專利名稱：：包含阿拉伯糖修飾的核苷酸的小干擾核糖核酸雙螺旋的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體而言涉及含有至少一個阿拉伯糖修飾的核苷酸的'J、干擾RNA雙螺旋(siRNA)，以及小干擾2，-脫氧-2，-氟阿拉伯糖核酸:RNA雜合體，用于下調(diào)基因表達(dá)。
背景技術(shù)：
：正在發(fā)展用以核酸為基礎(chǔ)的分子(nucleicacid-basedmolecule)來使基因表達(dá)沉默的多種策略[Stephenson,M丄.&Zamecnik，P.C.InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxynucleotide(特異性寡脫氧核苷酸對Rous肉瘤病毒RNA翻譯的抑制)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，4370-4373(1977);Opalinska,J.B.&Gewirtz，A.M.Nucleic-acidtherapeutics:basicprinciplesandrecentapplications(核酸治療基本原理和最新應(yīng)用).NatureRev.1(July),1-10(2002)]。在這些策略中，使用核酶、脫氧核酶以及反義寡核苷酸(諸如嵌合RNA-DNA(有縫聚合體(gapmer)))或硫代磷酸酯DNA的雜合驅(qū)動"反義，，策略最受關(guān)注并且是很多綜述的主題[Stull，R.A.&Szoka，F(xiàn).C.Antigene，ribozymeandaptamernucleicaciddrugs:progressandprospects(抗原、核酵和適體核酸藥物發(fā)展與展望).PharmaceuticalRes.12，465-483(1995);UhlmannE.andPeyman，A.Antisenseoligonucleotides:anewtherapeuticprinciple(反義寡核苷酸一種新的治療原理).Chem.Rev.90，544-584(1990)]。近來，轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNA干4尤(RNAi)。然而，發(fā)現(xiàn)這些化合物的活性和特異性在很大程度上取決于LNA修飾的位點(diǎn)和程度。在反義鏈的5'-端的單LNA取代消除活性。此外，當(dāng)修飾反義鏈時顯著地削弱了活性，_而有義鏈LNA修飾僅耐受略微修飾的寡核苦酸，顯示了與未經(jīng)修飾的siRNA相比相等或更低的活性。隨著修飾程度增加，出現(xiàn)了對于其它化學(xué)性質(zhì)(包括毒性(硫代磷酸酯-RNA))的限制且削弱了活性(2'F-RNA,硼烷磷酸酯-RNA)[Amarzguioui，M.等人，ToleranceformutationsandchemicalmodificationsinasiRNA(siRNA中突變和化學(xué)修飾的耐受性)，Nucl.Acids.Res.31，589-595(2003)]。雖然這在原則上可以被某些寡核苷酸化學(xué)性質(zhì)所給予的核酸酶穩(wěn)定性/和/或特異性補(bǔ)償，但對有效siRNA化學(xué)性質(zhì)的預(yù)測仍是后續(xù)研究的活躍焦點(diǎn)。仍存在對化學(xué)修飾siRNA的需要，其要具有核酸酶穩(wěn)定性和/或抑制基因表達(dá)的能力。發(fā)明概要根據(jù)本發(fā)明的一個廣泛方面，本發(fā)明提供一種用于以序列特異性方式來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的包括雙鏈雙螺旋的小干擾RNA(siRNA),其中siRNA的至少一個核糖核酸核苦酸被阿拉伯糖修飾的核苷酸取代。阿拉伯糖修飾的核苷酸為2，-脫氧-2，-氟阿拉伯糖核苦酸(FANA)。優(yōu)選地，siRNA的長度為15至30個核苷酸且具有在3'末端和與5，末端突出的1至3個核苷酸突出端。在具體實(shí)施方案中，雙螺旋可在有義鏈或反義鏈的任何位置具有任何^:目的阿4i伯糖核苦酸，例如5,-ARARARARARARARARARARA-3,5,-AARRAARRAARRAARRAARRA-3,5，-AARRRRRRRRRRRRRRRRRRR陽3，5，-RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRAA-3,等其中A是阿拉伯糖核苷酸(arabino皿cleotide)且R是核糖核苷酸。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，有義鏈完全被阿拉伯糖核苷酸取代5舉例說來5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'且有義鏈?zhǔn)侨玆NA鏈或部分取代的RNA鏈，例如5，隱RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3，5，-RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRAA-3'5，-AARRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR隱3，等。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，阿拉伯糖核苷酸包含選自下列的2，取代基氟、羥基、氨基、疊氮基、烷基、烷氧基以及烷氧基烷基。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，烷基選自曱基、乙基、丙基、丁基以及官能化烷基(諸如乙氨基、丙氨基和丁氨基)。在實(shí)施方案中，烷氧基選自曱氧基、乙氧基、丙氧基和官能化烷氧基(諸如-0(CH2)q-R，其中q:2-4且-R為-NH2、-OCH3或-00120^)。在實(shí)施方案中，烷氧基烷基選自曱氧基乙基和乙氧基乙基。在實(shí)施方案中，2'取代基是氟且阿拉伯糖核苷酸是2，-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。優(yōu)選地，F(xiàn)ANA核苷酸是araF-G、araF-T、araF-U、araF-A、araF-5-甲基-C。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，siRNA用于減少熒光素酶表達(dá)、CCR3表達(dá)或PDE4D表達(dá)中任一者。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，siRNA用于減少呼吸道合胞病毒復(fù)制。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，雙螺旋包含一種或多種選自下列的沖亥香酉臾間4定(intemucleotidelinkage):a)磷酸二酯；b)磷酸三酯；c)硫代磷酸酯；d)膦酸曱酯；e)硼烷磷酸酯(boran叩hosphate)，以及f)(a)至(e)的任何組合。根據(jù)本發(fā)明的另一廣泛方面，提供一種用于增強(qiáng)siRNA的核酸酶穩(wěn)定性和靶基因活性的調(diào)節(jié)中的至少一個的方法,包含用阿拉伯糖修飾的核苦酸(優(yōu)選地為2，-脫氧-2，-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA))來置換siRNA的至少一個核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一廣泛方面，提供一種藥用組合物，其包含本發(fā)明的siRNA以及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一廣泛方面，提供本發(fā)明的siRNA用于制備調(diào)節(jié)靶基因(優(yōu)選地為CCR3和PDE4D中的一個)表達(dá)的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供本發(fā)明的siRNA用于制備減少呼吸道合胞病毒復(fù)制的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一廣泛方面，提供一種調(diào)節(jié)需要該調(diào)節(jié)的患者中基因表達(dá)的方法。該方法包含給予該患者治療上有效量的本發(fā)明的藥用組合物。優(yōu)選地，該藥用組合物包含siRNA用于減少CCR3的表達(dá)、減少PDE4D的表達(dá)以及減少呼吸道合胞病毒復(fù)制中的任一個。根據(jù)本發(fā)明的另一廣泛方面，提供一種商業(yè)包裝。該商業(yè)包裝包含本發(fā)明的藥用組合物以及關(guān)于其用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的用途的說明書。優(yōu)選地，藥用組合物包含siRNA用于減少CCR3表達(dá)，減少PDE4D表達(dá)以及減少呼吸道合胞病毒復(fù)制中的任一個。附圖簡述現(xiàn)將參看附圖來更詳細(xì)地描述本發(fā)明，在附圖中圖1說明不同siRNA抑制海拉X1/5細(xì)胞中熒光素酶的功效。用0.21iag僅在有義鏈(A)中有修飾的siRNA、僅在反義鏈(B)中有修飾的siRNA或在反義鏈和有義鏈(C)中均有修飾的siRNA對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24小時測量焚光素酶活性水平并且被標(biāo)準(zhǔn)化(normalize)為代謝活性。然后與被設(shè)置為100%的對照siRNA相比較，將標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶活性確定為熒光熒光素酶活性的百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)表示平均標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性+/-SEM。通過在轉(zhuǎn)染后24小時進(jìn)行實(shí)時PCR分析(相對于看家基因GAPDH的表達(dá))來量化熒光素酶mRNA水平。條(bar)顯示出平均焚光素酶/GAPDH比率+ASEM。圖2顯示出含有FANA的siRNA抑制熒光素酶活性的效力。通過用不同量的活性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時獲得每個siRNA的劑量反應(yīng)。在(A)中顯示出在僅有義鏈中有修飾的siRNA的劑量反應(yīng)，在(B)中顯示出僅在反義鏈中有修飾的siRNA的劑量反應(yīng)，在(C)中顯示出在有義鏈和反義鏈中均有修飾的siRNA的劑量反應(yīng)。測量熒光素酶活性并且將值標(biāo)準(zhǔn)化為代謝活性，并且與設(shè)置為10(T/。的對照siRNA相比較。數(shù)據(jù)表示平均標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性+/-SEM。圖3說明靶向海拉X1/5細(xì)胞中熒光素酶mRNA的不同siRNA隨著時間的功效。用0.21pg的siRNA來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后4小時、8小時、24小時、48小時、72小時和96小時測量焚光素酶活性。數(shù)據(jù)表示與被設(shè)置為100。/。的對照siRNA相比較的平均標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性+/-SEM。圖4說明含有FANA的siRNA的血清穩(wěn)定性。在37。C在10%胎牛血清中將育不同的siRNA并且在所表示的時間點(diǎn)取等分試樣。siRNA通過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離并且用SYBR金顯現(xiàn)。條帶通過密度測定法進(jìn)行量化并且起始量的完整siRNA的百分比被設(shè)置為100%。A)顯示靶向熒光素酶的siRNA的血清穩(wěn)定性。"ds"表示雙鏈siRNA標(biāo)記且"ss，，表示單鏈標(biāo)記。B)曲線圖表示耙向焚光素酶的不同siRNA的血清穩(wěn)定性。C)曲線圖表示靶向CCR3的不同siRNA的血清穩(wěn)定性。D)曲線圖表示耙向PDE4D的不同siRNA的血清穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)表示兩個或三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。圖5說明含有FANA的siRNA抑制NIH-3T3細(xì)胞中大鼠CCR3表達(dá)的功效。靶向大鼠CCR3的逐漸增加量的siRNA與NIH-3T3細(xì)胞中表達(dá)大鼠CCR3基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。使用基因定量(Panomics)方法在轉(zhuǎn)染后24小時測量CCR3mRNA表達(dá)水平并且將其標(biāo)準(zhǔn)化為參考基因(熒光素酶)的表達(dá)水平。與被設(shè)置為100%的對照siRNA相比較，將siRNA的活性確定為抑制百分比。數(shù)據(jù)表示平均+/-SEM(n=6)。圖6說明靶向RSV病毒P-蛋白質(zhì)的含有FANA的siRNA對于A549細(xì)胞中RSV產(chǎn)生的功效。培養(yǎng)A549細(xì)胞并且在24孔板中以每孔0.1xl()S個細(xì)胞接種并且在37。C,5。/。C02下培養(yǎng)過夜。次日，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑用0.05ug、0.2ug或0.4ug的siRSV-P2(抵抗RSV病毒P-蛋白質(zhì)的siRNA)、siRSV-P2-Mi(抵抗RSV病毒P-蛋白質(zhì)的siRNA錯配)、siRSV-P2-0/F4以及陰性對照siRNA-P2-Mi-0/F4以1:3的si認(rèn)A:Lipofectamine2000比率對細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每個轉(zhuǎn)染實(shí)^^均以一式三份進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染后一天，用hRSV在M.OJN1對細(xì)胞進(jìn)行感染且在37。C，5%032下孵育過夜。在感染后24小時收獲上清液且通過RSV蛋白質(zhì)量化用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))來評估病毒水平。數(shù)據(jù)表示為相對于它們相應(yīng)錯配siRNA的RSV抑制水平的siRNA的XRSV抑制。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及修飾的寡核苷酸雙螺旋，其被設(shè)計成靶向mRNA并經(jīng)由RNAi機(jī)制來促進(jìn)mRNA降解。特定而言，顯示出了使用含有修飾的阿拉伯糖核香酸(FANA)的短干擾RNA雙螺旋來選擇性地抑制熒光素酶活性、大鼠CCR3表達(dá)以及RSV病毒復(fù)制。本文所述的RNAi方法與上文所述的常用方法大不相同，其專注于來源于天然單元(即，DNA、RNA、2，-OMe-RNA、2T-RNA核普酸)的修飾的核苷酸的1"吏用[Allerson，C.R.等人，F(xiàn)ully2，畫modifiedoligonucleotideduplexeswithimprovedinvitropotencyandstabilitycomparedtounmodifiedsmallinterferingRNA(體外效力和穩(wěn)定性比未^f務(wù)飾小干擾RNA有所提高的完全2，-修飾的寡核苦酸雙螺旋).J.Med.Chem.48，901-904(2005)。本發(fā)明涵蓋一系列抑制人細(xì)胞系中的基因表達(dá)的糖修飾雙螺旋的表征。這些小干擾雙螺旋含有阿拉伯糖修飾的核苷酸，其賦予雙螺旋改進(jìn)的特征，諸如抵抗體液中所存在的核酸酶的改進(jìn)的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，糖修飾的核苷酸為2，-脫氧-2，-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。用于產(chǎn)生FANA修飾雙螺旋的方法需要用FANA殘基來取代RNA核香酸。使用被設(shè)計成過度表達(dá)熒光素酶的修飾海拉細(xì)胞系來評價修飾siRNA的活性。分別使用實(shí)時PCR與熒光素酶測定技術(shù)來確定熒光素酶mRNA表達(dá)水平和熒光素酶活性水平。根據(jù)Mittal等人[Mittal，V.ImprovingtheefficiencyofRNAinterferenceinmammals(提高哺乳動物中RNA干擾的有效性).NatureRev.5，355-365(2004)]用Ambion禾口Qiagen算法(AmbionandQiagenalgorithm)和NCBI同源才企索來執(zhí)行實(shí)際siRNA堿基序列的設(shè)計和選擇。如上文所述來選擇并測試至少三個候選siRNA雙螺旋。一旦鑒別出活性最高siRNA雙螺旋(EC5。~0.5nM)，就進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)來評估阿拉伯糖修飾對于siRNA活性的影響。表明了這種FANA修飾的雙螺旋對于焚光素酶活性的選擇性、特異性和有效抑制(圖1)。用FANA鏈來完全置換siRNA雙螺旋的一個RNA鏈(有義鏈)將產(chǎn)生FANA:RNA雜合體，F(xiàn)ANA:RNA雜合體也提供對mRNA靶的選擇性、特異性和有效下調(diào)(圖IA)。本文所公開的化合物表示FANA修飾的雙螺旋的第一實(shí)施例(FANA修飾siRNA和FANA:RNA雜合體)能夠經(jīng)由RNAi機(jī)制來選擇性地抑制基因表達(dá)。具體說來，本發(fā)明提供FANA核苷酸，其與siRNA雙螺旋的活性相容。此外，顯示出整個FANA有義鏈可結(jié)合到互補(bǔ)未修飾的RNA反義鏈產(chǎn)生一種雙螺旋，這種雙螺旋進(jìn)入RNAi路徑以選擇性地且有效地耙向mRNA并且促進(jìn)其降解(圖1A和圖2A)。這些修飾的雙螺旋通過合成組成鏈(constituentstrand)(經(jīng)由固相化學(xué)方法)獲得并且然后使它們退火(anneal)以形成雙螺旋。出人意料地，在涉及有義鏈的部分修飾或完全修飾的所有情況下，基因沉默活性類似于所觀察到未修飾的自然siRNA雙螺旋的情形(圖1A和圖2B)。用FANA修飾雙螺旋進(jìn)行處理導(dǎo)致熒光素酶活性以濃度依賴性的方式減小，且估計EC5C)在0.06到3.6nM的范圍。所觀察到的有義修飾的雙螺旋的效力與自然siRNA的效力相當(dāng)(圖2A至圖2C),自然siRNA在這個系統(tǒng)中具有0.20nM的估計ECso(表1)。本發(fā)明還提供RNA雙螺旋，其中將未修飾的有義鏈退火至反義鏈上，在反義鏈中用FANA置換懸空的dN末端殘基(3，或5，-末端)而不會影響活性(圖1B和圖2B)。令人意外地，用FANA殘基來取代兩個3，-脫氧核苷酸賦予比未經(jīng)修飾的siRNA更強(qiáng)的增強(qiáng)的效力(圖1B和圖2B),與具有LNA修飾的siRNA形成鮮明對比，在LNA修飾的siRNA中相應(yīng)變化導(dǎo)致活性的顯著減小或完全喪失[Elmen，J.等人,Lockednucleicacid(LNA)mediatedimprovementsinsiRNAstabilityandfunetionality(鎖核酸(LNA)介導(dǎo)的siRNA穩(wěn)定性和功能的提高).Nucl.AcidsRes.33，439-447(2005)1。本發(fā)明還提供RNA雙螺旋，其中有義鏈和反義鏈均含有修飾殘基，同時仍維持RNAi活性(圖1C)。關(guān)于在兩個鏈中的一個鏈上含有FANA的RNA雙螺旋，這些雙螺旋顯示出與未經(jīng)修飾的siRNA的效力相比相等或更強(qiáng)的特異性靶降解效力(圖2C)。類似于未經(jīng)修飾的siRNA，當(dāng)將阿拉伯糖修飾雙螺旋轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)時觀察到直至轉(zhuǎn)染后4天的熒光素酶活性的持續(xù)抑制(圖3)。然而，在這個時間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)修飾的siRNA具有比未經(jīng)修飾的siRNA更強(qiáng)的抑制活性。在本文中展示了含有FANA的siRNA雙螺旋的核酸酶穩(wěn)定性得到改進(jìn)強(qiáng)于未經(jīng)修飾的siRNA雙螺旋的證據(jù)(圖4)。未經(jīng)修飾的siRNA在15分鐘內(nèi)完全降解，而含有完全修飾的有義鏈和3，-端突出端修飾的反義鏈的siRNA雙螺旋在5小時后仍能過容易地被檢測到。因此，2'-脫氧-2，-氟-(3-D-阿拉伯糖-(寡核苷酸)(單獨(dú)地或與核糖核苦酸(RNA)單元組合地)能夠與互補(bǔ)(反義)RNA鏈雜合以產(chǎn)生具有改進(jìn)效力和增強(qiáng)核酸酶抗性的siRNA雙螺旋。在構(gòu)思這些化合物的體內(nèi)給藥方面，這些性質(zhì)是非常需要的。"治療上有效量，，是指在劑量上有效且持續(xù)必需的時期以實(shí)現(xiàn)所要治療結(jié)果的量。本發(fā)明的修飾核酸的治療上有效量可根據(jù)以下因素而有所變化諸如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別以及體重，和修飾核酸在個體中引發(fā)所需反應(yīng)的能力。可以調(diào)整劑量方案來提供最佳治療反應(yīng)。治療上有效量也是化合物的治療上有益影響勝過化合物的毒性或有害影響的量。對于任何特定受試者，可根據(jù)個體需要或者管理或監(jiān)督組合物給藥的人的職業(yè)判斷來隨著時間調(diào)整具體劑量方案。如本文所使用的"藥學(xué)上可接受的載體"或"賦形劑"包括隨便哪種溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和殺真菌劑、等滲以及吸收延遲劑和在生理上相容的類似物。在一個實(shí)施方案中，載體適于胃腸外給藥。或者，載體可適于靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、舌下給藥或口服給藥。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或M液和用于無菌可注射溶液或分散液的臨時制備的無菌粉末。將這些介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)上有活性的物質(zhì)是本領(lǐng)域中已知的。除了與該活性化合物不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑外，構(gòu)想到它們在本發(fā)明的藥用組合物中的使用。補(bǔ)充活性化合物也可合并到組合物內(nèi)。治療組合物在生產(chǎn)和貯存條件下通常必須無菌且穩(wěn)定。組合物可配制為溶液、微乳液、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其它有序結(jié)構(gòu)。載體可為含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙烯等)的溶劑或分散介質(zhì)和其適當(dāng)混合物?？墒褂弥T如卵磷脂的包衣、通過維持所需顆粒大小(在分散液的情況下)和通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在許多情況下，優(yōu)選地在組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑(例如，一酯硬酸鹽和凝膠)來實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。此外，本發(fā)明的寡核苷酸雙螺旋可能以緩釋制劑(timereleaseformulation)給藥，例如，以包括緩釋聚合物的組合物形式?？捎梅乐剐揎椀墓押塑账犭p螺旋快速釋放的載體來制備修飾的寡核香酸，諸如控釋制劑，包括植入物和微嚢化傳遞系統(tǒng)。可使用可生物降解的生物相容聚合物，諸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原質(zhì)、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制備這樣的制劑的許多方法已被申請專利且是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的?？筛鶕?jù)需要，通過將所需量的活性化合物(諸如本發(fā)明的寡核苷酸雙螺旋)與上文所列舉的成份中的一種成份或它們的組合加入到適當(dāng)溶劑中，之后進(jìn)行過濾殺菌而得到無菌可注射的溶液。一般而言，通過將活性化合物加入到無菌媒劑內(nèi)來制備分散液，該無菌媒劑含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需要的上文所列出的那些成份中的其它成份。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從其先前無菌過濾的溶液得到活性成份加上任何附加所要成份的粉末。根據(jù)本發(fā)明的替代方面，可使用提高本發(fā)明的寡核苷酸雙螺旋的溶解度的一或多種附加化合物來配制本發(fā)明的寡核苷酸雙螺旋。盡管在本文中公開了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識可在本發(fā)明的范疇內(nèi)進(jìn)行許多調(diào)整和修改。這些修改包括用已知等效物來代替本發(fā)明的任一方面以便以實(shí)質(zhì)上相同的方式實(shí)現(xiàn)相同的效果。數(shù)字范圍包括限定范圍的數(shù)字。在權(quán)利要求書中，用詞"包括(包含)"是開放式術(shù)語，實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于短語"包括，但不限于"。的本發(fā)明的廣泛方面。實(shí)施例l:對于siRNA雙螺旋和阿拉伯糖修飾的雙螺旋的化學(xué)分析在表1中顯示出在這個研究中所制備的低聚物的序列和組成。根據(jù)已公布的協(xié)議[E.Viazovkina、M.M.Mangos、M丄Elzagheid和M.J.Damha(2002)CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry,Unit4.15);M.J.Damha和K.K.Ogilvie(1993)OHgoribonucleotidesynthesis-thesilyl-phosphoramiditemethodin"ProtocolsforOligonucleotideandAnalogs:SynthesisandProperties("寡核苦酸和類似物的方案合成和肽"中寡核苷酸合成-甲硅烷基-亞磷酰胺法)"S.Agrawal(ed.)，MethodsinMolecularBiologypp.81-114，TheHumanaPressInc.，Totowa，NewJersey使用標(biāo)準(zhǔn)卩-氰乙基亞磷酰胺化學(xué)法在應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)合成儀上以l^imol的量(scale)合成寡核糖核苷酸、FANA修飾的寡核糖核苷酸以及全FANA寡核苷酸。將FANA修飾的寡核糖核苷酸和寡核糖核苷酸同樣地去保護(hù)，純化以及處理。所有寡核苦酸通過陰離子交換HPLC或凝膠電泳而純化，且使用葡聚糖凝膠G-25珠粒經(jīng)由尺寸排阻色譜法進(jìn)行脫鹽。通過混合有義鏈與相應(yīng)反義鏈(l:l化學(xué)劑量比率)，凍干樣品以及添加足量的再懸浮/退火緩沖液(annealingbuffer)制成20|iM溶液來制備雙螺旋的原液。siRNA再懸浮/退火緩沖液的組成是100mM乙酸鉀、30mMHEPES-KOH、2mM乙酸4美，pH7.4。實(shí)施例2:含有FANA的siRNA的功效這個實(shí)施例涉及含有FANA的siRNA相對于靶mRNA的特異性敲減(specificknockdown)和海拉Xl/5細(xì)胞中熒光素酶活性的降低。從ECACC(ECACC號95051229)獲得海拉Xl/5細(xì)胞系并且維持在補(bǔ)充有(Invitrogen,BurlingtonON)10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%維生素、500jig/mlG418和300|iig/ml潮霉素的EMEM培養(yǎng)基中。為進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前24小時，向24孔板上每孔接種(plate)1.0Xl()S個細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染的那天，根據(jù)生產(chǎn)商建議，使用Lipofectamine2000(Invitrogen,BurlingtonON),用0.21)dg的siRNA以1:2的siRNA:Lipofectamine2000比率來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時收獲細(xì)胞。按照生產(chǎn)商建議，使用alamarBlue熒光測定(Medicorp,MontrealQC)來評估細(xì)胞代謝活性，作為siRNA轉(zhuǎn)染所造成的細(xì)胞毒性的指標(biāo)。才艮據(jù)生產(chǎn)商建議方案使用熒光酶素測定系統(tǒng)(BDBioscience,Mississauga,ON)來執(zhí)行焚光素酶活性測定。簡言之，在暴露于siRNA后，用磷酸鹽緩沖鹽水(Invitrogen,BurlingtonON)洗滌細(xì)胞并將細(xì)胞溶解。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行離心分離以移除細(xì)胞碎片并將20pl等分板(Ultident;GreinerBio-one)。4吏用孩吏孔板光度計(LuminoskanAscent,ThermoLabSystem)來測量發(fā)光，緊接著添加熒光素底物溶液。然后將發(fā)光值標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞代謝活性值(alamarBlueTM)來補(bǔ)償轉(zhuǎn)染所造成的毒性。關(guān)于實(shí)時PCR分析，根據(jù)生產(chǎn)商建議方案使用RNeasy微型試劑盒(minikit)(Qiagen，MississaugaON)來提取總RNA。使用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物(Invitrogen,BurlingtonON)來從1jig的總RNA制備cDNA。使用先前的優(yōu)化條件和LightCycler(Roche,LavalQC)使用基因特異性引物和探針來執(zhí)行熒光素酶基因(LUC5013Fl:5'-acgctgggcgttaatcagag陽3';LUC5013Rl:5，-gtcgaagatgttggggtgttg-3，；TIBMOLBIOL)和看家基因GAPDH(huGAPD代表5，-ggtggtctcctctgacttc-3,;huGAPDrev:5，-ctcttcctcttgtgctcttg-3，；TIBMOLBIOL)的定量實(shí)時PCR。圖1所展示的結(jié)果表明FANA當(dāng)合并到siRNA內(nèi)時耐受良好。實(shí)際上，與未經(jīng)修飾的siRNA相比(圖1A),具有全FANA修飾的有義鏈(F3/0)的siRNA保留其活性(mRNA和熒光素酶活性)。我們的數(shù)據(jù)也表顯示出FANA修飾當(dāng)被引入到反義鏈內(nèi)時耐受良好(圖IB)。與未經(jīng)修飾的siRNA雙螺旋(55%)相比，用兩個FANA殘基(0/F4和F3/F4)置換兩個3，-突出端脫氧核苷酸導(dǎo)致雙螺旋的增強(qiáng)的抑制活性(65%)(圖1B和1C)。這些結(jié)果與所公布的數(shù)據(jù)大不相同，其中顯示，化學(xué)修飾基于修飾類型僅在一端耐受良好。然而，引入六個FANA，總地包括反義鏈的5，端部和中部，消除了siRNA雙螺旋的活性，與被引入到有義鏈上的修飾無關(guān)(圖1B和圖1C)。已知siRNA的反義鏈的中間部分對于雙螺旋與RNAi細(xì)胞機(jī)理的相互作用而言是重要的且對化學(xué)修飾非常敏感。因此，優(yōu)選地，在有義鏈和反義鏈上的修飾均在上文所述的參數(shù)內(nèi)(圖1C)。實(shí)施例3:含有FANA的siRNA的效力這個實(shí)施例涉及含有FANA的siRNA相對于海拉X1/5細(xì)胞中熒光素酶活性的特異性敲減的效力。使用總量為0.21pg的siRNA進(jìn)行劑量反應(yīng)研究，由此用對照siRNA連續(xù)稀釋有效siRNA,減少活性寡核苦酸的有效量同時保持siRNA的最終量恒定。在轉(zhuǎn)染后24小時收獲細(xì)胞并確定熒光素酶活性。結(jié)果表明反義鏈的3，-突出端的脫氧核苷酸被FANA置換且有義鏈未被修飾(0/F4)或完全被修飾的siRNA以濃度依賴性的方式抑制熒光素酶活性，其具有比相對應(yīng)的未經(jīng)修飾的siRNA更強(qiáng)的增強(qiáng)的效力(圖2B和2C)。在表1中展顯示出估計EC50值。實(shí)施例4:含有FANA的siRNA的作用持續(xù)時間這個實(shí)施例顯示出含有FANA的siRNA具有長達(dá)96個小時的持續(xù)抑制活性。在向不同修飾的siRNA和未經(jīng)修飾的siRNA暴露后在不同的時間點(diǎn)測量熒光素酶活性(圖3)。結(jié)果表明含有FANA殘基的siRNA具有長達(dá)4天的延長的活性。此外，數(shù)據(jù)表明與未經(jīng)修飾的siRNA相比，含有FANA的siRNA在96小時的時間點(diǎn)具有增強(qiáng)的抑制活性(分別為65%與45%的熒光素酶活性抑制)。實(shí)施例5:含有FANA的siRNA的增強(qiáng)的穩(wěn)定性這個實(shí)施例涉及在胎牛血清存在下siRNA雙螺旋穩(wěn)定性。在圖4中展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在DMEM中在10%胎牛血清中稀釋siRNA并且在37。C孵育。在0.25小時、0.5小時、0.45小時、1小時、2小時、6小時和24小時后收集12^tl等分試樣并且在36^含有50%Ficoll的1.5XTBE裝樣緩沖液(loadingbuffer)中冷凍備分析用。在非變性條件下在20%聚丙烯酰胺凝膠上分離樣品并且用SYBR金(Iiwitrogen，BurlingtonON)進(jìn)行染色。通過密度測定分析來量化對應(yīng)于完整siRNA的條帶。結(jié)果顯示出在有義鏈中摻入FANA賦予對血清介導(dǎo)的siRNA降解的顯著抗性。引入FANA顯著地提高了siRNA的血清抗性。代表凝膠在圖4A中顯示出。與序列無關(guān)，siRNA(0/0)的所有未修飾形式具有短于15分鐘的半衰期(圖4B、4C和4D)。用兩個FANA(0/F4)取代在反義鏈中的兩個3，-突出端脫氧核芬酸對于siRNA雙螺旋的血清穩(wěn)定性沒有影響(圖4B、4C和4D)。然而，由于觀察到siRNA雙螺旋半衰期高達(dá)4個小時，具有全FANA修飾的有義鏈(F3/0)賦予對抗血清介導(dǎo)降解的顯著抗性(圖4B)。最后，由于確定大約5h的siRNA半衰期，對有義鏈和反義鏈(F3/F4)都進(jìn)行FANA修飾導(dǎo)致甚至更強(qiáng)對核酸酶的抗性(圖4B和圖4C)。實(shí)施例6:含有FANA的siRNA抑制CCR3mRNA表達(dá)水平的功效這個實(shí)施例涉及含有FANA的siRNA對NIH-3T3細(xì)胞中CCR3mRNA表達(dá)水平特異性敲減的功效。從ATCC(ATCCCRL-1658)獲得NIH-3T3細(xì)胞系并且維持在補(bǔ)充有10%小牛血清、4mML-谷氨酰胺、3.7g/L碳酸氫鈉、4.5g/1葡萄糖以及1%青霉素/鏈霉素的DMEN培養(yǎng)基(Invitrogen,BurlingtonON)中。在轉(zhuǎn)染前一天，向24孔板上每孔接種.0X105個細(xì)胞。根據(jù)生產(chǎn)商建議，使用Lipofectamine2000(Invitrogen,BurlingtonON)用0.2(ig表達(dá)大鼠CCR3基因的質(zhì)粒、0.2pg表達(dá)熒光素酶(參考基因)的質(zhì)粒以及0.01、0.1或0.2pg的siRNA以1:2的DNA/siRNA丄ipofectamine2000比率轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24h收獲細(xì)胞。使用基因定量方法(Panomics,FremontCA)來量化CCR3和熒光素酶的表達(dá)水平。然后將CCR3表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為對于萸光素酶所測量的水平。圖5展示的結(jié)果表明將FANA殘基摻入到siRNA內(nèi)導(dǎo)致靶向大鼠CCR3mRNA的siRNA的抑制活性的劑量依賴性增強(qiáng)。實(shí)際上，用兩個FANAs(0/F4)取代反義鏈中的兩個3，-突出端脫氧核苷酸導(dǎo)致雙螺旋增強(qiáng)的抑制活性(當(dāng)與未經(jīng)修飾的CCR3siRNA(35%)相比較時高達(dá)49%)(圖5)。此外，與未經(jīng)修飾的siRNA比較，具有全FANA修飾有義鏈(F3/0)的CCR3siRNA的活性更高(對CCR3mRNA水平75%的抑制)(圖5)。最后，對siRNA雙螺旋的兩個鏈進(jìn)行的修飾良好地耐受，抑制活性達(dá)到75%。這些數(shù)據(jù)支持以下觀察FANA:l)當(dāng)引入到siRNA雙螺旋中時耐受良好，以及2)提高siRNA雙螺旋的抑制活性。實(shí)施例7:含有FANA的siRNA抑制病毒復(fù)制的增強(qiáng)功效這個實(shí)施例涉及含有FANA殘基的siRNA雙螺旋抑制A549細(xì)胞中呼吸道合胞病毒(RSV)復(fù)制的功效。A549細(xì)胞系(ATCC,#CCL-185)維持在補(bǔ)充有10%未滅活FBS(HyClone)的HamF12培養(yǎng)基(HyClone，LoganUT)中。在轉(zhuǎn)染前一天，向24孔板的各孔內(nèi)接種1.0X1()S個細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染的那天，根據(jù)生產(chǎn)商建議方案用0.05昭、0.2嗎或0.4pg的siRNA以1:3的siRNA與轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine2000(Invitrogen,BurlingtonON))的比率來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時，用RSV以1的感染復(fù)數(shù)(M.O丄)來感染細(xì)胞并且允許病毒感染進(jìn)行一天。在向病毒暴露后24小時后，收獲細(xì)胞上清液并且使用ELISA方法評估RSV水平以檢測RSV蛋白質(zhì)。結(jié)果表明siRNA雙螺旋(其中反義鏈的3'突出端的兩個脫氧核苷抑制RSV復(fù)制，與在較低劑量未經(jīng)修飾的siRNA相比，其具有增強(qiáng)的抑制活性(圖6)。這些結(jié)果支持以下觀察FANA增強(qiáng)siRNA的抑制活性。所引用的所有參考文獻(xiàn)以引用的方式結(jié)合到本文中。雖然已在本文中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解在不偏離本發(fā)明的精神或所附權(quán)利要求書的范疇的情況下可以做出各種變化。表l:寡核香酸和在這個研究中所合成的雙螺旋<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>0/0F1/0F2/0F3/00/F10/F20/F30/F4F2/F1F2/F2F2/F3F2/F4F3/F1F3/F3F3/F412345689101112131415161718192021222324252627282930RNARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANARNA/FANA3'5，3，33'3，333-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg-3'0,20ggCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5'-GCUUGAAGUCUUUAAUUAATT-3'0,25ggCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5，'-GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt-3'2,0'-ggCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5'-GCTTGAAGTCTTTAATTAAGG-3'0,59-ggCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5,-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg-3'0,16-gGCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5'，-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg-3'0,52'-ggCGAACUUCAGAAAUUAAUT-5''-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg-3'6,3'-ggCGAACTTCAGAAATTAATT-5'，-GCUUGAAGUCUUUAAUUAAgg-3'0,06，-GGCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5',-GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt-3'0,11，-gGCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5'，-GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt-3'1,7'-ggCGAACUUCAGAAAUUAAUT-5''-GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt-3，3,6，-ggCGAACTTCAGAAATTAATT-5''-GCTTGAAGUCTTUAATTAAtt-3，0,06'-GGCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5'-GCTTGAAGTCTTTAATTAAGG-3'0,24，-gGCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5''-GCTTGAAGTCTTTAATTAAGG-3'>10'-ggCGAACTTCAGAAATTAATT-5''-GCTTGAAGTCTTTAATTAAGG-3'0,17'-GGCGAACUUCAGAAAUUAAUU-5'RatCCR3O/O0/F4F3/0F3/F4人PDE4DO/O0/F4F3/0F3/F4RSVP231RNA5'-ACACCCUAUGAAUAUGAGUtt-3'n.d.323'-ttUGUGGGAUACUUAUACUCA-5，33RNA/FANA5'-ACACCCUAUGAAUAUGAGUtt-3，n.d.343，-TTUGUGGGAUACUUAUACUCA-5，35RNA/FANA5-ACACCCTATGAATATGAGTTT-3'nd.363'-ttUGUGGGAUACUUAUACUCA-5'37RNA/FANA5-ACACCCTATGAATATGAGTTT-3'n.d,383'-TTUGUGGGAUACUUAUACUCA-5，39RNA5'-AAGAACUUGCCUUGAUGUAca-3'n.d.403'-ttUUCUUGAACGGAACUACAU-5'41RNA/FANA5'-AAGAACUUGCCUUGAUGUAca-3，n.d.423'-TTUUCUUGAACGGAACUACAU-5'43RNA/FANA5-AAGAACTTGCCTTGATGTACA-3'nd.443'-ttUUCUUGAACGGAACUACAU-5'45RNA/FANA5-AAGAACTTGCCTTGATGTACA-3'nd.463'-TTUUCUUGAACGGAACUACAU-5'O/O0/F4474849505'-CCCUACACCAAGUGAUAAUtt-:3'-ttGGGAUGUGGUUCACUAUUA-RNA/FANA5，-CCCUACACCAAGUGAUAAUtt-3，3'-TTGGGAUGUGGUUCACUAUUA-n.d.n.d.a上標(biāo)字母-RNA;下標(biāo)字母-DNA;粗上標(biāo)字母^FANA例如，0/0表示未經(jīng)修飾的siRNA,而0/F1表示具有未修飾的有義鏈和在反義鏈中的Fl4務(wù)飾的siRNA。n.d.=不確定。<110>TopigenPharmaceuticalsInc.<120>包含阿拉伯糖修飾的核苷酸的小干擾核糖核酸雙螺旋<130>13424-14PCT<150>US60/730,876<151>2005-10-28<150>US60〃41，544<151>2005-12-02<160>50<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220〉<221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2，-脫氧鳥苷<400>1gcuugsagucuuuaauuaann<210>2<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>2uuaauu3a3gacuucaagcnn<210>3<211>21<212>RNA<213>'人工<220><223>合成寡核苷酸<220><22><222><223>misc—feature(20).:(21)n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<400>3gcuugaagucuuuaauuaann<210>4<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核香酸<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>4uuaauuaaagacuucaagcnn21<210>5<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc—feature<222>(3)..(3)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc_feature<222>(11).7(12)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc一feature<222>(16).7(17)<223>n殘基是2，-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧咬<400>5gcnngaagucnnuaannaann<210>6<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>6uuaauuaaagacuucaagcnn21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220〉<221>修飾^&<222>(1).,(21)<223>所有殘基是2，-脫氧-2，-氟-阿拉伯糖核苷酸<400>7gcttgaagtctttaattaagg21<210>8<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>8uuaauuaaagacuucaagcnn2<210>9<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221><222><223>miscfeature(20)..(21)n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>9gcuugaagucuuuaauuaann<210>10<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><221>misc_feature<222>(20).:(20)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟-阿拉伯鳥苷<220><221>misc一feature<222>(21).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧鳥苷<400>10uuaauuaaagacuucaagcnn21<210>11<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>11gcuugaagucuuuaauuaann21<210>12<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc一feature<222>(l)..(I)<223>n殘基是2'-脫氧-2，-氟-阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>12nuaauuaaagacuucaagcnn21<210>13<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核香酸<220><221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>13gcuugaagucuuimauuaann21<210>14<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核香酸<220><221>misc一feature<222>(l)..(》<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(5)..(^)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc一feature<222>(3):(4)<223>n殘基是2'-脫氡-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc一feature<222>(20).:(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>14nnaannaaagacnncaagcnn21<210>15<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><221>misc_feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>15gcuugaagucuuuaauuaann21<210>16<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><221>misc—feature<222>(20).7(2)<223>n殘基是2，-脫氧-2'-氟阿拉伯糖鳥苷<400>16uuaauuaaagacuucaagcnn21<210>17<211〉21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><22I>misc—feature<222>(3)..(1)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嗜啶<220><221>misc一feature<222>(11).7(12)<223>n殘基是2'-脫氧-2，-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(16).7(〗7)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221><222><223>misc—feature(20).:(21)n殘基是2'-脫氧胸腺嘧咬<400>17gcnngaagucrmuaannaann<210>18<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc—feature<222>(20):闊<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯鳥苷<220><221>misc—feature<222>(21).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧烏苷<400>18uuaauuaaagacuucaagcnn21<210>19<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221〉misc—feature<222>(3)..(i)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(11).7(12)<223>n殘基是2，-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(16):(17)<223>n殘基是2，-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嗜啶<220><221>misc—feature<222>(20):(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧梵<400>19gcnngaagucnnuaannaann21<210>20<2〗>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc—feature<222>(l)..(l)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟何拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧鳥苷<400>20nuaauuaaagacuucaagcnn21<210>21<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc—feature<222>(3)..()<223>n殘基是2，-脫氧-2，-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc一feature<222>(11).7(12)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(16):(17)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<400>21gcnngaagucnnuaannaann21<210>22<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><221>misc—feature<222>(l)..(》<223>n殘基是2，-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc一feature<222>(5)..(^)<223〉n殘基是2'-脫氧-2，-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><22>misc—feature<222>(13).7(14)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc一feature<222>(20).:(21)<223>n殘基為2，-脫氧鳥苷<400>22nnaaraiaaagacnncaagcnn21<210>23<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><221>misc—feature<222>(3)..(3)<223>n殘基是2'-脫氣-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(H).:(12)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc—feature<222>(16).:(17)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧咬<220><221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<400>23gcnngaagucnnuaannaann21<210>24<211>2<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20).7(2)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖鳥苷<400>24uu犯uuaaagacuucaagcnn21<210>25<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>修飾石綠<222>(1)"(21)<223>所有殘基是2'-脫氧-2'-氟-阿拉伯糖核苷酸<400>25gcttgaagtctttaattaagg21<210>26<2U>2<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc一feature<222>(20).7(20)<223>n殘基是2，-脫氧-2，-氟阿拉伯鳥苷<220><221>misc—feature<222>(21).:(21)<223>n殘基是2'-脫氧鳥苷<400>26uuaauuaaagacuucaagcnn21<210>27<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>合成寡核普酸<220><221>修飾4i^<222>(1)..(21)<223>所有殘基是2'-脫氧-2'-氟-阿拉伯糖核苷酸<400>27gcttgaagtctttaattaagg21<210>.28<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc—feature<222><223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc_feature<222>(5)"(S)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><22>misc—feature<222>(13).:(14)<223>n殘基是2，-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基為2'-脫氧烏苷<400>28nnaarmaaagacnncaagcnn:<210>29<211>21<2〗2>DNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>修飾^4&<222>(1)..(21)<223>所有殘基是2'-脫氧-2'-氟-阿拉伯糖核脊酸<400>29gcttgaagtctttaattaagg21<210>30<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc—feature<222>(20).:(21)<223>n殘基是2'-脫氧-2，-氟阿拉伯糖鳥苷<400>30uuaauuaaagacuucaagcnn21<210>31<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc一feature<222>(20):(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧咬<400>31acacccuaugaauaugagunn21<210>32<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核普酸<220><221>miscfeature<222>(20)..(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嗜啶<400>32acucauauucauagggugunn21<210>33<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核普酸<220><221>misc—feature<222>(20)7(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<400>33acacccuaugaauaugagunn21<210>34<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2，-脫氧-2，-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<400>34acucauauucauagggugunn2<210>35<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>修飾;錄<222>(1)..(21)<223>所有殘基是2，-脫氧-2'-氟-阿拉伯糖核苷酸<400>35acaccctatgaatatgagttt21<210>36<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><221>misc一feature<222>(20):(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<400>36acucauauucauagggugunn21<210>37<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>修飾4C^<222〉(1)..(21)<223>所有殘基是2，-脫氧-2，-氟-阿拉伯糖核苷酸<400>37acaccctatgaatatgagttt21<210>38<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧-2，-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<400>38acucauauucauagggugunn<210>39<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>miscfeature<222>(20)..(20)<223>n殘基是2'-脫氧胞核嘧啶<220><221>misc一feature<222>(21),7(21)<223>n殘基是2'-脫氧腺苷<400>39aagaacuugccuugauguann21<210>40<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核香酸<220><221〉(20)..(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<400>40uacaucaaggcaaguucuunn21<210>41<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>mise—feature<222>(20):(20;)<223>n殘基是2'-脫氧胞啶<220><221>misc一feature<222>(21).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧腺苷<400>41aagaacuugccuugauguann21<210>42<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核普酸<220><221><222><223>miscfeaturs(20)..(21)n殘基是2，-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<400>42uacaucaaggcaaguucuunn<2〗0>43<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>合成寡核香酸<220><221>修飾^tt<222>(1)..(21)<223>所有殘基是2'-脫氧-2'-氟-阿拉伯糖核苷酸<400>43aagaacttgccttgatgtaca21<210>44<211>21<22>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc—feature<222>(20):(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<400>44uacaucaaggcaaguucuunn21<210>45<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>修飾堿基<222>(1)..(21)<223>所有殘基是2'-脫氧-2，-氟-修飾阿拉伯糖核苷酸<400>45aagaacttgccttgatgtaca21<210>46<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220〉<221>misc—feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2，-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<400>46uacaucaaggcaaguucuunn21<210>47<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<400>47cccuacaccaagugauaaunn21<210>48<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嗜啶<400>48auuaucacuugguguagggnn21<210>49<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苦酸<220><221>misc一feature<222>(20).7(21)<223>n殘基是2'-脫氧胸腺嘧啶<400>49cccimc3ccaagug肌aaunn<210>50<211>21<212>RNA<213>人工<220><223>合成寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20).:(21)<223>n殘基是2'-脫氧-2'-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶<400>50Auuaucacuugguguagggnn權(quán)利要求1.一種用于以序列特異性的方式調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)，包括雙鏈雙螺旋，其中所述siRNA的至少一個核糖核酸核苷酸被阿拉伯糖修飾的核苷酸取代。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA,長度為15至30個核苦酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的siRNA,在3'末端和5'末端具有突出1至3個核苷酸的突出端。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的siRNA，其中所述阿拉伯糖修飾的核苷酸具有選自下列的2，取代基氟、羥基、氨基、疊氮基、烷基、烷氧基以及烷氧基烷基。5.根據(jù)權(quán)利要求4所迷的siRNA，其中所述烷基選自曱基、乙基、丙基、丁基以及官能化烷基；所述烷氧基選自曱氧基、乙氧基、丙氧基和官能化烷氧基；所述烷氧基烷基選自曱氧基乙基和乙氧基乙基。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的siRNA，其中所述官能化烷基選自乙氨基、丙氨基以及丁氨基且所述官能化烷氧基選自-0(CH2)q-R,其中q=2-4且-R是-腿2、-OCH3或-00^013基團(tuán)。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的siRNA,其中所述至少一個阿拉伯糖修飾的核普酸是2'-脫氧-2，-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的siRNA,其中所述至少一個阿拉伯糖修飾的核普酸是在siRNA的有義鏈上。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的siRNA,其中所述至少一個阿拉伯糖修飾的核苷酸是在siRNA的反義鏈上。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的siRNA,其中在所述有義鏈上的全部核苦酸被FANA取代。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的siRNA，其中所述至少一個阿拉伯糖修飾的核苷酸是至少一個所述突出端中的懸空核苷酸。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的siRNA,用于減少熒光素酶表達(dá)。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的siRNA，所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.1和2的石咸基序列。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA，所述雙螺旋的所述鏈具有選自下列的序列SEQIDNO.3和4、SEQIDNO.5和6、SEQIDNO.7和8、SEQIDNO.9和10、SEQIDNO.11和12、SEQIDNO.13和14、SEQIDNO.15和16、SEQIDNO.17和18、SEQIDNO.19和20、SEQIDNO.21和22、SEQIDNO.23和24、SEQIDNO.25和26、SEQIDNO.27和28以及SEQIDNO.29和30。15.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的siRNA,用于減少CCR3表達(dá)。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的siRNA，所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.31和32的堿基序列。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA，所述雙螺旋的所述鏈具有選自下列的序列SEQIDNO,33和34、SEQIDNO.35和36、或SEQIDNO.37和38。18.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的siRNA,用于減少呼吸道合胞病毒(RSV)病毒復(fù)制。19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的siRNA,所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.47和48的堿基序列。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA，所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.49和50的序列。21.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的siRNA,用于減少PDE4D表達(dá)。22.根據(jù)權(quán)利要求12所述的siRNA,所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.39和40的堿基序列。23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA,所述雙螺旋的所述鏈具有選自下列的序列:SEQIDNO.41和42、SEQIDNO.43和44、以及SEQIDNO.45和46。24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的siRNA,含有至少一種選自下列的核香酸間鍵磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、膦酸曱酯、硼烷磷酸酯以及其組合。25.—種用于增強(qiáng)siRNA的核酸酶穩(wěn)定性和靶基因抑制活性中至少一個的方法，包括用阿拉伯糖修飾的核苷酸置換所述siRNA中的至少一個核苦酸。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述阿拉伯糖修飾的核苷酸是2'-脫氧-2，-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。27.根據(jù)權(quán)利要求25至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述siRNA是雙鏈雙螺旋且在長度上具有15至30個核苷酸，且在3'末端和5，末端具有突出1至3個核苷酸的突出端。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述被置換的至少一個核苷酸在所述siRNA的有義鏈上。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述被置換的至少一個核苦酸在所述siRNA的反義鏈上。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中在所述有義鏈上的全部核苷酸被置換。31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述被置換的至少一個核苷酸是在所述突出端上。32.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.1和2的堿基序列并且所述siRNA雙鏈雙螺旋降低焚光素酶表達(dá)。33.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.31和32的序列并且所述siRNA降低CCR3表達(dá)。34.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.39和40的序列并且所述siRNA降低PDE4D表達(dá)。35.根據(jù)權(quán)利要求25至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述雙螺旋的所述鏈具有SEQIDNO.47和48的序列并且所述siRNA減少呼吸道合胞病毒(RSV)復(fù)制。36.—種藥用組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的siRNA以及藥學(xué)上可接受的載體。37.—種根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的siRNA在制備調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的藥物中的用途。38.—種根據(jù)權(quán)利要求12至24中任一項(xiàng)所述的siRNA在制備減少熒光素酶的表達(dá)的藥物中的用途。39.—種根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的siRNA在制備減少CCR3的表達(dá)的藥物中的用途。40.—種根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的siRNA在制備預(yù)防或治療呼吸道合胞病毒(RSV)感染的藥物中的用途。41.一種根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的siRNA在制備降低PDE4D表達(dá)的藥物中的用途。42.—種用于調(diào)節(jié)需要所述調(diào)節(jié)的患者中的靶基因表達(dá)的方法，包括給予治療上有效量的權(quán)利要求36所述的藥用組合物。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述耙基因是CCR3且所述藥用組合物包含根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的siRNA。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述靶基因是用于呼吸道合胞病毒(RSV)復(fù)制的基因且所述藥用組合物包括根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的siRNA。45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述靶基因是PDE4D且所述藥用組合物包含沖艮據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的siRNA。46.—種商業(yè)包裝，包含根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物以及關(guān)于所述組合物用于調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的用途的說明書。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的商業(yè)包裝，其中所述靶基因是CCR3且所述藥用組合物包含根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的siRNA。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的商業(yè)包裝，其中所述靶基因是用于呼吸道合胞病毒(RSV)復(fù)制的基因且所述藥用組合物包含根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的siRNA。49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的商業(yè)包裝，其中所述靶基因是PDE4D且所述藥用組合物包含根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的siRNA。全文摘要本發(fā)明提供含有至少一個抑制基因表達(dá)的阿拉伯糖修飾的核苷酸的小干擾核糖核酸雙螺旋(siRNA)。在一個實(shí)施方案中，這些雙螺旋含有核糖核苷酸，其中至少一個阿拉伯糖修飾的核苷酸是2′-脫氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。文檔編號A61P31/12GK101351231SQ200680050122公開日2009年1月21日申請日期2006年10月26日優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日發(fā)明者M(jìn)·達(dá)姆哈,N·費(fèi)拉里申請人:托皮根藥品公司