用于生物檢測(cè)的反應(yīng)條件最優(yōu)化的反應(yīng)溶液及其添加 物，通過(guò)該反應(yīng)溶液的最優(yōu)化，無(wú)需現(xiàn)有技術(shù)中的使用多種反應(yīng)溶液（細(xì)胞裂解緩沖液 (Lysisbuffer)和檢測(cè)緩沖液（assaybuffer)等）的繁瑣的程序，能夠迅速且簡(jiǎn)便地進(jìn)行 檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)測(cè)定工序的縮減，能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏度且穩(wěn)定的發(fā)光測(cè)定。
[0072]S卩，本發(fā)明的目的還在于，提供一種省略了特別是現(xiàn)有技術(shù)中將利用生物發(fā)光的 生物檢測(cè)應(yīng)用于活細(xì)胞時(shí)所必須的細(xì)胞裂解工序，即使基于配體刺激而直接進(jìn)行發(fā)光測(cè) 定、也能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏度的生物檢測(cè)的生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液。
[0073] 用于解決技術(shù)問(wèn)題的手段
[0074] 本發(fā)明的發(fā)明人為了提供新的人工生物發(fā)光酶（ALuc)，著眼于來(lái)自海洋動(dòng)物的生 物發(fā)光酶。
[0075] 在全部生物發(fā)光酶中，只要是來(lái)自海洋動(dòng)物的生物發(fā)光酶，序列的相似性較高，具 有在相同或類(lèi)似基質(zhì)（coelenterazine，腔腸素）中發(fā)光的共同點(diǎn)。本研宄人員以前發(fā)現(xiàn) 了通過(guò)親水性區(qū)域檢索（hydrophilicitysearch)而特定變異部位（mutationregion) 的方法（非專(zhuān)利文獻(xiàn)11)，但是，該方法（1)僅僅是推定粗略的變異部位的方法，不適合特 定高精度的變異位置。并且，（2)通過(guò)親水性區(qū)域檢索，可以看到多個(gè)親水性區(qū)域，未表明 關(guān)于宄竟哪個(gè)區(qū)域是應(yīng)該導(dǎo)入變異的區(qū)域的看法。并且，（3)基于該研宄，應(yīng)用點(diǎn)變異法 (pointmutation)，開(kāi)發(fā)出了高亮度的新的發(fā)光酶，但是這些新酶存在基質(zhì)的消耗（也稱(chēng)為 更新率，turn-overrate)劇烈的缺點(diǎn)。在應(yīng)用于發(fā)光探針等的情況下，在亮度方面，僅僅 是2至5倍左右的改善，仍然沒(méi)有解決應(yīng)用于生物檢測(cè)的亮度問(wèn)題。（4)此外，還存在根據(jù) 反應(yīng)緩沖液的成分，發(fā)光特性有大幅度改變的問(wèn)題。例如，在Promega制的反應(yīng)緩沖液中看 到亮度的增加，而在紐英倫生物技術(shù)公司（NewEnglandBiolabs，NEB)制的反應(yīng)緩沖液和 培養(yǎng)基等中卻沒(méi)有看到那種程度的亮度和穩(wěn)定性的增加。
[0076] 并且，上述的開(kāi)發(fā)新酶時(shí)作為主要的改變手段使用的點(diǎn)變異法（pointmutation) 是極其耗費(fèi)時(shí)間和勞動(dòng)力的手法。例如，在由200個(gè)氨基酸（aminoacid;AA)序列構(gòu)成的 發(fā)光酶的情況下，命中1個(gè)變異的概率僅為1/4000 (200個(gè)AAX20種AA)。也謀求用于解決 這種低效性的特殊的構(gòu)想的轉(zhuǎn)換。
[0077] 因此，本發(fā)明的發(fā)明人不拘泥于上述研宄背景，仔細(xì)研宄各海洋動(dòng)物發(fā)光酶的現(xiàn) 有的技術(shù)，想到能夠樹(shù)立全新的人工生物發(fā)光酶。該方法能夠概括為以下4點(diǎn)：
[0078] (1)首先，關(guān)于公用數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI)上的多年來(lái)積累的海洋生物發(fā)光酶的氨基酸序 列，是在長(zhǎng)年進(jìn)化過(guò)程中勝利留下來(lái)的結(jié)果，基于這樣的想法，進(jìn)行了如下工作。首先，對(duì)于 NCBI上的海洋生物發(fā)光酶序列，以類(lèi)似的氨基酸中心進(jìn)行比對(duì)，基于該比對(duì)，以獨(dú)特的思想 提取了頻率高的氨基酸。由此，完成了大量現(xiàn)有技術(shù)中完全不存在的新的人工生物發(fā)光酶 (ALuc)序列。在現(xiàn)有技術(shù)中雖然存在大量進(jìn)行氨基酸比對(duì)的報(bào)道，但是，這種現(xiàn)有的氨基酸 比對(duì)的目的在于探索變異位置。因此，該方法被稱(chēng)為共有序列驅(qū)動(dòng)突變的方法（consensus sequence-drivenmutagenesisstrategy)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)13)。而本發(fā)明的發(fā)明人獨(dú)立地解 釋該氨基酸序列的比對(duì)，并進(jìn)行了詳細(xì)的研宄。其結(jié)果，想到了難道不能通過(guò)氨基酸序列的 比對(duì)來(lái)創(chuàng)立前所未有的人工發(fā)光酶的氨基酸序列群的技術(shù)構(gòu)思。
[0079] (2)進(jìn)一步進(jìn)行了下述研宄。首先，本發(fā)明的發(fā)明人以前表明了1個(gè)生物發(fā)光酶存 在2個(gè)酶活性部位的觀點(diǎn)，作為其證據(jù)，將2個(gè)結(jié)構(gòu)域重疊進(jìn)行了比對(duì)（非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。本 發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步擴(kuò)展該想法，不僅是將1個(gè)氨基酸序列分成2個(gè)單純地進(jìn)行比對(duì)，而是 以在創(chuàng)立新的人工發(fā)光酶的氨基酸序列時(shí)利用為方向，進(jìn)行了構(gòu)思的轉(zhuǎn)換。首先，將由NCBI 獲得的來(lái)自發(fā)光橈腳類(lèi)的全部的生物發(fā)光酶的氨基酸序列在任意的位置分成2個(gè)。將前和 后的結(jié)構(gòu)域重疊進(jìn)行比對(duì)，之后，比較氨基酸序列中相互對(duì)應(yīng)的氨基酸，以提高相似性為方 向確定氨基酸序列。利用該方法，確定了能夠成為新的人工發(fā)光酶的大量的氨基酸序列。
[0080] (3)并且，進(jìn)行研宄，使得在確定上述人工發(fā)光酶的氨基酸序列時(shí)，為了在序列的 一定間隔導(dǎo)入限制酶部位，有意圖地加入不符合序列間相似性的原則的氨基酸，以使得今 后的基因重組更為容易。
[0081] (4)通過(guò)利用PSORTII研宄而人工制作的N末端側(cè)的序列特性，能夠通過(guò)計(jì)算機(jī)模 擬（insilico)進(jìn)行定位預(yù)測(cè)。通過(guò)利用預(yù)測(cè)這種序列的行為的公用的軟件，能夠提高序 列有效工作的概率。
[0082] 通過(guò)這種人工生物發(fā)光酶的新的合成，目的在于創(chuàng)立前所未有的具有高亮度、向 長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)迀移和發(fā)光穩(wěn)定性、耐熱性、耐鹽性的新物種。
[0083] 具體而言，基于氨基酸相似性，對(duì)NCBI或文獻(xiàn)等公布的來(lái)自浮游生物的發(fā)光酶 的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以共同的氨基酸為中心確定一系列的新的氨基酸序列（實(shí)施 例1 一 1)?；谠撔蛄?，為了使遺傳密碼子在來(lái)自小鼠的動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，應(yīng)用在 小鼠基因常見(jiàn)的密碼子進(jìn)行人工基因的合成，將該人工基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 (pcDNA3. 1⑴），合成一系列新的表達(dá)載體。將該一系列的載體分別導(dǎo)入來(lái)自非洲綠猴腎臟 的C0S-7細(xì)胞，研宄其亮度、發(fā)光穩(wěn)定性、長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)迀移度，結(jié)果確認(rèn)了 ：利用部分的人工合 成基因，能夠合成極高亮度、穩(wěn)定、且具備耐熱性、顯示出長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)迀移的發(fā)光光譜的發(fā)光 酶。
[0084] 利用市面上銷(xiāo)售的基質(zhì)試劑盒確認(rèn)合成的一系列的人工生物發(fā)光酶（ALuc)的相 對(duì)的亮度（實(shí)施例1 一 2)，對(duì)于亮度高的ALuc類(lèi)的發(fā)光穩(wěn)定性，以發(fā)光強(qiáng)度的隨時(shí)間的變 化為指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)（實(shí)施例1 一 3)。并且，研宄亮度和發(fā)光穩(wěn)定性好的ALuc類(lèi)的耐熱性和 細(xì)胞外分泌能力（實(shí)施例1 一 4)，對(duì)于特別有希望的ALuc類(lèi)測(cè)定其發(fā)光光譜，明確長(zhǎng)波長(zhǎng) 側(cè)迀移的程度（實(shí)施例1 一 5)。比較本發(fā)明中提供的ALuc類(lèi)與現(xiàn)有的發(fā)光酶的相似性，結(jié) 果可以確認(rèn)，與任意現(xiàn)有的發(fā)光酶相比，同一性最多也僅為83%，是完全不同的新的人工生 物發(fā)光酶（實(shí)施例1 一 6)。
[0085] 并且，對(duì)將上述發(fā)光驗(yàn)證過(guò)程中獲得的一系列的高性能人工生物發(fā)光酶（ALuc) 作為報(bào)告蛋白的各種"報(bào)告分析法"進(jìn)行研宄，在該過(guò)程中，開(kāi)發(fā)出了"發(fā)光膠囊"這樣的新 概念的生物發(fā)光可視化探針。該探針通常定位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，基質(zhì)和氧的供給順利，因而 與其他的定位于任意的小細(xì)胞器的探針相比，能夠?qū)崿F(xiàn)高亮度發(fā)光成像。并且，由于定位于 細(xì)胞膜，能夠迅速響應(yīng)外部的毒性物質(zhì)而使發(fā)光值發(fā)生變化（實(shí)施例1 一 7和實(shí)施例1 一 8)。作為該探針成功工作的理由，是因?yàn)橛行У仂`活運(yùn)用了ALuc本身所固有的性質(zhì)（經(jīng)由 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移的分泌信號(hào)（secretionpeptide，SP))。并且，該探針能夠在其內(nèi)部 插入作為載入物的蛋白質(zhì)（肽），因而能夠?qū)⑷魏蔚鞍踪|(zhì)（肽）運(yùn)送到細(xì)胞膜。為了進(jìn)一 步利用導(dǎo)入了該發(fā)光膠囊基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)毒性評(píng)價(jià)，嘗試制作了新的發(fā)光器 件（實(shí)施例1 一 11)。該器件具備分光濾光片、微型載物臺(tái)（MicroSlideHolder)、透鏡帽 (mirrorcap)、光電倍增管（photomultipliertube，PMT)等，通過(guò)將導(dǎo)入了新的合成基因 (ALuc)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞暴露在化學(xué)物質(zhì)中，利用該器件測(cè)定此時(shí)發(fā)出的光，由此能夠高效地進(jìn) 行毒性評(píng)價(jià)（實(shí)施例1 一 11、實(shí)施例1 一 12、實(shí)施例1 一 13)。
[0086] 接著，將上述新的合成發(fā)光酶（ALuc)作為報(bào)告蛋白，搭載于真核細(xì)胞雙雜交檢測(cè) (哺乳動(dòng)物雙雜交檢測(cè)，mammaliantwo-hybridassay)體系中，由此，能夠構(gòu)建比現(xiàn)有技術(shù) 更高亮度且更高穩(wěn)定性的新的生物鑒定體系（實(shí)施例1 一 9)。
[0087] 并且，在將上述人工生物發(fā)光酶（ALuc)作為報(bào)告蛋白的"報(bào)告分析法"中，應(yīng)用于 "單分子型生物發(fā)光探針"。利用該探針，按照（非專(zhuān)利文獻(xiàn)9)的方法，將ALuc基因分成2 部分，通過(guò)循環(huán)序列取代使N末端與C末段片段連續(xù)，在其外側(cè)連接應(yīng)激激素受體和LXXLL 模體。該探針在有無(wú)應(yīng)激激素（皮質(zhì)醇，cortisol)的條件下顯示出高信噪（S/N)比（實(shí) 施例1 一 10)。并且，在由該探針測(cè)定應(yīng)激激素時(shí)，通過(guò)與上述發(fā)光器件并用，能夠獲得亮度 增加、標(biāo)準(zhǔn)誤差率減少等的效果（實(shí)施例1 一 14)。
[0088] 這樣驗(yàn)證了本發(fā)明的ALuc在各種"報(bào)告分析法"法作為高亮度且穩(wěn)定的報(bào)告蛋白 極其優(yōu)異。
[0089] 通過(guò)獲得了以上的見(jiàn)解，完成了本發(fā)明。
[0090] 即，本發(fā)明具體包括以下方式。
[0091] 〔1〕一種多肽，其包含下述（i)或（ii)所記載的氨基酸序列，并且具有橈腳類(lèi)熒光 素酶活性，
[0092] (i)序列號(hào)38所示的氨基酸序列，
[0093] (ii)序列號(hào)38所示的氨基酸序列中，1-31位或217-221位的至少任意區(qū)域中1 個(gè)以上的氨基酸缺損的氨基酸序列。
[0094] 〔1 一 1〕一種多肽，其包含下述（i)或（ii)所記載的氨基酸序列，并且具有橈腳類(lèi) 熒光素酶活性，
[0095] (i)序列號(hào)37所示的氨基酸序列，
[0096] (ii)序列號(hào)37所示的氨基酸序列中，1-29位或217-221位的至少任意區(qū)域中1 個(gè)以上的氨基酸缺損的氨基酸序列。
[0097] 〔2〕如上述〔1〕或〔1 一 1〕所述的多肽，其包含下述的（iii)~（v)的任一項(xiàng)所記 載的氨基酸序列，
[0098](iii)序列號(hào)11~17或24~36的任一項(xiàng)所示的氨基酸序列，
[0099] (iv)序列號(hào)11~17或24~36的任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入 或添加了1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，
[0100] 其中，這里的多個(gè)表示1~20個(gè)、優(yōu)選1~10個(gè)、更優(yōu)選1~5個(gè)，
[0101] (v)與序列號(hào)11~17或24~36的任一項(xiàng)所示的氨基酸序列具有90%以上的同 一性的氨基酸序列。
[0102] 〔3〕如上述〔1〕或〔1 一 1〕所述的多肽，其包含下述的（Vi)或（vii)所記載的氨 基酸序列，
[0103] (Vi)序列號(hào)22所示的氨基酸序列，
[0104] (vii)序列號(hào)22所示的氨基酸序列中，1-29位或211-215位的至少任意區(qū)域中1 個(gè)以上的氨基酸缺損的氨基酸序列。
[0105] 〔4〕如上述〔1〕所述的多肽，其中，序列號(hào)38所示的氨基酸序列中1-71位的區(qū)域 是序列號(hào)39所示的氨基酸序列。
[0106] 〔4 一 1〕如上述〔1 一 1〕所述的多肽，其中，序列號(hào)37所示的氨基酸序列中1-69 位的區(qū)域是序列號(hào)39所示的氨基酸序列。
[0107] 〔5〕如上述〔1〕所述的多肽，其中，序列號(hào)38所示的氨基酸序列中1-157位的區(qū)域 是序列號(hào)40所示的氨基酸序列。
[0108] 〔5 - 1〕如上述〔1 一 1〕所述的多肽，其中，序列號(hào)37所示的氨基酸序列中1-155 位的區(qū)域是序列號(hào)40所示的氨基酸序列。
[0109] 〔6〕如上述〔1〕所述的多肽，其中，序列號(hào)38所示的氨基酸序列中20-31位的區(qū)域 是抗體識(shí)別部位。
[0110] 〔6 - 1〕如上述〔1 - 1〕所述的多肽，其中，序列號(hào)37所示的氨基酸序列中20-29 位的區(qū)域是抗體識(shí)別部位。
[0111] 〔7〕一種編碼上述〔1〕~〔6 - 1〕中任一項(xiàng)所述的多肽的核酸。
[0112] 〔8〕一種以能夠表達(dá)的方式插入了上述〔7〕所述的核酸的表達(dá)載體。
[0113] 〔9〕一種以能夠表達(dá)的方式導(dǎo)入了上述〔7〕所述的核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0114] 〔10〕一種用于報(bào)告分析法的報(bào)告蛋白，其包括上述〔1〕~〔6 - 1〕中任一項(xiàng)所述 的多肽。
[0115] 〔11〕一種發(fā)光性融合蛋白，其含有上述上述〔10〕所述的報(bào)告蛋白，并且含有靶蛋 白或識(shí)別靶蛋白的肽。
[0116] 〔12〕如上述〔11〕所述的發(fā)光性融合蛋白，其在報(bào)告蛋白的C末端側(cè)結(jié)合有膜定位 信號(hào)（MLS)，靶多肽作為載入物插入兩者之間。
[0117] 〔13〕如上述〔12〕所述的發(fā)光性融合蛋白，其中，上述被插入的靶多肽是熒光蛋白 或熒光素酶。
[0118] 〔14〕如上述〔12〕所述的發(fā)光性融合蛋白，其中，上述被插入的靶多肽是使細(xì)胞膜 形態(tài)變化的多肽或含有該多肽識(shí)別的氨基酸序列的多肽。
[0119] 〔15〕一種表達(dá)載體，其包含編碼上述〔11〕~〔14〕中任一項(xiàng)所述的發(fā)光性融合蛋 白的報(bào)告基因。
[0120] 〔16〕一種導(dǎo)入了上述〔15〕所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0121] 〔17〕一種報(bào)告分析法，用于分析對(duì)應(yīng)于外部刺激的細(xì)胞內(nèi)的靶基因的表達(dá)位置、 表達(dá)時(shí)期或表達(dá)量，其中，上述報(bào)告分析法使用上述〔16〕所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0122] 〔18〕如上述〔17〕所述的分析法，其中，上述分析法是報(bào)告基因檢測(cè)法或雙雜交檢 測(cè)法。
[0123] 〔19〕一種生物發(fā)光探針，用于測(cè)定配體結(jié)合性蛋白的配體活性，上述生物發(fā)光探 針由融合蛋白構(gòu)成，該融合蛋白含有被分為N末端側(cè)和C末端側(cè)兩部分的上述〔10〕所述的 報(bào)告蛋白，并且含有配體結(jié)合性的靶蛋白和識(shí)別配體與靶蛋白結(jié)合時(shí)的立體結(jié)構(gòu)變化的多 肽。
[0124] 〔20〕一種表達(dá)載體，其為用于測(cè)定配體結(jié)合性蛋白的配體活性的表達(dá)載體，編碼 上述〔19〕所述的生物發(fā)光探針的核酸處于能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該核酸的控制序列的控制之 下。
[0125] 〔21〕一種導(dǎo)入了上述〔20〕所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0126] 〔22〕如上述〔16〕所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中，上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞為干細(xì)胞。
[0127] 〔23〕一種被檢細(xì)胞內(nèi)的配體結(jié)合性蛋白的配體活性的檢測(cè)方法，其使用上述〔20〕 所述的表達(dá)載體。
[0128] 〔24〕一種生物發(fā)光成像法，其使用上述〔20〕所述的表達(dá)載體，觀察被檢細(xì)胞內(nèi)的 配體結(jié)合性蛋白的配體活性。
[0129] 并且，在本發(fā)明中，為了提供一種即使由配體刺激直接進(jìn)行發(fā)光測(cè)定也能夠?qū)崿F(xiàn) 高靈敏度的生物檢測(cè)的生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液，對(duì)于細(xì)胞裂解所使用的細(xì)胞裂解液與發(fā)光 測(cè)定時(shí)所使用的反應(yīng)溶液的組合進(jìn)行了研宄。研宄的結(jié)果，通過(guò)使用含有Tris-緩沖液和 HBSS緩沖液作為基本緩沖液、含有NP-40和TW80作為表面活性劑的生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖 液，能夠?qū)崿F(xiàn)不經(jīng)過(guò)細(xì)胞裂解工序、由配體刺激直接進(jìn)行發(fā)光測(cè)定的生物發(fā)光生物檢測(cè)。通 過(guò)進(jìn)一步添加PEG等的高分子、金屬離子、糖成分、鹵離子等，能夠?qū)崿F(xiàn)更高靈敏度的生物 檢測(cè)。
[0130] 本發(fā)明中，首先，根據(jù)一直以來(lái)使用的生物檢測(cè)用反應(yīng)溶液類(lèi)的組成研宄各添加 劑（重金屬離子、鹵離子、高分子添加劑、多元醇、二元醇類(lèi)等）的參與度。并且，還研宄細(xì) 胞裂解劑（SDS、NP-40、TW80、Triton等）的性能。根據(jù)該研宄，能夠確認(rèn)有助于提高生物 檢測(cè)性能的添加物及其有效濃度例。另外，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞裂解步驟（Stepl)和檢測(cè) 步驟（Step2)的各工序中使用的細(xì)胞裂解液與發(fā)光測(cè)定用反應(yīng)溶液的組合的研宄，通過(guò)使 用含有Tris-緩沖液和HBSS緩沖液作為基本緩沖液、含有NP-40和TW80作為表面活性劑 的生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液，能夠提供一種能夠省略細(xì)胞裂解工序、能夠由配體刺激直接進(jìn) 行發(fā)光測(cè)定的生物發(fā)光生物檢測(cè)用反應(yīng)緩沖液。
[0131] 如上所述，綜合生物檢測(cè)用添加劑的研宄結(jié)果，完成了生物發(fā)光生物檢測(cè)用反應(yīng) 緩沖液和使用該緩沖液的生物發(fā)光生物檢測(cè)法的本發(fā)明。
[0132] 下面具體說(shuō)明完成本發(fā)明的經(jīng)過(guò)。
[0133] 一直以來(lái)，生物檢測(cè)分為"細(xì)胞裂解緩沖液（Lysis Buffer) "、"清洗緩沖液（Wash Buffer) "、"檢測(cè)緩沖液（Assay Buffer) "進(jìn)行檢測(cè)。考慮到這種情況，在最初的實(shí)施例中研 宄最適宜的細(xì)胞裂解緩沖液與檢測(cè)緩沖液之間的適應(yīng)性（實(shí)施例2 - 1)。比較觀察到的發(fā) 光的亮度和穩(wěn)定性，結(jié)果確認(rèn)了 ：除了 Promega制的制劑以外，C3的細(xì)胞裂解緩沖液提供了 適合于人工生物發(fā)光酶（ALuc)的緩沖條件。C3以Tris-HCl緩沖液為基礎(chǔ)，配合了 NP-40、 疊氮化鈉、MgClJP NaCl。并且，確認(rèn)了作為與C3組合的檢測(cè)緩沖液，HBSS和TE緩沖（添 加聚乙二醇，分子量400(PEG400))是適合的（圖23A、B)。以下，選擇C3作為基本的緩沖 液，研宄與其他緩沖成分的組合。此時(shí)，考慮HBSS和TE-PEG緩沖液的組合是適合的。
[0134] 此外，在本發(fā)明中以全部的發(fā)光酶為對(duì)象，但是在用于研宄緩沖成分的最佳組合 的實(shí)施例中，主要使用上述的高亮度且能夠持續(xù)觀察的人工發(fā)光酶（ALuc)。
[0135] 首先，使用人工發(fā)光酶（ALuc)，研宄與C3的細(xì)胞裂解緩沖液的組合適宜的一系列 的檢測(cè)緩沖液（實(shí)施例2 - 2)。比較觀察到的發(fā)光的亮度和穩(wěn)定性，結(jié)果確認(rèn)了，與C3具 有良好適應(yīng)性的檢測(cè)緩沖液是PBS緩沖液、HBSS緩沖液、TE-PEG緩沖液（圖24)。
[0136] 接著，利用效果最好的C3細(xì)胞裂解液與HBSS檢測(cè)緩沖液的組合的體系，進(jìn)行更進(jìn) 一步的關(guān)于緩沖添加劑的研宄（實(shí)施例2 - 3)。對(duì)于通過(guò)添加重金屬所帶來(lái)的發(fā)光效果而 言，確認(rèn)了在檢測(cè)緩沖液中鋁離子、銅離子、鐵離子、Mo離子、鋅離子等是有效的添加劑（圖 25)。
[0137] 進(jìn)一步將組合了 C3細(xì)胞裂解液和HBSS檢測(cè)緩沖液的體系應(yīng)用于本發(fā)明的發(fā)明人 新開(kāi)發(fā)出的使用單分子型生物發(fā)光探針（ALuc)的實(shí)際的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（男性荷爾蒙），研宄添 加聚乙二醇（PEG)的效果（實(shí)施例2 - 4)。結(jié)果確認(rèn)了添加PEG是有效的，特別是EG400 和PEG620具有顯著的效果，其添加比例優(yōu)選為1%左右（圖26)。利用該應(yīng)用于單分子型 生物發(fā)光探針（ALuc)的同樣的體系，進(jìn)一步研宄在檢測(cè)緩沖液中添加鹵離子的效果（實(shí)施 例2 - 5)，可知添加鹵離子具有一定程度的有效的結(jié)果。在鹵離子中，KI的整體上的效果 比KBr好，最終濃度為50mM左右特別好。在KBr的情況下，最終濃度為lOOmM左右時(shí)效果好 (圖27)。利用同樣的體系，研宄在檢測(cè)緩沖液中添加糖類(lèi)的效果（實(shí)施例2 - 6)，在添加 部分糖類(lèi)時(shí)確認(rèn)了一定程度的有效的結(jié)果。通過(guò)添加蔗糖或葡萄糖，整體上的效果好。非 糖類(lèi)的甘氨酸也獲得了優(yōu)異的效果。添加濃度為2mg/mL(最終濃度）時(shí)在整體上能夠獲得 好的結(jié)果（圖28)。
[0138] 對(duì)如上所述的關(guān)于細(xì)胞裂解緩沖液、反應(yīng)緩沖液和添加劑的基礎(chǔ)研宄進(jìn)行積累， 結(jié)果，開(kāi)發(fā)出不需要細(xì)胞裂解（lysis)時(shí)間的一次（一次）反應(yīng)溶液的可能性提高。
[0139] 為了避免現(xiàn)有技術(shù)的分為細(xì)胞裂解緩沖液和檢測(cè)緩沖液的繁瑣的生物檢測(cè)中的 繁瑣的程序，組合出了反映了本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的添加物的形態(tài)的新的緩沖液。
[0140] 具體而言，如C14至C22的組成以及圖29和圖30所示，進(jìn)行將本發(fā)明的上述實(shí)施 例中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞裂解液和檢測(cè)用的緩沖液結(jié)合的驗(yàn)證。特別是由C19 一 C22的結(jié)果（圖 29)可知，混合使用2種以上的表面活性劑的手法是極為有效的，并且，由C23 - C26的結(jié) 果（圖30)可知，根據(jù)緩沖液的混合比（表面活性劑的混合比也同樣），有時(shí)更為有效。根 據(jù)這樣的研宄，完成了無(wú)損于發(fā)光反應(yīng)、能夠從活細(xì)胞瞬時(shí)測(cè)定發(fā)光的、新的發(fā)光反應(yīng)溶液 (稱(chēng)為一次（one-shot)緩沖液）。
[0141] 本發(fā)明的緩沖液的特征在于，充分運(yùn)用表面活性劑的特征，以彌補(bǔ)各自的缺點(diǎn)的 形態(tài)來(lái)形成反應(yīng)溶液的組成。
[0142] 更具體而言，進(jìn)行如下說(shuō)明。首先，考慮到表面活性劑的"親水度的程度"為T(mén)W20 > fci j58 > TW80 > TX100 > NP40 的順序、"表面活性度"為 NP40 > TX100 > fci j58 > TW20 > TW80的順序，除了混合少量的SDS之外，通過(guò)混合界面活性度位于兩端的NP40和TW80， 想辦法使其具備強(qiáng)大的裂解力、并且相互彌補(bǔ)各表面活性劑所具有的缺點(diǎn)。其結(jié)果，完成 了無(wú)損于發(fā)光反應(yīng)、能夠在短時(shí)間內(nèi)將細(xì)胞裂解并且同時(shí)進(jìn)行發(fā)光測(cè)定的一次（one-shot) 反應(yīng)溶液。
[0143] 該一次反應(yīng)溶液的效果具體由實(shí)施例2 - 9和2 - 10表示。對(duì)表達(dá)響應(yīng)男性荷 爾蒙的單分子型探針的真核細(xì)胞進(jìn)行類(lèi)固醇激素或化學(xué)物質(zhì)刺激，添加本發(fā)明的一次緩沖 液后，立即進(jìn)行發(fā)光測(cè)定（實(shí)施例2 - 9、2 - 10)。其結(jié)果，在包含男性荷爾蒙受體的單分 子型探針的情況下，與男性荷爾蒙最為劇烈地發(fā)生反應(yīng)（圖31)。此外，包含女性荷爾蒙受 體的單分子型探針與女性荷爾蒙抗癌劑（0HT)劇烈地發(fā)生反應(yīng)（圖32)。這些結(jié)果是嚴(yán)格 地表現(xiàn)出能夠?qū)⒓?xì)胞瞬間裂解并能夠進(jìn)行發(fā)光測(cè)定的該一次緩沖的優(yōu)點(diǎn)的結(jié)果。
[0144] 通過(guò)這些見(jiàn)解，完成了本發(fā)明。
[0145] 即，本發(fā)明也包括以下方式。
[0146] 〔2 - 1〕一種生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液，用于無(wú)需經(jīng)過(guò)對(duì)活細(xì)胞的細(xì)胞裂解工序而 進(jìn)行利用生物發(fā)光的生物檢測(cè)，該生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液包含下述（1)和（2)，
[0147] (1)含有Tris-緩沖液和HBSS緩沖液的基本緩沖液，
[0148] (2)含有NP-40和TW80的表面活性劑。
[0149] 〔2 - 2〕如上述〔2 - 1〕所述的生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液，其中，上述（2)的表面活 性劑還含有SDS。
[0150] 〔2 - 3〕如上述〔2 - 1〕或〔2 - 2〕所述的生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液，其中，進(jìn)一步 配合下述（3)~（6)中至少任一種的添加劑，
[0151] (3)選自PEG和PPG中的至少一種的高分子化合物，
[0152] (4)選自 Mg (II)、Fe (III)、Cu(II)、Mo (VI)和Zn(II)中的至少一種的多價(jià)離子，
[0153] (5)選自階_和1_中的至少一種的鹵離子，
[0154] (6)選自蔗糖、葡萄糖和甘氨酸的多元醇類(lèi)。
[0155] 〔2-4〕如上述〔2-1〕~〔2-3〕中任一項(xiàng)所述的生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液，其特 征在于，上述（1)的基本緩沖液中的Tris-緩沖液和HBSS緩沖液的配合比以容量（v/v)% 計(jì)為20~50 : 50~20,并且，上述（2)的表面活性劑中的NP-40和TW80的配合比以容量 (￥八）％計(jì)為1:1~10。
[0156] 〔2-5〕如上述〔2- 1〕~〔2- 4〕中任一項(xiàng)所述的生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液，其特 征在于，利用生物發(fā)光的生物檢測(cè)是使用響應(yīng)選自男性荷爾蒙、女性荷爾蒙或應(yīng)激激素中 的類(lèi)固醇激素的生物發(fā)光探針的生物檢測(cè)。
[0157] 〔2 - 6〕一種利用生物發(fā)光的生物檢測(cè)法，其特征在于，無(wú)需細(xì)胞裂解工序，使活 細(xì)胞懸浮在生物發(fā)光用反應(yīng)緩沖液中，測(cè)定所得到的懸濁液中的生物發(fā)光強(qiáng)度，該生物檢 測(cè)法包括下述（1)和（2)，
[0158] (1)含有Tris-緩沖液和HBSS緩沖液的基本緩沖液，
[0159] (2)含有NP-40和TW80的表面活