EQ ID NO: 1至30的序列，且分析了 在轉(zhuǎn)化的成纖維（NIH3T3)細(xì)胞內(nèi)的雙調(diào)蛋白的表達(dá)模式，也就是，siRNAS抑制雙調(diào)蛋白的 表達(dá)的程度。
[0316]2-1 :成纖維細(xì)朐株的培養(yǎng)
[0317] 將從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)得到的小鼠成纖維細(xì)胞株（NIH3T3)于37°C 和 5% (v/v)C02條件下置于 RPMI-1640 培養(yǎng)基（GIBCO/Invitrogen，美國，10% (v/v)胎牛 血清，100單位/_青霉素和100U g/時(shí)鏈霉素）中培養(yǎng)。
[0318]2-2 :目標(biāo)siRNA向成纖維化細(xì)朐株的轉(zhuǎn)染
[0319] 將實(shí)施例2-1培養(yǎng)的1 X 105成纖維細(xì)胞置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)的RPMI1640 (GIBC0， 美國）中在37°C和5% (v/v)C02條件下培養(yǎng)18小時(shí)，然后除去培養(yǎng)基，之后把500 #的 Opti-MHM培養(yǎng)基分配到每一個(gè)孔內(nèi)。
[0320]同時(shí)，將2叫脂質(zhì)體 Lipofectamine? 2〇00 (Invitrogen,美國）與248|1必 Opti-Mffl培養(yǎng)基的混合物在室溫下反應(yīng)5分鐘，向230# Opti-Mffl培養(yǎng)基內(nèi)加 入20#實(shí)施例1制備的含有具有任--條SEQIDN0:1至30的序列的有義鏈的 siRNA(lpm〇le/(i€)來制備最終濃度為20nM的siRNA溶液。所述脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混合物和每一種siRNA溶液混合，在室溫下培育20分鐘來制備轉(zhuǎn)染液。
[0321] 下一步，將500M上述每一種轉(zhuǎn)染液分別分配到每一個(gè)含有腫瘤細(xì)胞株和 Opti-MEM的孔內(nèi)并培育6小時(shí)，然后除去Opti-MEM培養(yǎng)基。然后將1 RPMI 1640培養(yǎng) 基分配到每一個(gè)孔中，并在37°C和5% (v/v)C02條件下培育24小時(shí)。
[0322]2-3 :對(duì)雙調(diào)蛋白mRNA的宙量分析
[0323] 從實(shí)施例2-2的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中提取出總RNA，并用它合成其cDNA，用實(shí)時(shí)PCR對(duì)雙 調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。
[0324]2-3-1 :從轉(zhuǎn)染細(xì)朐中分離RNA以及cDNA的合成
[0325]利用 RNA 提取試劑盒（AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BI0NEER， 韓國）從經(jīng)實(shí)施例2-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中提取出總RNA，并利用RNA反轉(zhuǎn)錄酶（AccuPower CycleScript RT Premix/dT20，Bioneer,韓國）用以下方式合成為cDNA。特別地，向 0.25Eppendorf 管中的AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer,韓國）里 加入1 y g/管的所提取的RNA，并添加經(jīng)DEPC (焦碳酸二乙酯）處理過的蒸餾水至總體積 20 然后，利用基因擴(kuò)增系統(tǒng)（MyGenie? 96 Gradient Thermal Block, BI0NEER，韓國） 將上述RNA和引物在30°C條件下雜交一分鐘，保持溫度52°C 4分鐘即合成cDNA。雜交和 cDNA合成的過程重復(fù)6次，然后保持溫度95°C 5分鐘使酶失活，從而擴(kuò)增cDNA。
[0326]2-3-2 :雙調(diào)蛋白mRNA的相對(duì)宙量分析
[0327] 以實(shí)施例2-3-1合成的cDNA作為模板，利用實(shí)時(shí)PCR以以下方式對(duì)雙調(diào)蛋白mRNA 的相對(duì)水平進(jìn)行定量。特別地，用蒸餾水將實(shí)施例2-3-1合成的cDNA稀釋五倍，為了分析 雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平，向96孔板的每一個(gè)孔中加入3 |Ji上述稀釋過的cDNA，1〇辦 2XGreenStar? PCR master mix(BI0NEER，韓國），6# 蒸餾水和1 # 雙調(diào)蛋白 qPCR引物 (每種引物10pmole/XBI0NEER，韓國）來制備混合物。同時(shí)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸 脫氫酶），一種持家基因（后文中表示為HK基因），作為標(biāo)準(zhǔn)基因用來歸一化雙調(diào)蛋白mRNA 的表達(dá)水平。利用 Exicycler? 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BI0NEER，韓 國）將上述含有混合物的96孔板進(jìn)行以下反應(yīng)。特別地，將上述混合物在95°C條件下反 應(yīng)15分鐘，激活酶并除去cDNA的第二結(jié)構(gòu)，然后混合物進(jìn)行42個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每一個(gè)循 環(huán)包括變性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，SYBR green掃描以及最后72°C條件 下3分鐘的延伸。接下來，混合物在55°C保持1分鐘，分析55°C~95°C的溶解曲線。PCR 擴(kuò)增完后，通過計(jì)算經(jīng)GAPDH基因歸一化的mRNA值（歸一化因數(shù)，NF)來校正雙調(diào)蛋白的 Ct (循環(huán)閾值）值，然后利用一個(gè)未經(jīng)siRNA處理的對(duì)照值來計(jì)算ACt值。用ACt值和公 式2 (_Aet) X 100 (見圖1)對(duì)因雙調(diào)蛋白特異性-siRNA引起的雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平進(jìn) 行相對(duì)定量，上述雙調(diào)蛋白特異性-siRNA含有具有SEQ ID NO: 1至30各一序列的有義鏈。
[0328] 為了選出高效能的siRNAs，挑出了 15種不同的siRNAs，所述siRNAs分別包含一 條有義鏈，該有義鏈具有SEQ ID NO: 2, 6至9, 11，17至21，23, 24, 28和29各一序列，這些 最終濃度為20nM的siRNAs顯示出經(jīng)其處理過后雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平相比于空白對(duì) 照組有70%或者更高的下降。
[0329]實(shí)施例3:被詵用的siRNAs對(duì)成纖維（NIH3T3)細(xì)朐株中雙調(diào)蛋白的表汰的抑制
[0330] 用所述雙調(diào)蛋白特異性-siRNAs(選自實(shí)施例2)轉(zhuǎn)化小鼠成纖維（NIH3T3)細(xì)胞 株，所述雙調(diào)蛋白特異性-siRNAs分別包含一條有義鏈，該有義鏈具有SEQ ID N0:2, 6至 9, 11，17至21，23, 24, 28和29各一序列，分析了經(jīng)改變后的成纖維（NIH3T3)細(xì)胞中的雙調(diào) 蛋白mRNA的表達(dá)模式。
[0331]3-1:成纖維細(xì)朐株的培養(yǎng)
[0332] 將從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)得到的小鼠成纖維細(xì)胞株（NIH3T3)于37°C 和 5% (v/v)C02 條件下置于 RPMI-1640 培養(yǎng)基（GIBCO/Invitrogen，美國，10% (v/v)胎牛 血清，100單位/_青霉素和1〇〇 u g/_鏈霉素）培養(yǎng)。
[0333]3-2:目標(biāo)siRNA到成纖維細(xì)朐株的轉(zhuǎn)染
[0334] 將實(shí)施例2-1培養(yǎng)的1 X 105成纖維細(xì)胞置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)的RPMI1640 (GIBC0， 美國）中在37°C和5% (v/v)C02條件下培養(yǎng)18小時(shí)，然后除去培養(yǎng)基，之后將500 #的 Opti-MHM培養(yǎng)基分配到每一個(gè)孔內(nèi)。
[0335]同時(shí)，使 2 脂質(zhì)體 Lipofectamine? 2〇00 (Invitrogen,美國）與 248(I必 Opti-Mffl培養(yǎng)基的混合物在室溫下反應(yīng)5分鐘，向245 培養(yǎng)基內(nèi)加入5叫選 自實(shí)施例2的含有具有SEQ ID N0:2, 6至9, 11，17至21，23, 24, 28和29各一序列的有義鏈 的siRNA(l pm〇le/|Ji)來制備最終濃度為20nM的siRNA溶液。上述脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混合物和每一種siRNA溶液混合，在室溫下培育20分鐘來制備轉(zhuǎn)染液。
[0336] 下一步，將500 #上述每一種轉(zhuǎn)染液分別分散到每一個(gè)含有腫瘤細(xì)胞株和 Opti-MEM的孔內(nèi)并培育6小時(shí)，然后除去Opti-MEM培養(yǎng)基。然后將1 I^RPMI 1640培養(yǎng) 基分散到每一個(gè)孔，并在37°C和5% (v/v)C02條件下培育24小時(shí)。
[0337]3-3:雙調(diào)蛋白mRNA的宙量分析
[0338] 從實(shí)施例3-2的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中提取出總RNA，并用它合成cDNA，用實(shí)時(shí)PCR對(duì)雙調(diào) 蛋白mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。
[0339]3-3-1:從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離RNA以及cDNA的合成
[0340] 利用RNA提取試劑盒（AccuPrep細(xì)胞總RNA提取試劑盒，BIONEER，韓國）從經(jīng)實(shí) 施例2-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中提取出總RNA，并利用RNA反轉(zhuǎn)錄酶（AccuPower CycleScript RT Premix/dT20，Bioneer,韓國）用以下方式合成cDNA。特別地，向0.25 M￡ Eppendorf管中 的 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)里加入 lug/管的上述 RNA， 并添加經(jīng)DEPC(焦碳酸二乙酯）處理過的蒸餾水至總體積20 然后，利用基因擴(kuò)增系 統(tǒng)（MyGenie? 96 Gradient Thermal Block, BI0NEER，韓國）將上述 RNA 和引物在 30°C條 件下雜交一分鐘，保持溫度52°C 4分鐘即合成cDNA。雜交和cDNA合成的過程重復(fù)6次，然 后保持溫度95°C 5分鐘使酶失活，從而擴(kuò)增cDNA。
[0341] 3-3-2 :雙調(diào)蛋白mRNA的相對(duì)宙量分析
[0342] 以實(shí)施例3-3-1合成的cDNA作為模板，利用實(shí)時(shí)PCR以以下方式對(duì)雙調(diào)蛋白mRNA 的相對(duì)水平進(jìn)行定量。特別地，用蒸餾水將實(shí)施例3-3-1合成的cDNA稀釋五倍，為了分析 雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平，向96孔板的每一個(gè)孔中加入3 |Ji上述稀釋過的cDNA，丨〇 # 2XGreenStar? PCR master mix(BI0NEER，韓國），6批蒸饋水和1辦雙調(diào)蛋白qPCR引物 (每種引物10 pmole/辦，BI0NEER，韓國）來制備混合物。同時(shí)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸 脫氫酶），一種持家基因（后文中用HK基因指代），作為標(biāo)準(zhǔn)基因用來歸一化雙調(diào)蛋白mRNA 的表達(dá)水平。利用 Exicycler? 96 Real-time Quantitative Thermal Block(BI0NEER，韓 國）將上述含有混合物的96孔板進(jìn)行以下反應(yīng)。特別地，將上述混合物在95°C條件下反應(yīng) 15分鐘，激活酶并除去cDNA的第二結(jié)構(gòu)，然后混合物進(jìn)行42個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，每一個(gè)循環(huán)包 括變性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，SYBR綠掃描以及隨后的72°C條件下3分鐘 的延伸。接下來，混合物在55°C保持1分鐘，分析55°C -95°C的溶解曲線。PCR擴(kuò)增完后， 通過計(jì)算經(jīng)GAPDH基因歸一化的mRNA值（歸一化因數(shù)，NF)來校正雙調(diào)蛋白的Ct(循環(huán)閾 值）值，然后利用未經(jīng)siRNA處理的對(duì)照值來計(jì)算ACt值。用ACt值和公式2 (_Aet)X 100 對(duì)因雙調(diào)蛋白特異性-siRNA引起的雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平的變化進(jìn)行相對(duì)定量，上 述雙調(diào)蛋白特異性-siRNA含有一條有義鏈，該有義鏈具有SEQ ID N0:2, 6至9, 11，17至 21，23, 24, 28 和 29 的序列。
[0343] 為了選擇高效能的siRNAs，挑出了 3種不同的siRNAs，所述siRNAs分別包含一 條有義鏈，該有義鏈具有任--條SEQ ID N0: :8, 9和28的序列，這些最終濃度為20nM的 siRNAs顯示出（經(jīng)其處理過后）雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平相比于空白對(duì)照組有70%或者 更高的下降。檢查所選siRNAs的IC 5(I值來確定siRNAs的濃度，經(jīng)該濃度的siRNAs處理后 目標(biāo)基因的表達(dá)被抑制了 50%。
[0344] 實(shí)施例4 :被詵用的siRNAs對(duì)成纖維（NIH3T3)細(xì)朐株中雙調(diào)蛋白的表汰的抑制
[0345] 用具有實(shí)施例3所選的SEQ ID N0:8,9和28的序列的有義鏈的雙調(diào)蛋白特異 性-siRNAs轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞（NIH3T3)，為了確定所述siRNAs的IC 5(I值，分析了經(jīng)轉(zhuǎn)化后的 成纖維（NIH3T3)細(xì)胞中的雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)模式。
[0346] 4-1 :成纖維細(xì)朐株的培養(yǎng)
[0347] 將從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)得到的小鼠成纖維細(xì)胞株于37°C和5% (v/v)C02 條件下置于 RPMI-1640 培養(yǎng)基（GIBCO/Invitrogen，美國，10% (v/v)胎牛血 清，100單位/mi青霉素和100 鏈霉素）中培養(yǎng)。
[0348]4-2 :目標(biāo)siRNA到成纖維細(xì)朐株的轉(zhuǎn)染
[0349] 將實(shí)施例2-1培養(yǎng)的1 X 105成纖維細(xì)胞置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)的RPMI1640 (GIBC0， 美國）中在37°C和5% (v/v)C02條件下培養(yǎng)18小時(shí)，然后除去培養(yǎng)基，之后將500 #的 Opti-MHM培養(yǎng)基分配到每一個(gè)孔內(nèi)。
[0350]同時(shí)，使 2 脂質(zhì)體 Lipofectamine? 2000 (Invitrogen,美國）與248 |1必 Opti-MEM培養(yǎng)基的混合物在室溫下反應(yīng)5分鐘，向249. 8, 249和245# Opti-MEM培養(yǎng)基 內(nèi)加入0. 2,1和5#選自實(shí)施例3的含有一具有任--條SEQ ID N0: : 8,9和28的序列的 有義鏈的siRNA (1 pm〇le/M)來制備最終濃度為0. 2,1和5nM的siRNA溶液。所述脂質(zhì)體 Lipofectamine2000混合物和每一種siRNA溶液混合，在室溫下培育20分鐘來制備轉(zhuǎn)染 液。
[0351] 下一步，將500叫上述每一種轉(zhuǎn)染液分別分配到每一個(gè)含有腫瘤細(xì)胞株和 Opti-MEM的孔內(nèi)并培育6小時(shí)，然后除去Opti-MEM培養(yǎng)基。然后將1 M^RPMI 1640培養(yǎng) 基分配到每一個(gè)孔，并在37°C和5% (v/v)C02條件下培育24小時(shí)。
[0352]4-3 :雙調(diào)蛋白mRNA的宙量分析
[0353] 從實(shí)施例4-2的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中提取總RNA，并用它合成cDNA，用實(shí)時(shí)PCR對(duì)雙調(diào)蛋 白mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。
[0354] 4-3-1 :從轉(zhuǎn)染細(xì)朐中分離RNA以及cDNA的合成
[0355] 利用RNA提取試劑盒（AccuPr印細(xì)胞總RNA提取試劑盒，BI0NEER，韓國）從經(jīng)實(shí) 施例2-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中提取出總RNA，并利用RNA反轉(zhuǎn)錄酶（AccuPower CycleScript RT Premix/dT20，Bioneer,韓國）用以下方式合成cDNA。特別地，向0.25MSEppendorf管中 的 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)里加入 lug/管的上述 RNA， 并添加經(jīng)DEPC(焦碳酸二乙酯）處理過的蒸餾水至總體積20 然后，利用基因擴(kuò)增系統(tǒng) (MyGenie? 96 Gradient Thermal Block, BI0NEER，韓國）將上述 RNA 和引物在 30°C條件 下雜交一分鐘，保持溫度52°C 4分鐘即合成cDNA。雜交和cDNA合成的過程重復(fù)6次，然后 保持溫度95°C 5分鐘使酶失活，從而擴(kuò)增cDNA。
[0356] 4-3-2:雙調(diào)蛋白mRNA的相對(duì)宙量分析
[0357] 以實(shí)施例4-3-1合成的cDNA作為模板，利用實(shí)時(shí)PCR以以下方式對(duì)雙調(diào)蛋白mRNA 的相對(duì)水平進(jìn)行定量。特別地，用蒸餾水將實(shí)施例4-3-1合成的cDNA稀釋五倍，為了分析 雙調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平，向96孔板的每一個(gè)孔中加入3 (Ji上述稀釋過的cDNA，10辦 2XGreenStar?PCRmastermix(BI0NEER，韓國），6叫蒸餾水和1辦雙調(diào)蛋白qPCR引物 (每種引物10pmole/7^, BI0NEER,韓國）來制備混合物。同時(shí)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸 脫氫酶），一種持家基因（后文中用HK基因指代），作為標(biāo)準(zhǔn)基因用來歸一化雙調(diào)蛋白mRNA