專利名稱：一類新化合物、其藥物組合物及其醫(yī)藥保健用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥和保健領域。具體涉及一類C2-NH2取代嘌呤核苷酸新化合物及其降壓功能、對心腦血管的保護和調節(jié)作用及抗衰老作用等。還涉及含有該化合物的降壓藥物組合物和/或血壓調節(jié)、心腦血管保護及抗衰老保健品。
背景技術：
之前，發(fā)明人從紅細胞中提取了一種內源性降壓物質，其被命名為紅細胞源性降壓因子(erythrocyte-derived depressing factor，EDDF)。該提取方法在申請人另一專利申請02106068.1中已有詳細描述。受提取物質的純度限制，EDDF成分難以確定；之后，發(fā)明人經過不斷改進純化條件，得到了符合質譜、核磁等精密儀器測試要求的樣品，樣品經過質譜、液相色譜-質譜(LC-MS)、二級質譜聯(lián)用技術(MS/MS)、負離子檢測ESI-MS、核磁共振和紫外等分析等，最終得到了EDDF的確切成分，并確定其為一類結構明確的新化合物?；贓DDF的結構已經確定，將其更名為紅細胞源性降壓物質(erythrocyte-derived depressing substance，EDDS)。根據(jù)發(fā)明人以往對EDDS藥理作用的研究，表明這類大量存在于紅細胞中的EDDS新化合物在降壓、對心腦血管的保護作用及抗衰老過程中可能起著決定性作用，它應該是EDDF中的活性成分。
現(xiàn)有的降壓藥物品種繁多，常用的降壓藥物就有幾十種。其中，許多藥物常伴有嚴重的不良反應。1990年世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定以下五類藥物為高血壓的一線用藥鈣通道阻斷劑(calcium channel blocker，CCB)血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensinconverting enzyme inhibitor，ACEI)，利尿劑，α-腎上腺素能受體阻斷劑和β-腎上腺素能受體阻斷劑。近年來還有另一類新藥，即血管緊張素II受體拮抗劑。其中應用最廣泛的是CCB和ACEI。作為一個理想的降壓藥，除能降低血壓外，還應該安全，副作用小，保證重要臟器的良好灌注，預防或逆轉心血管結構改變，不增加或減少心血管疾病的危險因素，伴有冠心病或糖尿病等并發(fā)癥時也可應用，以及費用低，效益高等。由于高血壓的發(fā)病機制極其復雜，上述藥物雖然都有不同程度療效，目前仍不失為有效的降壓藥物，但它們均有不同程度的副作用。其中，有的伴有嚴重的不良反應。例如，利尿劑能引起低鎂和低血鉀癥，CCB長期應用的安全性受到一定質疑，α-腎上腺能受體阻斷劑首劑時有時會引起嚴重的體位性低血壓，眩暈，心悸等，β-腎上腺能受體阻斷劑主要對糖代謝有影響，并呈劑量相關性，ACEI可引起5％-10％的患者干咳。大劑量使用ACEI還可能引起中性粒細胞減少。還有0.1％患者出現(xiàn)神經性水腫等。因此，開發(fā)一個新一代的降壓，并對心腦血管具有保護功能以及對機體具有調整作用的新藥具有重要的理論意義和實際應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的有三個目的之一是提供一類結構明確的新化合物。
該化合物可用以下通式(I)表示R＝H，一個或二個 所述化合物化學名稱為2-氨基-9-呋喃核糖酰基-9H-嘌呤-5’-一磷酸酯(2-amino-9-ribofuranosyl-9H-purine-5’-phosphate)、2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-二磷酸酯(2-amino-9-ribofuranosyl-9H-purine-5’-diphosphate)、和/或2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-三磷酸酯(2-amino-9-ribofuranosyl-9H-purine-5’-triphosphate)。
所述化合物還包括結構式(I)表示的化合物在藥學上的可接受的制劑和鹽以及結構式(I)表示的化合物在嘌呤2位與6位上的衍生物。
目的之二是提供含有該化合物的藥物組合物。
該藥物組合物由上述其中一種或多種化合物和或/及其可作為藥用鹽作為藥性成分，并結合其它可藥用輔料而成。
目的之三是提供該類化合物及其藥物組合物在制備降壓藥物或保健品中的用途。
具體為所述化合物和組合物在制備降壓藥物、制備心腦血管保護和調節(jié)作用的藥物、和/或制備抗衰老作用的藥物的應用。
以及所述化合物和組合物在制備具有心腦血管保護和調節(jié)作用的保健品、和/或制備具有抗衰老作用的保健品中的應用。
本發(fā)明在確定EDDS結構的基礎上，得到了一類新的化合物。實驗表明它具有明顯而持久的降壓功能，并對心腦血管具有很好的調節(jié)功能和抗衰老作用，以及毒性小、安全性高等特點，是一種新的血壓及心腦血管功能的調節(jié)劑，這為高血壓、冠心病、腦卒中、糖尿病及老年病等的防治開辟一條新途徑。


圖1為m/z 426離子的主要裂解方式及其途徑。
具體實施例方式
本發(fā)明所提供的新化合物是發(fā)明人從紅細胞中提取的EDDS經結構鑒定而確定的。它具體為2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-一磷酸酯、2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-二磷酸酯及其前體物質2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-三磷酸酯。
EDDS的提取、純化和制備過程1、EDDS按照02106068.1專利申請中描述的方法提取，其步驟簡述如下(1)取正常健康人血液，經離心得到紅細胞，然后溶血；(2)溶血產物進行熱處理，冷卻后進行超濾；(3)對超濾樣品行冷凍干燥；(4)將冷凍干燥樣品進行凝膠柱層析，分部收集，對所收集的樣品進行降壓活性鑒定，收集并合并有降壓活性的樣品，并進行冷凍干燥；(5)用固相萃取制備柱對樣品進行進一步的純化取固相萃取柱一支，用4ml甲醇活化，再用4ml水平衡后上樣，用4ml純水及5ml甲酸水溶液分別清洗柱床，收集最后3ml的洗脫液，冷凍干燥后將樣品凍存?zhèn)溆谩＝涍^該步驟可以進一步除去上柱前粗品中約90％的雜質，純化效率提高10倍。
(6)將純化后的樣品經稀釋后用高壓液相色譜儀(HPLC)進行分離儀器Waters 510泵兩臺，梯度洗脫控制儀，紫外檢測儀，記錄儀；流動相A0.01M的磷酸二氫鈉，流動相B0.2M的磷酸氫二鈉，加入甲酸梯度洗脫程序

分別收集出現(xiàn)的三個較大的色譜峰，用于對樣品中活性成分含量的鑒定和后續(xù)動物急性降壓實驗。實驗確證，前兩個峰很小，但沒有活性，屬干擾峰；第三個峰很大，為活性峰。收集第三個峰，重新進樣，紫外吸收表明其純度可達80％以上。
EDDS的成分鑒定經上述方法純化的三批EDDS樣品，利用負離子檢測模式的(-)ESI-MS及其MSn和(+)FAB-HRMS方法進行了系統(tǒng)分析、并結合EDDS樣品與作為對照的標準品(ADP或AMP或ATP)的MS和NMR譜分析比較，確定了EDDS樣品的成分結構。EDDS中主要成分為2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-一磷酸酯(2-amino-9-ribofuranosyl-9H-purine-5’-phosphate)、2-氨基-9-呋喃核糖酰基-9H-嘌呤-5’-二磷酸酯(2-amino-9-ribofuranosyl-9H-purine-5’-diphosphate)、和2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-三磷酸酯(2-amino-9-ribofuranosyl -9H-purine-5’-triphosphate)，該樣品主要為三者的混合體，其中，2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-三磷酸酯主要作為前體物質，含量少。確認的結構式如下 化合物1(M.W＝347.2) 化合物2(M.W＝427.2) 化合物3(M.W＝605.2)1、MS分析結果利用QTRAP型四極桿-線性離子阱串聯(lián)質譜儀，對EDDS樣品進行了負離子檢測模式的(-)ESI-MS及其MSn譜的細致分析研究。首先，在進行(-)ESI-MS譜測定中，通過改變其DP電壓探討了EDDS樣品中出現(xiàn)的三個峰，其中兩個主要的峰為m/z 346和m/z 426離子，另一次要峰為m/z 604離子，結果表明在不同DP電壓(分別選定為60V、30V和10V)下，三者的離子峰強度基本不變，因此，可以得知三者是各自獨立成分。在此基礎上，進行了m/z 346、m/z 426、m/z 604離子以及相關碎片離子的(-)ESI-MS2及MS3譜分析，從而初步分析它們分別是5’-連接一個(m/z 346)、二個磷酸(m/z 426)、和三個磷酸(m/z 604)的與腺苷酸類似的化合物。應用AutoSpec Ultima-Tof高分辨質譜儀測定了EDDS中m/z 426離子的(+)FAB-HRMS譜，其結果為[M+H]+m/z 428.0343，與分子組成為C10H15O10N5P2的(M+H)理論值428.0372相差2.9mDa，基本一致，則確定了m/z 426離子峰的分子式。另外，對所提供的標準品同樣進行了上述(-)ESI-MS及其MSn譜的分析，并與EDDS樣品進行了裂解比較。結果表明，標準品中的m/z 346(AMP)、m/z 426離子(ADP)和m/z 604離子(ATP)的裂解特征與EDDS樣品的基本一致。通過質譜分析得到的最主要結構信息為確定為與腺苷酸類似的化合物，以及堿基種類(氨基嘌呤)，磷酸及其個數(shù)、連接位置及序列等。由(-)ESI-MSn譜分析得到的EDDS中m/z 426離子的主要裂解方式及其途徑參見圖1，m/z 346離子只缺少一個亞磷酸，m/z 604離子只增加一個亞磷酸，其它部分裂解方式一致。
2、NMR譜結果由于ADP(C6-NH2取代的腺苷酸)與C2-NH2取代的嘌呤核苷酸在質譜中沒有差別，對此，利用NMR譜進行分析鑒別。通過對EDDS樣品的1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC等NMR譜的仔細分析，其結果表明與質譜分析推斷的腺苷酸類成分一致，并且發(fā)現(xiàn)與標準品(ADP或AMP或ATP)中部分位置的1H-NMR和13C-NMR譜信號存在一定差異。從而，最終確認EDDS樣品中主要成分的結構與標準品不同，為連接一個、二個或三個磷酸的C2-NH2取代嘌呤核苷酸。
分析判斷在EDDS樣品的腺苷酸中的堿基結構不同于常見的C6-NH2取代的腺嘌呤(如ADP)，而是C2-NH2取代的氨基嘌呤；而且，二者的主要差異出現(xiàn)在C6、C2和C5處的13C化學位移值。EDDS樣品和標準品的NMR譜峰歸屬結果如下所示1)標準品(AMP或ADP或ATP)的NMR譜分析歸屬(溶劑DMSO)R＝H，一個或二個 1H峰的歸屬 No.化學位移(δ)8-H8.312-H8.141′-H 5.902′-H 4.183′-H 4.554′-H 4.065′-H 3.97
13C峰的歸屬 No.化學位移(δ)4-C150.16-C156.08-C140.22-C153.05-C119.11′-C 87.52′-C 71.03′-C 74.24′-C 84.15′-C 65.6(其中，1H-NMR譜中的δ1.0的信號，可能是-CH-，來源于雜質)2)樣品EDDS的NMR譜分析歸屬(溶劑DMSO)R＝H，一個或二個 1H峰的歸屬No.化學位移(δ)8-H8.266-H8.051′-H 5.892′-H 4.153′-H 4.494′-H 4.085′-H 3.9713C峰的歸屬No.化學位移(δ)4-C148.46-C145.98-C138.42-C156.55-C124.2
1′-C 87.12′-C 70.43′-C 73.84′-C 83.35′-C 65.3本發(fā)明在對提取及純化的EDDS的成分鑒定中得到一類新的化合物，并最終確定了其結構。從結構角度分析，本發(fā)明的新化合物與已知的該類化合物AMP(一磷酸腺苷)、ADP(二磷酸腺苷)和ATP(三磷酸腺苷)的區(qū)別在于-NH2取代的位置，腺苷在C6，而本發(fā)明化合物在C2。生物活性實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的新化合物具有非常顯著的降壓功能。本發(fā)明化合物除了通過生物提取，還可以從化學合成得到。
藥效學實驗經生物來源的EDDS、以及用得到的2’-氨基-一磷酸腺嘌呤(A1)、2’-氨基-二磷酸腺嘌呤(A2)和2’-氨基-三磷酸腺嘌呤(A3)，進行降壓實驗。
1、急性降壓測定實驗材料正常大鼠及高血壓大鼠，包括自發(fā)性高血壓大鼠(n＝25)，腎性高血壓大鼠(n＝15)及伴有高血壓的糖尿病大鼠(n＝6)。均購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心。
實驗方法麻醉狀態(tài)下分離實驗大鼠一側頸總動脈和頸外靜脈。動脈插管通過YP100型壓力傳感器(北京新航業(yè)科貿有限公司)，連接到四導生理記錄儀(NIHONKOHDEN，型號RM6200，成都儀器廠及日本光電工業(yè)株式會社)上描記血壓，靜脈注射0.1ml藥物。陽性對照為目前臨床上常用的降壓藥nitrendipine(尼群地平)。
實驗結果急性降壓結果見表1。
表1新化合物對大鼠的急性降壓作用


從表1數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明單一化合物和組合藥物在給予的劑量范圍內均具有不同程度的降壓作用，其中2’-氨基-二磷酸腺嘌呤的降壓作用最強，在很低濃度(10-8mol/L)時就有明顯降壓效果。本發(fā)明化合物和組合物與陽性對照藥相比，降壓效果明顯好于對照藥。
2、慢性降壓實驗，包括腹腔及口服兩種給予藥途徑1)腹腔注射降壓實驗血壓測定參考Preffer JM等的方法(J Lab Clin Med 1971，78957)。一次給予自發(fā)性高血壓大鼠(SHR，n＝3)4mg/kg的2’-氨基-二磷酸腺嘌呤，用電血壓計測定其尾動脈血壓(RBP-1型，北京中日友好醫(yī)院臨床研究所生產)。結果表明給藥后1小時血壓明顯下降，約降低50mmHg，48小時后血壓恢復至正常水平。
2)口服降壓實驗SHR大鼠一次口飼4mg/kg的藥物，用上述血壓計測定其尾動脈血壓。實驗分6組2’-氨基-一磷酸腺嘌呤A1組(實驗一組)、2’-氨基-二磷酸腺嘌呤A2組(實驗二組)、2’-氨基-三磷酸腺嘌呤A3組(實驗三組)、A1∶A2∶A3＝45∶45∶10(實驗四組)、不給藥的陰性對照組及給nitrendipine的陽性對照組。結果見表2表2SHR大鼠口服藥物的降壓作用(給藥時間清晨5:30)

**P＜0.01；*P＜0.05；(n＝7)表2結果表明與陰性對照相比，實驗藥物和陽性對照藥物的降壓作用無明顯差異，服藥半小時后血壓下降約20mmHg，降壓作用可以維持數(shù)小時。
急性毒性實驗正常大鼠(n＝6)和小鼠(n＝10)的尾靜脈急性注射實驗用生理鹽水將2’-氨基-一磷酸腺嘌呤、2’-氨基-二磷酸腺嘌呤和2’-氨基-三磷酸腺嘌呤配制成相應的注射液，尾靜脈注射劑量為10、50mg和200mg/kg，連續(xù)觀察14天。結果顯示，在劑量(mg/kg)10和50時，大鼠和小鼠均未出現(xiàn)死亡，也未見明顯的不良反應，動物行為及活動正常。在200mg/kg時，動物出現(xiàn)明顯的低血壓反應，四肢無力，不能站立，腹式呼吸，此種情況持續(xù)約5-10分鐘便恢復正常，之后動物行為、活動及飲食、引水均恢復正常。大、小鼠在14天后均進行解剖學檢查，未發(fā)現(xiàn)任何病理異常。實驗說明，本發(fā)明化合物2’-氨基-一磷酸腺嘌呤和2’-氨基二磷酸腺嘌呤的安全性很好，毒性低。
正常大鼠和小鼠口飼2’-氨基-一磷酸腺嘌呤、2’-氨基-二磷酸腺嘌呤和2’-氨基-三磷酸腺嘌呤的急性毒性實驗2’-氨基-一磷酸腺嘌呤、2’-氨基-二磷酸腺嘌呤和2’-氨基-三磷酸腺嘌呤的口飼劑量為1g/kg，連續(xù)觀察14天，實驗結果未見任何異常，動物行為及活動正常，毛色光滑，體重增長正常。大、小鼠14天均后進行解剖學檢查未發(fā)現(xiàn)任何病理異常。實驗說明，本發(fā)明化合物2’-氨基-一磷酸腺嘌呤、2’-氨基-二磷酸腺嘌呤和2’-氨基-三磷酸腺嘌呤口飼安全性很好，毒性低。
本發(fā)明公開了從人紅細胞中提取的一類新化學物質本發(fā)明化合物2’-氨基-一磷酸腺嘌呤、2’-氨基-二磷酸腺嘌呤和2’-氨基-三磷酸腺嘌呤。該化合物具有藥效學好及毒性低等特點?；衔锉旧?、其藥學上可接受的鹽、或以它們作為藥效成分與其它可藥用的輔料或載體組合可以形成新的有效降壓的藥物，具體可以制成片劑、膠囊、口服液、滴丸劑和注射液以及其它可接受的劑型等。對此，本領域技術人員能夠依照使用需求選擇輔料和劑型，如制造片劑、膠囊劑、包衣劑所用的輔料是常規(guī)用的佐劑，例如淀粉，明膠，阿拉伯膠，硅石，聚乙二醇，液體劑型所用的溶劑，例如水，乙醇，丙二醇，植物油類如玉米油，花生油，橄欖油等，本發(fā)明不予贅述；作為藥物組合物，本發(fā)明化合物作為藥性成分的使用劑量最好為2-4mg/每日。另一方面，以本發(fā)明的化合物作為活性成分與其它可接受的輔料或載體組合可以形成新的調節(jié)血壓的保健品，具體也可以制成片劑、膠囊、口服液、以及其它劑型等，還可加入其它助劑，例如表面活性劑，潤滑劑，崩解劑，防腐劑，矯味劑，色素，甚至可以加入其它基料中制成保健食品和保健飲料等，對此，技術人員能夠依照需求進行選擇和制作，本發(fā)明也不予贅述；作為調節(jié)血壓的保健品，本發(fā)明化合物的添加劑量最好為2-4mg/每日。
權利要求
1.一類用結構式(I)表示的化合物及其衍生物
2.根據(jù)權利要求1所述的化合物，其特征在于其具體為2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-二磷酸酯、2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-磷酸酯、或2-氨基-9-呋喃核糖?；?9H-嘌呤-5’-三磷酸酯。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的化合物，其特征在于為所述化合物藥學上可接受的制劑和鹽。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的化合物，其特征在于為所述化合物在嘌呤環(huán)2位與6位衍生的化合物。
5.一種藥物組合物，由權利要求1至4任一所述的化合物或其可藥用鹽中的一種或幾種作為活性成分與其它藥用輔料組成。
6.根據(jù)權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于其使用劑型為片劑、膠囊劑、口服液、滴丸劑或注射劑。
7.一種具有心腦血管保護和調節(jié)作用或抗衰老作用的保健品，其特征在于含有保健劑量的權利要求1至4任一所述的化合物或其可藥用鹽中的一種或幾種。
8.根據(jù)權利要求7所述的保健品，其特征在于其使用劑型包括，但不僅限于片劑、膠囊劑、或口服液。
9.權利要求1至4任一所述的化合物或其可藥用鹽或權利要求4所述的藥物組合物在制備降壓藥物、制備心腦血管保護和調節(jié)作用的藥物、和/或制備抗衰老作用的藥物的應用。
10.權利要求1至4任一所述的化合物或其可藥用鹽或權利要求4所述的藥物組合物在制備心腦血管保護和調節(jié)作用的保健品、和/或制備抗衰老作用的保健品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類新的化合物，為2－氨基－9－呋喃核糖?；?H－嘌呤－5’－二磷酸酯、2－氨基－9－呋喃核糖?；?H－嘌呤－5’－一磷酸酯和2－氨基－9－呋喃核糖?；?H－嘌呤－5’－三磷酸酯。同時公開了該化合物及其可藥用鹽在制備具有降壓功能的藥物或保健品上的用途。實驗表明本發(fā)明化合物具有明顯而持久的降壓功能、并對心腦血管具有很好的保護和調節(jié)作用、以及抗衰老作用；本發(fā)明化合物作為藥物具有毒性小、安全等特點。
文檔編號A61K9/48GK1884294SQ20051007778
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權日2005年6月24日
發(fā)明者文允鎰 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所