人工生物發(fā)光酶的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001][相關(guān)申請的相互參照][0002]本申請主張基于2012年10月26日提出的日本國專利申請第2012-237043和2012年10月26日提出的日本國專利申請第2012-236872(它們公開的全部內(nèi)容通過援引加入本說明書）的優(yōu)先權(quán)。[0003]本發(fā)明涉及以來自海洋動物的生物發(fā)光酶的共同的遺傳信息為基礎(chǔ)來開發(fā)以高亮度顯示穩(wěn)定的生物發(fā)光的人工生物發(fā)光酶的技術(shù)。并且，本發(fā)明涉及在進行利用生物發(fā)光的檢測時所必需的最佳反應(yīng)溶液?！?br>背景技術(shù)：
】[0004]關(guān)于生物發(fā)光酶（熒光素酶），最近報道了大量的新的生物發(fā)光酶的創(chuàng)立。例如，由Promega公司報道了來自深海龍蝦的新的發(fā)光酶的創(chuàng)立（非專利文獻1)。該酶與現(xiàn)有的來自海腎的發(fā)光酶（Renillaluciferase;RLuc)相比，以1/2的分子量（19kD)顯示出1〇〇倍的發(fā)光亮度。并且，由茂里等人報道了11種來自浮游生物的生物發(fā)光酶（非專利文獻20)。這些發(fā)光酶的一部分被評價為顯示出與RLuc同樣的亮度。[0005]此外，以前就發(fā)現(xiàn)了屬于Augaptiloideasuperfamily的深海發(fā)光動物（非專利文獻2)。此外還發(fā)現(xiàn)了來自屬于Metridinidaefamily的Gaussiaprinceps的發(fā)光酶（GLuc)和來自Metridialonga的發(fā)光酶（MLuc)、來自Metridiapacifica的發(fā)光酶類(MpLucl，MpLuc2)(非專利文獻15、19、21)。[0006]另一方面，用于提高這些發(fā)光酶的亮度和發(fā)光穩(wěn)定性的研宄也在進行中。Loening等人通過在RLuc中導入氨基酸變異的方法，創(chuàng)立了高亮度且穩(wěn)定的的RLuc變異體（非專利文獻14)。在該研宄中，為了特定變異的導入部位，使用了"共有序列驅(qū)動突變的策略"（consensussequence-drivenmutagenesisstrategy)(非專利文獻13)。并且，本研宄者以親水性氨基酸分布圖為基礎(chǔ)，通過假定酶活性部位并導入變異的方法，成功地實現(xiàn)了來自深海發(fā)光動物的發(fā)光酶GLuc、MpLucl和MLuc的高亮度化、高發(fā)光穩(wěn)定化（非專利文獻11)。但是，在各種生物檢測中利用尚不能令人滿意，尋求進一步增加亮度等發(fā)光特性的改良。[0007]本發(fā)明的發(fā)明人以前提出了通過將一個發(fā)光酶的序列分成兩部分，將前和后的序列以相似氨基酸為中心進行比對，利用用于得到關(guān)于其發(fā)光特性的指針的探宄（單序列比對，singlesequencealignment:SSA)，制作熱力學上穩(wěn)定的發(fā)光酶序列的方案（非專利文獻3)。該方法基于來自海洋動物的發(fā)光酶存在2個酶活性部位的前提。通過將這2個酶活性部位以相似氨基酸為中心進行比對，能夠簡便地比較前后酶活性部位的相似性。由于如上所述的氨基酸的頻率與熱力學穩(wěn)定性相關(guān)的假說，希望通過提高該前后的序列間的相似性來制作熱力學上穩(wěn)定的的發(fā)光酶序列。[0008]另一方面，還開發(fā)出了使用上述的生物發(fā)光酶作為"報告分子"（r印orter)的各種各樣的應(yīng)用方法。Niu等人將這樣的將生物發(fā)光酶作為"報告分子"的生物檢測分為"basic(基礎(chǔ)的）'"inducible(可誘導的）"、"activatable(可活化的）"這三類（非專利文獻16)。該分類是利用報告基因的特性的分類。首先，"basic"與"inducible"的差異是由于報告分子的表達由啟動子控制、并且表達量是否存在差異所引起的差異。帶有后面詳細描述的生物發(fā)光酶的抗體相當于Basic，生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bioluminescenceresonanceenergytransfer，BRET)法和雙雜交檢測屬于"inducible"的分類。另一方面，屬于"activatable"分類的報告基因探針具有報告分子本身能動性地感應(yīng)配體刺激而發(fā)光的特征。后面詳細描述的蛋白質(zhì)互補檢測（proteincomplentationassay，PCA)、蛋白質(zhì)剪切檢測（proteinsplicingassay，PSA)和單分子型生物發(fā)光探針、發(fā)光膠囊等屬于"activatable"的分類。[0009]對于將這些生物發(fā)光酶作為"報告分子"的生物檢測（以下也簡稱為"報告分析法"）中的發(fā)光探針，以上述的新的發(fā)光酶為基礎(chǔ)，活躍地進行著各種各樣的發(fā)光探針的開發(fā)。一直以來，本發(fā)明的發(fā)明人就進行著設(shè)計利用獨特的分子設(shè)計技術(shù)的生物發(fā)光成像的研宄開發(fā)。具體而言，開發(fā)了利用蛋白質(zhì)剪切法來測定轉(zhuǎn)錄因子的核內(nèi)轉(zhuǎn)移或細胞質(zhì)內(nèi)非染色體組的蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間相互作用的方法（非專利文獻7、8)，開發(fā)出將信號識別和生物發(fā)光所需要的所有的要素聚集在1個分子內(nèi)的形態(tài)的單分子型生物發(fā)光探針（非專利文獻4、6)。之后，將該探針多色化，使其發(fā)展為能夠同時進行多個信號傳遞過程的成像（非專利文獻12)。并且，作為用于提高生物發(fā)光探針本身的配體感受性的方法，開發(fā)了使用循環(huán)排列取代（非專利文獻9)和使用低分子量的發(fā)光酶的分子設(shè)計技術(shù)（非專利文獻12)。這些研宄都作為高效地測量細胞、非細胞體系內(nèi)的分子現(xiàn)象的手段使用。[0010]在探索細胞內(nèi)和細胞外的分子現(xiàn)象的主要的方法中，作為比發(fā)光成像更廣泛地使用的方法，有焚光成像。但是，由于焚光蛋白為自發(fā)焚光（autoluminescence)，所以背景高，需要外部光源，需要熒光顯微鏡那樣的大的裝置和精密的濾光系統(tǒng)。并且，存在直至熒光顯色團成熟最少也需要數(shù)小時到數(shù)天的問題。此外，在使用熒光顯微鏡時，由于一次能夠觀察的細胞數(shù)有限度，定量性存在問題（非專利文獻8)。[0011]相對于此，在使用生物發(fā)光酶的發(fā)光成像的情況下，盡管具有許多優(yōu)點，但是它比熒光成像難以利用的最大的原因在于生物發(fā)光酶的亮度低。由于生物發(fā)光酶為低亮度，需要高靈敏度的測量裝置，不適合單一細胞成像或小細胞器的探索等。[0012]此外，對于熒光蛋白，多色熒光蛋白的研宄充分地開展著，得到了大量的關(guān)于其顯色原理的見解，利用這些研宄成果，開發(fā)了大量的具有多種多樣熒光特性的熒光蛋白，而對于生物發(fā)光酶，顯示多種顏色的生物發(fā)光的酶本身的數(shù)量缺乏。盡管作為發(fā)光的多色化的優(yōu)點，提出了（i)多信號的同時測量、（ii)長波長發(fā)光的生物體組織透過性的優(yōu)點，但是，關(guān)于生物發(fā)光酶，迄今為止尚沒有開展基于其發(fā)光原理的體系的多色化研宄。[0013]由此，強烈期望高性能生物發(fā)光酶的新的創(chuàng)立、高亮度化和發(fā)光強度的穩(wěn)定化、耐熱性、耐鹽性。并且，用于同時使發(fā)光色向長波長側(cè)迀移的體系的研宄也是緊急的課題。[0014]此外，生物檢測中選擇、使用適當?shù)姆磻?yīng)溶液是左右結(jié)果的重要條件。特別是作為重視反應(yīng)溶液選擇的生物檢測，提出了（1)報告基因檢測（reporter-geneassay)、（2)雙雜交檢測（two-hybridassay)、（3)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay)、（4)放射免疫檢測（radioimmunoassay、RIA)等（非專利文獻22、非專利文獻23)。[0015]此外，作為其他的生物檢測，有使用所謂的"分子探針"的生物檢測法，反應(yīng)溶液的選擇在很大程度上左右結(jié)果。例如，開發(fā)了使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用通過顯色成像的方法，（1)利用熒光蛋白間熒光共振能量轉(zhuǎn)移的FRET法（非專利文獻24);(2)以將熒光蛋白或發(fā)光蛋白質(zhì)分成兩部分、利用該蛋白質(zhì)片段間的再結(jié)合的發(fā)光恢復為特征的雙分子型蛋白質(zhì)互補法（2-molecule-formatproteincomplementationassay(PCA))等（非專利文獻25)。本發(fā)明的發(fā)明人也開發(fā)了利用蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)的檢測法（蛋白質(zhì)剪切檢測，proteinsplicingassay(PSA))(非專利文獻8)。[0016]之后，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了⑴單分子型生物發(fā)光探針(integrated-molecule-formatbioluminescentprobe，或簡稱為single-chainprobe)，能夠檢測單一融合分子內(nèi)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用（非專利文獻6、專利文獻4)，作為其派生方法，開發(fā)了（2)以使發(fā)光酶的基因序列為循環(huán)排列取代（circularpermutation)為特征的生物發(fā)光探針（非專利文獻8、專利文獻3)。并且，本發(fā)明的發(fā)明人還開發(fā)了（3)以通過人為地使發(fā)光酶變形而引起的酶活性的差異為指標的分子變形傳感器（moleculartension-indexedbioluminescentprobe)(非專利文獻26、專利文獻5)〇[0017]最近，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了將報告基因檢測與單分子型生物發(fā)光探針組合的多重識別型生物發(fā)光探針（multiplerecognition-typebioluminescentprobe)(非專利文獻27)。該探針以對一個檢測物質(zhì)進行2次感應(yīng)為特征。還通過組合2色的單分子型生物發(fā)光探針，開發(fā)了多色生物發(fā)光成像探針試劑盒（專利文獻25)。該探針以能夠?qū)崿F(xiàn)待檢體的多方面的生理活性的多色成像為特征。[0018]生物檢測必須需要反應(yīng)溶液，根據(jù)其發(fā)光信號的種類，大致分成（1)利用熒光蛋白的方法、和（2)使用生物發(fā)光酶（熒光素酶）的方法。在利用熒光蛋白的情況下，除了由于自發(fā)熒光使得背景非常高，還需要外部光源。存在為了測定熒光需要安裝有精密的分光濾波器的比較大型的發(fā)光檢測器（例如熒光顯微鏡）的問題（非專利文獻8)。另一方面，在生物發(fā)光的方法的情況下，雖然不會出現(xiàn)上述問題，但是光比熒光弱，存在必須需要基質(zhì)的問題。并且，由于依賴于發(fā)光酶，所以存在發(fā)光量容易因鹽濃度、溫度、PH、重金屬離子的濃度等而發(fā)生變動的問題。以熒光為基礎(chǔ)的方法存在同樣的問題。因此，為了固定pH使發(fā)光反應(yīng)條件最優(yōu)化，在熒光法、發(fā)光法均使用寬范圍的反應(yīng)溶液。[0019]根據(jù)這樣的背景，在現(xiàn)有的基于熒光或生物發(fā)光的各種檢測方法中確定最佳的緩沖條件是左右檢測方法能否成功的重要的決定因素。此外，根據(jù)生物檢測的特征，強烈需求反應(yīng)溶液和添加物的最優(yōu)化，以得到充分的檢測靈敏度、選擇性、信號穩(wěn)定性。[0020]在反應(yīng)溶液（檢測緩沖液）中，為了提高檢測效果，使用著各種各樣的添加物。作為添加物所要求的功能，要求：（1)阻礙由于蛋白酶引起的蛋白質(zhì)的分解，（2)抑制干擾物質(zhì)的影響，（3)通過作為緩沖溶液發(fā)揮作用，支持穩(wěn)定的的信號發(fā)送，（4)平穩(wěn)地破壞細胞膜等，準備同質(zhì)（homogenous)的檢測條件，（5)使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化，（6)不阻礙作為發(fā)光反應(yīng)的核心的探針的性能。[0021]在反應(yīng)溶液中的主要的添加物中，作為鹽類，添加NaCl、KCl、（NH4)2S04等；作為SH試劑，添加巰基乙醇、DTT等；作為多元醇，添加甘油或蔗糖等；作為螯合試劑，添加EGTA、EDTA等。[0022]作為表面活性劑，添加聚氧乙稀（10)辛基苯基醚（polyoxyethylene(10)octylphenylether，TritonX-100，TX100)、NonidetP_40(NP40)、聚氧乙稀脫水山梨醇單月桂酸醋（polyoxyethylenesorbitanmonolaurate，Tween20，TW20)、聚氧乙稀脫水山梨醇單油酸醋（polyoxyethylenesorbitanmonooleate，Tween80，TW80)、聚氧乙?。?0)十六烷基釀（polyoxyethylene(20)cetylether，Brij58)、十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS)等。在選擇表面活性劑時，考慮親水度的程度時為TW20>Brij58>TW80>TX100>NP40的順序、考慮表面活性度的程度時為NP40>TX100>Brij58>TW20>TW80的順序，適當選擇。[0023]作為為了阻止蛋白質(zhì)分解而使用的蛋白酶抑制劑（ProteaseInhibitor)，使用抑蛋白酶肽（分子量6.5kD)、亮抑酶肽（leup印tin，分子量：427)、胃蛋白酶抑制劑A(pepstatin，分子量：686)、苯甲基橫酰氯（phenylmetylsulfonylFluoride，PMSF，分子量：174)、抗蛋白酶（Antipain，分子量：605)、胰凝乳蛋白酶抑制劑（chymostatin，分子量：608)等。此外，以PefablocSC(AEBSF，240Da)、DFP(184Da)、p-APMSF(216Da)、STI(20,lOODa)、亮抑酶肽（Leup印tin，460Da)、N-甲苯磺?；?L-苯基丙氨酸氯甲基酮（N-Tosyl_L-phenylalaninechloromethylketone)、3,4-二氯異香豆素(3,4-dichloroisocoumarin，215Da)、EDTA-Na2(372Da)、EGTA(380Da)、1，10-鄰菲咯啉(1，lCKphenanthroline，198Da)、磷酰二肽（phosphoramidon，580Da)、二硫代雙（2-氨基-4-甲基戊燒）（Dithiobis(2-amin〇-4_methylpentane))、E-64(357Da)、半脫氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin)、丁苯抑制素（bestatin)、表苯丁抑制素鹽酸鹽（Epibestatinhydrochloride)、抑蛋白酶肽（aprotinin)、二甲胺四環(huán)素（minocycline)、ALLN(384Da)等的蛋白質(zhì)分解抑制劑的方式利用。[0024]并且，有時也添加以下的功能性化學物質(zhì)。通過添加鉬酸鈉，能夠獲得使受體穩(wěn)定化、防止分解的作用。甘油可以作為蛋白質(zhì)的封閉劑等使用，二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT)作為還原劑使用。[0025]另外，作為緩沖劑，可以使用對甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、鄰苯二甲酸鹽、甘氨酸、反式烏頭酸、甲酸、3,3-二甲基戊二酸、苯乙酸、乙酸鈉、琥珀酸、二甲胂酸鈉、馬來酸氫鈉、馬來酸、磷酸鈉、KH2P04、咪唑、2,4,6-三甲基吡啶、三乙醇胺鹽酸鹽、巴比妥鈉(sodium5,5_diethylbarbiturate)、N-乙基嗎啉、焦磷酸鈉、三（輕甲基）氨基甲燒、N，N-二羥乙基甘氨酸（bicine)、2_氨基-2-甲基丙烷-1，3-二醇、二乙醇胺、對苯酚磺酸鉀、硼酸、硼酸鈉、氨、甘氨酸、Na2C03/NaHC03、硼酸鈉、或者它們的組合。[0026]基于這樣的背景，在反應(yīng)溶液中添加的添加物的選擇是極為重要的，為了完成目前的生物檢測，強烈謀求適當選擇添加物以及反應(yīng)溶液的最優(yōu)化。[0027]另一方面，為了進行現(xiàn)有的生物檢測，還存在必須使用幾種反應(yīng)緩沖液的問題，成為方法繁瑣和成本增加的原因。并且，也是使用者操作工序繁瑣的原因。[0028]例如，在報告基因檢測的情況下，首先，在微孔板上的培養(yǎng)細胞中導入包含報告基因的質(zhì)粒。之后，進行12小時左右的配體刺激，在棄去培養(yǎng)基后，利用磷酸鹽緩沖液（PBS)緩沖（第一次必需的緩沖）對細胞進行一次清洗。接著，利用細胞裂解緩沖液（第二次必需的緩沖）將微孔板上的細胞裂解20分鐘。將該細胞裂解緩沖液與加入了基質(zhì)的檢測緩沖液（第三次必需的緩沖）以一定比例混合，之后立即測定發(fā)光值。即，需要至少三次緩沖和長的測定工序。[0029]此外，在使用"單分子型生物發(fā)光探針"的情況下，也必須經(jīng)歷同樣的測定工序。首先，在微孔板上經(jīng)過培養(yǎng)的真核細胞中導入"單分子型生物發(fā)光探針"的表達載體，再培養(yǎng)16小時。對該細胞進行20~30分鐘的配體刺激，最后棄去培養(yǎng)基，利用PBS緩沖（第一次必需的緩沖）清洗1~2次。利用裂解緩沖液（第二次必需的緩沖）對余下的細胞進行20分鐘處理。之后，在裂解液中與加入了基質(zhì)的檢測緩沖液（第三次必需的緩沖）以相應(yīng)的比例混合，引發(fā)發(fā)光反應(yīng)。立即利用光度計測定發(fā)光值（非專利文獻26、非專利文獻27)。[0030]在上述任意一種現(xiàn)有方法中，都需要使用多種反應(yīng)緩沖液，需要繁瑣的測定工序和長時間，因而，強烈謀求進行改善以節(jié)省測定工序并縮短時間。[0031]現(xiàn)有技術(shù)文獻[0032]專利文獻[0033]專利文獻1:美國專利第8124424號說明書[0034]專利文獻2:美國專利第8043827號說明書[0035]專利文獻3:美國公開號US-2009-0269781(A1)[0036]專利文獻4:國際公開W02008/084869(國際申請?zhí)朠CT/JP2008/050370)[0037]專利文獻5:日本特開2011-067190號公報[0038]專利文獻6:美國公開號US-2009-0123954(A1)[0039]非專利文獻[0040]非專利文獻1:Hall,M.P.，Unch,J.，Binkowski,B.F.，etal.ACSChem.Biol.720121848.[0041]非專利文獻2:Herring，P.J.，Latz,M.I.，Bannister,N.J.，etal.MarineEcology-ProgressSeries,941993297.[0042]非專利文獻3:Kim,S.B.ProteinEngineeringDesign&Selection,252012261.[0043]非專利文獻4:Kim,S.B.,Awais,M.,Sato,M.,etal.Anal.Chem.,7920071874.[0044]非專利文獻5:Kim,S.B.,Kanno,A.,Ozawa,T.,etal.ACSChem.Biol.,22007484.[0045]非專利文獻6:Kim,S.B.,Otani,Y.,Umezawa,Y.,etal.Anal.Chem.,7920074820.[0046]非專利文獻7:Kim,S.B.,Ozawa,T.,Umezawa,Y.Anal.Chem.,7720056588.[0047]非專利文獻8:1(;[111，3.13.，02&￥&，1'.，此七&11&匕6,3.，6七&1.?1'0。.似1:1.八。&(1.3。;[.U.S.A.,101200411542.[0048]非專利文獻9:Kim,S.B.,Sato,M.,Tao,H.BioconjugateChem.,1920082480.[0049]非專利文獻10:Kim,S.B.,Sato,M.,Tao,H.Anal.Chem.,81200967.[0050]非專利文獻11:Kim,S.B.,Suzuki,H.,Sato,M.,etal.Anal.Chem.,8320118732.[0051]非專利文獻12:Kim,S.B.,Umezawa,Y.,Kanno,K.A.,etal.ACSChem.Biol.，32008359.[0052]非專利文獻13:Lehmann,M.，Loch,C.，Middendorf,A.，etal.ProteinEng.，152002403.[0053]非專利文獻14:Loening,A.M.，Wu,A.M.，Gambhir,S.S.Nat.Methods,42007641.[0054]非專利文獻15:Markova，S.V.，Golz，S.，F(xiàn)rank,L.A.，etal.J.Biol.Chem.，27920043212.[0055]非專利文獻16:Niu,G.，Chen,X.Y.Theranostics,22012413.[0056]非專利文獻17:0kita,K.，Ichisaka,T.，Yamanaka,S.Nature,4482007313.[0057]非專利文獻18:Papworth,C.，Bauer,J.C.，Braman,J.，etal.Strategies,919963.[0058]非專利文獻19:Takenaka,Y.，Masuda,H.，Yamaguchi,A.，etal.Gene,425200828.[0059]非專利文獻20:Takenaka,Y.，Yamaguchi,A.，Tsuruoka,N.，etal.MolecularBiologyandEvolution,2920121669.[0060]非專利文獻21:Verhaegent，M.，Christopoulos,T.K.Anal.Chem.，7420024378.[0061]非專利文獻22:S.B.Kim,H.Tao,andY.Umezawaeds.，"CellularandBiomo1ecu1arRecognition^,EditedbyR.Jelinek,p.299.((2009)(ffiley-VCH,Darmstadt)).[0062]非專利文獻23:W.LiandN.B.Caberoy,AppliedMicrobiologyandBiotechnology85(4),909(2010).[0063]非專利文獻24:A.Miyawaki,T.Nagai,andH.Mizuno,Curr.Opin.Chem.Biol.7(5),557(2003).[0064]非專利文獻25:5.11\1;[(3]111；[01^，？.11.￡&1'，0.1^11(1^6七31.，]\^1：]1.Enzymol.470,335(2010).[0065]非專利文獻26:S.B.Kim,M.Sato,andH.Tao,BioconjugateChem.20(12),2324(2009).[0066]非專利文獻27:S.B.Kim,Y.Takenaka,andM.Torimura,BioconjugateChem.22(9),1835(2011).[0067]非專利文獻28:S.B.KimProteinEng.Des.Sel.,25(6),261-269(2012)?[0068]非專利文獻29:S.B.Kim,Y.Umezawa,H.TaoAnal.Sci.25,1415-1420(2009)?【
發(fā)明內(nèi)容】[0069]發(fā)明要解決的技術(shù)問題[0070]本發(fā)明的主要目的在于，通過基于大量生物發(fā)光酶的氨基酸序列的氨基酸相似性的比對和頻率高的氨基酸序列的提取，提供一種高亮度、穩(wěn)定且能夠?qū)崿F(xiàn)長波長發(fā)光的新的人工生物發(fā)光酶（ALuc)。其目的還在于確立使用該ALuc的各種報告分析法。[0071]并且，本發(fā)明意在提供使當前第1頁1 2 3 4 5 6