qū)域異構(gòu)體純形式來制備2’ -O-甲烷硅基化核糖核苷_3’ -O-亞磷酰胺衍生物[Milecki, J.et al.Nucleosides & Nucleotides, 8, 463-474(1989) ；Scaringe, S.A.et al.Nucleic Acids Res., 18, 5433-5341 (1990) ] ? 這顯然是重要的要求，因為甚至微量3’ -O-甲硅烷基區(qū)域異構(gòu)體的存在將影響所期望的RNA序列的質(zhì)量和生物活性。
[0013]用于2’-羥基位置的許多其它保護基團已用于RNA的合成[評論于Beaucage，S.L.Curr.0pin.Drug Discov.Devel.?, 203-16(2008) ；Reese,C.B.0rganic&BiomolecularChemistry3, 3851-3868 (2005)]。已報道，利用包含2’-三異丙基甲硅氧基甲基(TOM)基團、2’ -縮醛-乙酰丙酰基基團(2’ -acetal-levulinyl)、和2’ -O- 二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)基團的單體來進行RNA合成會產(chǎn)生更高的偶聯(lián)效率，這是因為這些保護基團表現(xiàn)出比2，-TBDMS基團更低的位阻[對于比較研究，參見Lackey, J.G.et al.J.Am.Chem.Soc.131, 8496-8502(2009)]。如同TBDMS基團，利用氟化物來除去TOM保護基團。
[0014]在所有情況下，寡核糖核苷酸的合成是復(fù)雜的多步驟過程，其需要寡核苷酸鏈的裝配:通常開始自單體亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元(例如，5’ -O-二甲氧基三苯甲基-N-受保護的_2’ -O-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷_3’ -O-亞磷酰胺)，堿基不穩(wěn)定的核堿基保護基團(例如，苯甲?；?、異丁?；?、乙?；?、苯氧基乙?；⒁阴１；?的去保護，切割自載體(例如，玻璃珠或聚苯乙烯)，接著除去2’ -羥基保護基團。
[0015]寡核糖核苷酸嵌段(block)的生成是更加困難的，這是由于2’ -羥基的存在以及需要保護它，因此 此研究路線遠遠落后于DNA嵌段的研究。然而，已有一些報告，其描述了通過嵌段偶聯(lián)縮合反應(yīng)來合成RNA。Ikehara和同事利用磷酸三酯方法來偶聯(lián)RNA三聚體和四聚體，以在若干天以后產(chǎn)生30%的產(chǎn)率[Ohtsuka，E.et al.J.Am.Chem.Soc.皿，8210(1978)]。Werstiuk 和 Nielson 報道了，RNA 四聚體和 RNA 五聚體的偶聯(lián)，從而在16天以后提供產(chǎn)率為50%的所期望的九核苷酸(nonanucleotide)RNA 序列[Werstiuk, Ε.S.，NeiIson, Τ.Can.J.Chem.M，2689 (1976) ]。Van Boom 和同事，在3.5天的反應(yīng)中，縮合RNA四聚體和RNA十聚體，產(chǎn)率為58% [van Boom, J.H.et al.Trav.Chim.Pays-Bas,覽，73 (1978) ]。Ogilvie 和同事描述了 5’ -O-單甲氧基三苯甲基-2’ -O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’ -O-乙酰丙酰基核糖核苷單體的合成以及它們在十六碳尿苷酸(hexadecauridylic acid)的裝配中的應(yīng)用，其中經(jīng)由二氯亞憐酸酯(phosphodichloridite)程序[Nemer, M.J, and Ogilvie, K.K., Can.J.Chem.58, 1389-1397(1980)]。
[0016]幾乎只利用單體亞磷酰胺合成子(合成單元，synthon)來進行固相RNA合成。鑒于亞磷酰胺化學(xué)反應(yīng)的效率，非常希望將嵌段(二聚體和三聚體)亞磷酰胺用于RNA合成，因為在鏈裝配期間在每個步驟中它們將允許較長的鏈延伸，從而顯著縮短合成所需要的時間。
[0017]然而，雖然，通過允許洗去過量試劑，固體支持合成克服了純化的限制，但就規(guī)模而言它可能是非常受限制的。雖然，真實的是，以千克規(guī)模產(chǎn)生寡核苷酸的目前大規(guī)模的方法采用固相方式，但對于這種類型的制備的機械要求是非常專業(yè)和昂貴的。因此，大規(guī)模合成的理想方法是在溶液中進行。在克服這種限制的嘗試中，已開發(fā)了各種各樣的基于可溶件聚合物的載體[Gravert, D.J.，Janda, K.D.Chem.Rev.97, 489-509 (1997)]。然而，這些聚合物遭受它們自身的局限性如不良的加載、不利的原子經(jīng)濟性、以及依賴于溫度循環(huán)來溶劑化/沉淀可溶性載體。已報道一些獨特的全氟化“載體”，其共價連接于所期望的分子并因此附著于長鏈氟碳衍生的二氧化硅。通過全氟化溶劑，可以選擇性地除去它們。這是一種非常有效的方法，但需要許多專門的和昂貴的材料[Horvath，1.T.，Rabai, J.Science, 266,72-75.(1994) ；Studer, A.et al., Science, 275, 823-826, (1997)]。
[0018]因此，還期望，具有用于溶液相RNA合成的改進的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本文描述了方法,用于合成嵌段聚體(blockmer) (二聚體、三聚體、四聚體等)核糖核苷酸，通過嵌段偶聯(lián)反應(yīng)(block coupling reaction),其應(yīng)用于RNA的合成。這些結(jié)構(gòu)單元允許在RNA合成的每個偶聯(lián)階段中較長的鏈延伸，從而顯著減少在目標RNA寡聚物的合成中所需要的步驟的總數(shù)。另外，本文披露的嵌段偶聯(lián)策略產(chǎn)生粗制RNA寡聚物，其更容易分離自較短的失敗序列(failure sequence)。通過UpU、ApA、和UpUpU嵌段的合成，以及它們在寡核糖核苷酸鏈的裝配中的應(yīng)用(借助于亞磷酰胺偶聯(lián)方法)，來說明上述程序。所披露的化合物和方法有利于siRNA制造的兩個關(guān)鍵方面:速率，和目標寡聚物的純度。
[0020]在另一個方面，本文描述了方法，用于合成嵌段聚體(二聚體、三聚體、四聚體等)脫氧核糖核苷酸，通過嵌段偶聯(lián)反應(yīng)，其應(yīng)用于DNA的合成。這些結(jié)構(gòu)單元允許在DNA合成的每個偶聯(lián)階段中較長的鏈延伸，從而顯著減少在目標DNA寡聚物的合成中所需要的步驟的總數(shù)。另外，本文披露的嵌段偶聯(lián)策略產(chǎn)生粗制DNA寡聚物，其更容易分離自較短的失敗序列。
[0021]本文提供了方法,用于合成離子標記接頭(ionically tagged linker),其用于但不限于合成寡核糖核苷酸、寡脫氧核糖核苷酸、寡肽和寡糖，在有所有其它標準保護基團存在的情況下，其可以被正交(orthogonally)切割。本文提供的標記接頭組合使得可以在溶液中生長寡核苷酸，其中利用逐步迭代偶聯(lián)(stepwise iterative coupling),并采用標記的離子特性，來選擇性地沉淀在每個步驟中增長的寡核苷酸，以除去偶聯(lián)試劑和反應(yīng)物。標記接頭使得能夠在合成中的任何點從溶液除去合成的寡核苷酸，以產(chǎn)生自由3' -O-羥基、2’-TIPS受保護的寡聚物，而沒有2' -O-甲硅烷基保護基團的任何異構(gòu)化。這可以用于但不限于，將寡聚物(二聚體、三聚體、四聚體等)轉(zhuǎn)化成嵌段-亞磷酰胺。這些結(jié)構(gòu)單元使得在RNA或DNA合成的每個偶聯(lián)階段中獲得較長的鏈延伸，從而顯著減少在目標RNA或DNA寡聚物的合成所需要的步驟的總數(shù)。另外，嵌段偶聯(lián)策略產(chǎn)生粗制RNA或DNA寡聚物，其容易分離自在合成過程中產(chǎn)生的較短的、不希望的序列。還設(shè)想，在一些實施方式中，標記接頭可以用來代替標準酯保護基團，以提供溫和的切割替代選擇(alternative)以及一種方式，其用來選擇性地沉淀所期望的分子并避免使用昂貴和耗時的層析法。
[0022]在一個方面，提供了化學(xué)式(II)的化合物:
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種離子標記接頭，包含Y酮酯部分、離子部分和接頭。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭具有化學(xué)式(K)的結(jié)構(gòu):
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的離子標記接頭，其中，所述接頭是烷基、乙二醇或官能化烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子部分是咪唑鎗或鱗基團；或其中所述離子部分包含鹵化物；或其中所述離子部分包含Br—、Cl—或。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述Y酮酯部分是可借助于肼切割的。
6.一種離子標記接頭，包括光不穩(wěn)定部分、離子部分和接頭。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的離子標記接頭，其中，所述光不穩(wěn)定部分是硝基芐基衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭具有化學(xué)式(P)的結(jié)構(gòu):
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述接頭是烷基、乙二醇或官能化烷基。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子部分是咪唑鎗或鱗基團；或其中所述離子部分包含鹵化物；或其中所述離子部分包含Br—、Cl—或。
11.根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述光不穩(wěn)定部分是可通過光解切割的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭是可正交切割的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的離子標記接頭，其中，烷基是Cl至C6烷基。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭連接于寡核糖核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸的末端3'-羥基。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭在不切割其它寡核糖核苷酸保護基團的條件下是選擇性可切割的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭在不引起末端寡核糖核苷酸2, -O-甲硅烷基保護基團異構(gòu)化的條件下是可切割的。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭選自:
18.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭選自:
19.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子部分是化學(xué)式I的兩性離子鱗鹽:
20.根據(jù) 權(quán)利要求19所述的離子標記接頭，其中，所述兩性離子鱗鹽是:
21.一種化學(xué)式(II)的化合物:
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的化合物，其中，η是1、2、或3。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的化合物，其中，R3是
24.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的化合物，其中
R3 是
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物，其中，R是異丙基。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的化合物，其中，所述N-保護基團選自乙酰丙酰基、乙酰基、二氟乙?；?、三氟乙?；?、異丁?；⒈郊柞；?、9-芴基甲氧基羰基、苯氧基乙?；⒍谆纂?、和N，N- 二苯基氨基甲酸酯。
27.根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項所述的化合物，其中，R3被權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭取代。
28.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的化合物，其中，R3是
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的化合物，其中，R3被權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭取代。
30.根據(jù)權(quán)利要求21至29中任一項所述的化合物，其中，所述保護基團是乙酰丙酰基基團(Lev)。
31.根據(jù)權(quán)利要求21至30中任一項所述的化合物，其中，所述保護基團是權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭。
32.根據(jù)權(quán)利要求21至31中任一項所述的化合物，其中，所述離子標記接頭包含Y酮酯部分。
33.根據(jù)權(quán)利要求21至31中任一項所述的化合物，其中，所述離子標記接頭包含光不穩(wěn)定部分。
34.一種用于制備權(quán)利要求21至33中任一項所述的化合物的方法，其中，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu):
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，R3是H。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，R3是保護基團，所述方法進一步包括: d)除去所述R3保護基團。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述保護基團是乙酰丙?；?Lev)基團。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述保護基團是離子標記接頭。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述離子標記接頭選自權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述離子標記接頭選自:
41.根據(jù)權(quán)利要求34至40中任一項所述的方法，進一步包括亞磷?；襟E(b)或(c)的產(chǎn)物，以形成化學(xué)式(IIa)的化合物:
42.根據(jù)權(quán)利要求34至41中任一項所述的方法，進一步包括亞磷?；襟E(d)的產(chǎn)物，以形成化學(xué)式(IIa)的化合物:
43.根據(jù)權(quán)利要求34至42中任一項所述的方法，其中:
R1 是 TBDMS ；
R5 選自 DMTr 和 MMTr ；Rp選自甲基(Me)、2_氰基乙基(CNEt)、鄰氯苯基(O-ClPh)、和對氯苯基(p-ClPh)； R選自異丙基、甲基、和乙基；以及 B是在至少一個氮上由合適的N-保護基團保護的核堿基，其中所述N-保護基團選自乙酰丙?；⒁阴；⒍阴；⑷阴；惗□；⒈郊柞；?-芴基甲氧基羰基、苯氧基乙?；?、二甲基甲脒、和N，N- 二苯基氨基甲酸酯。
44.一種用于合成寡聚物的方法，所述方法包括: (a)將權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭連接于第一單體單元； (b)在反應(yīng)條件下，使所述第一單體單元接觸至少一種另外的單體單元，以提供包含2至30個單體單元的寡聚物；以及(C)從所述寡聚物切割所述離子標記接頭以提供自由寡聚物。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述寡聚物是寡肽、寡糖或寡核苷酸。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中，所述寡核苷酸是寡核糖核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸。
47.—種用于合成寡核糖核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸的方法,所述方法包括: (a)將權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭連接于在所述末端3'-羥基處的第一核糖核苷或脫氧核糖核苷； (b)在反應(yīng)條件下使所述第一核糖核苷或脫氧核糖核苷接觸至少一種另外的核糖核苷或脫氧核糖核苷，以提供包含2至30個核糖核苷或脫氧核糖核苷的寡核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸；以及 (c)從所述寡核糖核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸切割所述離子標記接頭以提供自由寡核糖核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸。
48.根據(jù)權(quán)利要求44至47中任一項所述的方法，進一步包括以下步驟:在步驟(c)中切割所述離子標記接頭以前，分離所述寡聚物、所述寡核糖核苷酸或所述寡脫氧核糖核苷酸。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，通過沉淀來分離所述寡聚物、所述寡核糖核苷酸或所述寡脫氧核糖核苷酸。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述沉淀是基于所述離子標記接頭的離子特性。`
51.一種核糖核苷，具有連接在它的3’ -羥基處的離子標記接頭。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的核糖核苷，其中，所述離子標記接頭是權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭。
53.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭包含二乙氧基或二噻吩基。
54.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭，其中，所述離子標記接頭包含二噻吩基和鱗鹽。
55.一種脫氧核糖核苷，具有連接在它的3’ -羥基處的離子標記接頭。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的脫氧核糖核苷，其中，所述離子標記接頭是權(quán)利要求1至20中任一項所述的離子標記接頭。
【文檔編號】C07H21/02GK103889999SQ201280052024
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月23日
【發(fā)明者】馬薩德·J·達姆哈, 馬修·哈斯勒, 陳德恒, N·馬利卡爾瓊納·雷迪, 羅伯特·亞歷山大·東加 申請人:皇家學(xué)習(xí)促進學(xué)會/麥吉爾大學(xué), 香港理工大學(xué)