專利名稱：用于接種的sphingoid聚烷基胺綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用鞘脂的聚烷基胺綴合物進(jìn)行接種以有效地遞送生物學(xué)活性物質(zhì)特別是抗原分子。
現(xiàn)有技術(shù)列表下列是被認(rèn)為是有關(guān)描述本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)狀況的現(xiàn)有技術(shù)列表。
US 5,334,761“Cationic lipids”；US 2001/048939“Cationic reagents of transfection”；US 5,659,011“Agents having high nitrogen content andhigh cationic charge based on dicyanimide dicyandiamide orguanidine and inorganic ammonium salts”；US 5,674,908“Highly packed polycationic ammonium，sulfonium and phosphonium lipids”；US 6,281,371“Lipopolyamines，and the preparation anduse thereof”；US 6,075,012“Reagents for intracellular delivery ofmacromolecules”；US 5,783,565“Cationic amphiphiles containing spermineor spermidine cationic group for intracellular delivery oftherapeutic molecules”；Marc Antoniu Ilies & Alexandru T.Balaban，Expert Opin.Ther.Patents.11(11)1729-1752(2001)；Miller AD.Chem.Int.Ed.Eng.371768-1785(1998)；Nakanichi T.等人J.Control Release 61233-240(1999)；
Brunel F.等人Vaccine 172192-2193(1999)；Guy B.等人Vaccine 191794-1805(2001)；Lima KM等人Vaccine 193518-3525(2001)。
背景技術(shù)：
許多能夠在亞細(xì)胞或分子水平影響細(xì)胞功能的天然生物分子和其類似物，包括蛋白和多核苷酸、外源物質(zhì)和藥物，優(yōu)選地整合到細(xì)胞中以發(fā)揮其作用。細(xì)胞膜是對這些試劑表現(xiàn)出不透性的選擇性屏障。細(xì)胞膜的復(fù)雜組成包括磷脂、糖脂和膽固醇以及膜內(nèi)和膜外蛋白，并且其功能受細(xì)胞質(zhì)組分影響，所述細(xì)胞質(zhì)組分包括Ca++和其它金屬離子、陰離子、ATP、微絲、微管、酶和Ca++結(jié)合蛋白，也受細(xì)胞外糖萼(蛋白聚糖、glycose氨基聚糖和糖蛋白)的影響。結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞組分之間的相互作用和其對外界信號的反應(yīng)形成了負(fù)責(zé)細(xì)胞類型之內(nèi)和之間表現(xiàn)出的膜選擇性的運(yùn)輸過程。
也已研究了并非天然地由細(xì)胞吸收的試劑進(jìn)入細(xì)胞的成功遞送。通過將試劑與脂質(zhì)制劑以復(fù)合方式結(jié)合可克服膜屏障，所述脂質(zhì)制劑與天然細(xì)胞膜的脂質(zhì)組成非常相似。這些制劑可通過與細(xì)胞膜接觸而與細(xì)胞膜融合，或更普便地通過pynocytosis、胞吞作用和/或吞噬作用被吸收。在所有這些過程中，結(jié)合的物質(zhì)被遞送入細(xì)胞中。
脂質(zhì)復(fù)合物也可通過克服細(xì)胞表面之間的電荷排斥而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞表面在大多數(shù)情況下是帶負(fù)電的。所述制劑的脂質(zhì)包括兩親性脂質(zhì)，例如細(xì)胞膜的磷脂，并且在水系統(tǒng)中形成各種層或聚集體例如微團(tuán)或中空脂質(zhì)小泡(脂質(zhì)體)。脂質(zhì)體可用于將要被遞送的物質(zhì)捕獲入脂質(zhì)體中；在其它應(yīng)用中，目的藥物分子可作為內(nèi)膜成分被整合入脂質(zhì)小泡中，而不是被捕獲到中空的含水的內(nèi)部，或靠靜電吸附在聚集體表面。然而，所用的大多數(shù)磷脂是兼性(中性)或帶負(fù)電的。
細(xì)胞內(nèi)遞送領(lǐng)域內(nèi)的進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)帶正電荷的合成的陽離子脂質(zhì)，N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲銨氯化物(DOTMA)，可以脂質(zhì)體或小泡的形式自發(fā)地與DNA相互作用形成脂質(zhì)-DNA復(fù)合物，所述復(fù)合物可以吸附到細(xì)胞膜上并通過融合或更可能地通過吸附性內(nèi)吞作用被細(xì)胞吸收，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的表達(dá)[Felgner，P.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 847413-7417(1987)和美國專利號4,897,355，Eppstein，D.等人]。其它進(jìn)展已成功地使用DOTMA類似物，1，2-二(油基氧基)-3-(三甲基銨基)丙烷(DOTAP)，和磷脂形成復(fù)合DNA的小泡。LipofectinTM試劑(Bethesda ResearchLaboratories，Gaithersburg，MD.)包含由帶正電的脂質(zhì)DOTMA和稱作輔助脂質(zhì)的中性脂二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)組成的帶正電的脂質(zhì)體，所述LipofectinTM試劑是用于遞送高度陰離子的多核苷酸進(jìn)入活組織培養(yǎng)細(xì)胞的有效試劑。這些脂質(zhì)體自發(fā)地與帶負(fù)電的核酸相互作用形成稱作lipoplex的復(fù)合物。當(dāng)使用超過DNA負(fù)電荷的帶正電的脂質(zhì)體時(shí)，所得到的復(fù)合體上的凈電荷也是正的。以這種方式制備的帶正電的復(fù)合物自發(fā)地吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞表面上或通過吸附性內(nèi)吞作用或與質(zhì)膜融合被導(dǎo)入細(xì)胞中，兩個(gè)過程都將功能性多核苷酸遞送至例如組織培養(yǎng)細(xì)胞中。DOTMA和DOTAP是單陽離子脂質(zhì)的很好示例。[Illis等人2001，同前]也已顯示多價(jià)陽離子其自身(包括多胺、無機(jī)鹽和復(fù)合物和脫水溶劑)促進(jìn)將大分子遞送入細(xì)胞中。特別地，多價(jià)陽離子導(dǎo)致寡和聚陰離子(核酸分子、氨基酸分子等)坍縮成緊湊的結(jié)構(gòu)形式，并且促進(jìn)這些聚陰離子包裝入病毒中，整合入脂質(zhì)體中，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)等。[Thomas T.J.等人Biochemistry 383821-3830(1999)]。最小的能夠壓縮DNA的天然聚陽離子是多胺亞精胺和精胺。通過連接體將疏水錨附著在這些分子上已發(fā)展出新的轉(zhuǎn)染載體種類，聚陽離子lipopolymer。
陽離子脂質(zhì)和陽離子多聚體與DNA(或任何其它聚陰離子大分子)的陰離子基團(tuán)通過靜電相互作用而形成DNA-脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplex)或DNA-聚陽離子復(fù)合物(polyplex)。所述復(fù)合物的形成與脂質(zhì)或多聚體的平衡離子釋放相關(guān)，所述平衡離子的釋放是lipoplex和polyplex自發(fā)形成的熱力學(xué)驅(qū)動力。陽離子脂質(zhì)可分為四類；(i)季銨鹽脂質(zhì)(例如，DOTMA(LipofectinTM)和DOTAP)和鏻/鉮同類物；(ii)lipopolyamine；(iii)含有季銨和多胺部分的陽離子脂質(zhì)；和(iv)脒的鎓鹽(amidinium)、胍的鎓鹽(guanidinium)和雜環(huán)鹽脂質(zhì)。
發(fā)明簡述根據(jù)其一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用sphingoid-聚烷基胺綴合物制備用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的藥物組合物的用途。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，sphingoid-聚烷基胺綴合物包含sphingoid主鏈，所述sphingoid主鏈通過氨基甲酰鍵攜帶至少一個(gè)聚烷基胺鏈。
此處所用的術(shù)語sphingoid-聚烷基胺綴合物是指sphingoid堿(sphingoid base，此處也指術(shù)語“sphingoid主鏈”)和至少一個(gè)聚烷基胺鏈之間的化學(xué)綴合物(連接體)。sphingoid堿和至少一個(gè)聚烷基胺鏈之間的綴合是通過氨基甲酰鍵進(jìn)行的，在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
此處所用的sphingoid堿/主鏈包括長鏈脂肪族胺，其包含兩個(gè)或三個(gè)羥基基團(tuán)，所述脂肪族鏈可以是飽和的或不飽和的。不飽和sphingoid堿的一個(gè)示例是在第4位含有特殊的反式雙鍵的sphingoid堿。
此處所用的術(shù)語調(diào)節(jié)是指任何通過生物學(xué)活性物質(zhì)(由綴合物遞送的)表現(xiàn)的可測量的對受試者的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)或生物化學(xué)作用，所述應(yīng)答包括細(xì)胞應(yīng)答和/或體液應(yīng)答。當(dāng)將sphingoid-聚烷基胺綴合物和生物學(xué)活性物質(zhì)施用給所述受試者時(shí)，調(diào)節(jié)作用包括抑制，或另一方面刺激或增強(qiáng)兩種類型應(yīng)答中的任一種或兩者。所述調(diào)節(jié)優(yōu)選地涉及，相對于未與綴合物一起施用的生物學(xué)活性分子所起的作用，具有2倍或更高的刺激或增強(qiáng)。本發(fā)明也涉及在生物學(xué)活性物質(zhì)當(dāng)不與綴合物一起施用時(shí)基本上不能有效地產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況下對這種免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。
此外，調(diào)節(jié)作用涉及受試者免疫應(yīng)答的抑制或壓制，例如用于治療自身免疫疾病以及用于治療過敏。
因此，此處所用的術(shù)語生物學(xué)活性分子是指在與sphingoid-聚烷基胺綴合物一起施用時(shí)對受試者的免疫系統(tǒng)具有功效的任何物質(zhì)。所述生物學(xué)活性物質(zhì)優(yōu)選地是抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽或抗原糖類。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括為所述受試者提供sphingoid-聚烷基胺綴合物和生物學(xué)活性分子，所述sphingoid-聚烷基胺綴合物包含通過氨基甲酰鍵攜帶至少一個(gè)聚烷基胺鏈的sphingoid主鏈。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的藥物組合物，所述組合物包含(i)至少一種sphingoid-聚烷基胺綴合物；和(ii)至少一種與所述綴合物相結(jié)合的生物學(xué)活性分子。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供復(fù)合物，其包含(i)sphingoid-聚烷基胺綴合物和(ii)能夠調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的生物學(xué)活性物質(zhì)。
最后，本發(fā)明涉及定義為生物學(xué)活性分子(例如，抗原分子)的捕獲劑的sphingoid-聚烷基胺綴合物的用途。在本上下文中，sphingoid-聚烷基胺綴合物可形成用于捕獲生物學(xué)活性物質(zhì)(優(yōu)選為抗源分子和/或免疫刺激劑和/或免疫抑制劑)的試劑盒的部分，除了所述綴合物以外，所述試劑盒包括說明使用其捕獲生物學(xué)活性分子的說明書。試劑盒中的綴合物可以干燥的形式存在，在這種情況下，所述試劑盒也可包含合適的液體，在綴合物使用前將所述液體與所述綴合物混合以形成懸浮液或乳液或溶液，或其本身也可以液體(懸浮液、乳液、溶液等)形式存在。所述試劑盒可具有許多應(yīng)用。例如，所述試劑盒可用于檢查不同免疫調(diào)節(jié)分子在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的功能，用于分離活性生物分子及其鑒定。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會知道如何利用這種捕獲劑以用于研究目的。
此處所用的術(shù)語捕獲劑是指綴合物，所述綴合物借助于其聚陽離子結(jié)構(gòu)能夠與生物學(xué)活性分子結(jié)合，后者具有負(fù)電荷、負(fù)偶極或局部負(fù)電荷(分子內(nèi)攜帶凈負(fù)電荷的區(qū)域)。所述捕獲本身涉及要被捕獲的分子和本發(fā)明的帶正電的綴合物之間的靜電相互作用，所述要被捕獲的分子攜帶所述負(fù)電荷、負(fù)偶極或局部負(fù)電荷。
本發(fā)明的綴合物也可用作遞送載體，通過將生物學(xué)活性物質(zhì)捕獲到其中而將其運(yùn)送到靶位點(diǎn)或運(yùn)送入靶細(xì)胞中。
附圖簡述為了理解本發(fā)明和了解其在實(shí)踐中可以是如何進(jìn)行的，現(xiàn)在僅通過非限定性的實(shí)例和相關(guān)的附圖描述一些實(shí)施方案，其中

圖1A-1D表示幾種可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)，“線性的”、“支化的”或“環(huán)形的”脂質(zhì)樣陽離子(LLC)化合物，所述化合物被包括在式(I)sphingoid-聚烷基胺綴合物的一般定義中，其中圖1A表示連接到單個(gè)聚烷基胺鏈的sphingoid主鏈(神經(jīng)酰胺)，圖1B和圖1C表示連接到兩個(gè)聚烷基胺鏈的相同sphingoid主鏈，圖1D仍表示相同的主鏈，但其中單個(gè)聚烷基胺鏈通過兩個(gè)羥基部分相連而形成環(huán)形的聚烷基胺綴合物。
圖2A-2F表示在胃腸-■-、肺-◆-或脾---中各種熒光標(biāo)記的脂質(zhì)制劑的生物分布和藥物動力學(xué)，未回收的為-◇-圖2A表示空DMPCDMPG(摩爾比9∶1)的分布；圖2B表示DMPC:DMPG:HN的分布；圖2C表示空DOTAP膽固醇的分布；圖2D表示DOTAP膽固醇HN的分布；圖2E表示空CCS膽固醇的分布；和最后，圖2F表示CCS-膽固醇HN的分布。
圖3A-3D表示在胃腸-■-、肺-◆-或脾-◇-中各種載有125I-HN的脂質(zhì)裝配制劑的生物分布，未回收的為-X-，特別地，圖3A表示游離125I-HN的生物分布；圖3B表示由DOTAP膽固醇組成的載有125I-HN的脂質(zhì)裝配物；圖3C表示由DMPCDMPG組成的載有125I-HN的脂質(zhì)裝配物；和圖3D表示由CCS膽固醇組成的載有125I-HN的脂質(zhì)裝配物。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及作為運(yùn)載生物學(xué)活性分子的捕獲劑的sphingoid-聚烷基胺綴合物的用途，所述生物活性分子有效地調(diào)節(jié)受試者的免疫應(yīng)答。
sphingoid-聚烷基胺綴合物是脂質(zhì)樣陽離子(LLC)化合物，其可以下列的方式合成。將N-取代的長鏈堿特別是N-取代的sphingoid或sphingoid堿與不同的聚烷基胺或其衍生物偶聯(lián)，從而形成聚烷基胺-sphingoid實(shí)體，其就如此使用，或進(jìn)一步烷基化。
在合適的pH下的質(zhì)子化或所形成的聚烷基胺-sphingoid實(shí)體的烷基化歸因于脂質(zhì)樣化合物，具有對于與要被遞送到靶細(xì)胞中的生物學(xué)活性生物分子相互作用和與被靶向的細(xì)胞相互作用所需的正電荷。通過生物學(xué)活性分子的陰離子特性與綴合物的聚烷基胺部分之間的靜電相互作用，所述sphingoid-聚烷基胺綴合物可與生物學(xué)活性分子有效地結(jié)合，從而形成復(fù)合物(lipoplex)。
可選擇地，sphingoid-聚烷基胺綴合物可形成載有生物學(xué)活性分子的裝配物。
sphingoid-聚烷基胺綴合物可以單個(gè)脂質(zhì)樣分子的形式或以裝配物的形式存在。合適的裝配物的一個(gè)示例包括微團(tuán)或小泡，特別是脂質(zhì)體的形成。其它裝配物的示例包括微團(tuán)、反向相(invertedphase)、方體相(cubic phase)等的形成。很明顯，sphingoid聚烷基胺綴合物可以組合的小泡/微團(tuán)形式或任何其它裝配物組合的形式存在。
此處所用的脂質(zhì)裝配物是指尤其是形成微團(tuán)和脂質(zhì)體的脂質(zhì)分子的有組織的聚集體。脂質(zhì)裝配物優(yōu)選地是穩(wěn)定的脂質(zhì)裝配物。此處所用的穩(wěn)定的脂質(zhì)裝配物是指在貯存條件(4℃，在生理學(xué)介質(zhì)中)下在化學(xué)和物理上穩(wěn)定至少一個(gè)月的裝配物。
當(dāng)裝配物以小泡(例如脂質(zhì)體)的形式存在時(shí)，所述生物學(xué)活性分子可封裝于小泡中、成為其脂雙層的一部分或吸附在小泡表面(或任何這三種選擇的組合)。當(dāng)裝配物是微團(tuán)時(shí)，所述生物學(xué)活性分子可以穩(wěn)定的方式插入形成微團(tuán)的兩親性分子中和/或與其通過靜電結(jié)合。
因此，如此處所用的，術(shù)語“被封裝入”、“包含入”、“裝入”或“結(jié)合”表示綴合物和生物學(xué)活性分子之間的物理附著。所述物理附著可以是將分子保留在或滯留在由綴合物形成的裝配物(例如，小泡、微團(tuán)或其它裝配體)中；生物分子與這些裝配物的表面的非共價(jià)連接；或生物分子嵌入形成這些裝配物的sphingoid-聚烷基胺綴合物之間。應(yīng)當(dāng)指出在生理學(xué)條件下，由于sphingoid-聚烷基胺綴合物的正電荷或正偶極的作用，綴合物和生物學(xué)活性物質(zhì)之間優(yōu)選的結(jié)合是通過靜電、偶極或酸-堿相互作用產(chǎn)生的。
盡管如此，但本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)受限于sphingoid-聚烷基胺綴合物和生物學(xué)活性分子之間形成的特定類型的結(jié)合。因此，結(jié)合是指綴合物或由此形成的裝配物與能夠獲得想要的治療效應(yīng)的生物學(xué)活性物質(zhì)之間的任何相互作用。
生物學(xué)活性分子和綴合物可通過任何本領(lǐng)域已知的方法結(jié)合。這包括但不限于將綴合物和生物學(xué)活性分子后冷凍干燥或共冷凍干燥，或僅僅混合sphingoid-聚烷基胺綴合物和生物分子。尤其是在美國專利號6,156,337和6,066,331中描述了用于共冷凍干燥的方法，而尤其是在WO 03/000227中描述了用于后封裝的方法。
因此，根據(jù)其第一方面，本發(fā)明涉及使用sphingoid-聚烷基胺綴合物來制備用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的藥物組合物的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物包含sphingoid主鏈，所述主鏈通過氨基甲酰鍵攜帶至少一個(gè)，優(yōu)選地一個(gè)或兩個(gè)聚烷基胺鏈。
如上所述，sphingoid-聚烷基胺綴合物包括sphingoid主鏈和至少一個(gè)聚烷基胺鏈之間的連接，所述連接是通過對應(yīng)的氨基甲酰鍵進(jìn)行的。更優(yōu)選地，sphingoid-聚烷基胺綴合物具有通式(I) 其中
R1表示氫、支化或線性的烷基、芳基、烷基胺或-C(O)R5基團(tuán)；R2和R5獨(dú)立地表示支化或線性的C10-C24烷基、烯基或多烯基基團(tuán)；R3和R4獨(dú)立地表示-C(O)-NR6R7基團(tuán)，對于R3和R4，R6和R7可以相同或不同，并且獨(dú)立地表示氫、或飽和或不飽和的支化或線性的聚烷基胺，其中在所述聚烷基胺中一個(gè)或多個(gè)胺單元可以是季銨；或R3是氫；或R3和R4和與其結(jié)合的氧原子一起形成雜環(huán)，所述雜環(huán)包含-C(O)-NR9-[R8-NR9]m-C(O)-，R8表示飽和的或不飽和的C1-C4烷基，R9表示氫或式-[R8-NR9]n-的聚烷基胺，其中在所述聚烷基胺中，所述R9或每個(gè)烷基胺單元R8NR9可以相同或不同；和n和m獨(dú)立地表示從1至10，優(yōu)選地從3至6的整數(shù)；W表示選自-CH＝CH-、-CH2-CH(OH)-或-CH2-CH2-的基團(tuán)。
可根據(jù)本發(fā)明更特定的實(shí)施方案使用的sphingoid或sphingoid堿的非限定性示例包括鞘氨醇、二氫鞘氨醇、植物鞘氨醇、脫氫植物鞘氨醇和其衍生物。這類衍生物的非限定性示例是酰基衍生物，例如分別是神經(jīng)酰胺(N-?；拾贝?、二氫神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺和二氫植物神經(jīng)酰胺，以及ceramine(N-烷基鞘氨醇)和相應(yīng)的衍生物(例如dihydroceramine、phytoceramine等)。合適地N取代的sphingoid或sphingoid堿擁有游離的羥基基團(tuán)，所述羥基基團(tuán)可被激活并隨后與聚烷基胺反應(yīng)形成聚烷基胺-sphingoid實(shí)體。激活劑的非限定性示例是N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸鹽(N，N’-disuccinimidylcarbonate)、雙光氣或三光氣或咪唑衍生物。這些激活劑與sphingoid或sphingoid堿的反應(yīng)在一個(gè)或兩個(gè)羥基上分別產(chǎn)生琥珀酰亞胺基氧基羰基(succinimidyloxycarbonyl)、氯甲酸酯或咪唑氨基甲酸鹽衍生物。經(jīng)激活的sphingoid和聚烷基胺的反應(yīng)可產(chǎn)生如圖1所示的支化的、直鏈的(未支化的)或環(huán)形的綴合物。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，sphingoid主鏈?zhǔn)沁B接一個(gè)(圖1A)或兩個(gè)(圖1B或1C)聚烷基胺鏈的神經(jīng)酰胺，或通過兩個(gè)羥基部分連接而形成環(huán)形聚烷基胺部分(圖1D)。
所形成的sphingoid-聚烷基胺綴合物可進(jìn)一步與甲基化試劑反應(yīng)以形成季銨。所得到的化合物帶有不同程度的正電荷，這依賴于所形成的綴合物中季、伯和/或仲胺之間的比例。同樣，sphingoid-聚烷基胺綴合物以季銨化的氮鹽存在，所述季銨化的氮鹽包括但不限于氯化季銨、碘化季銨、氟化季銨、溴化季銨、季銨氧陰離子(oxyanion)鹽和其組合。
sphingoid-聚烷基胺綴合物優(yōu)選地與生物學(xué)活性分子一起使用。生物學(xué)活性物質(zhì)是任何這樣的分子，即當(dāng)與sphingoid-聚烷基胺綴合物一起施用時(shí)，所述分子對受試者的免疫系統(tǒng)具有作用，根據(jù)本發(fā)明，具有刺激或增強(qiáng)作用。相對于在不加所述綴合物的情況下給受試者提供生物學(xué)活性分子時(shí)的生物學(xué)活性分子的作用(如果有)，所述作用是其兩倍或更多倍。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述生物學(xué)活性物質(zhì)是蛋白、多肽、肽或糖類。特別地，所述生物學(xué)活性分子可以是免疫調(diào)節(jié)劑，包括抗原蛋白或抗原肽、免疫刺激劑和/或免疫抑制劑。抗原蛋白和肽、免疫刺激劑和免疫抑制劑在本領(lǐng)域都是熟知的。優(yōu)選地，所述生物學(xué)活性蛋白或肽或糖類在生理學(xué)pH下具有凈負(fù)偶極矩、凈負(fù)電荷或含有至少一個(gè)具有凈負(fù)電荷的帶負(fù)電的區(qū)域。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述生物學(xué)活性物質(zhì)是核酸分子，例如寡脫氧核苷酸(ODN)。
sphingoid-聚烷基胺綴合物和生物學(xué)活性物質(zhì)之間的優(yōu)選重量比是1000∶1至1∶1的重量比。
sphingoid-聚烷基胺綴合物也可與其它已知與抗原分子一起使用的活性物質(zhì)組合。這些物質(zhì)包括，例如，免疫刺激性試劑(也稱作“免疫刺激劑”或“佐劑”)。其包括任何這樣的物質(zhì)，即當(dāng)將所述物質(zhì)加入疫苗中時(shí)，其提高免疫應(yīng)答而使得只需較少的疫苗產(chǎn)生較大的應(yīng)答?？膳c綴合物/生物學(xué)活性物質(zhì)一起或在特定的時(shí)間間隔內(nèi)(例如，在施用綴合物/生物學(xué)活性分子之前或之后數(shù)小時(shí)或數(shù)天)提供免疫刺激性試劑。
優(yōu)選的免疫刺激性試劑包括但不限于細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素(IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18)、干擾素(IFN-α、β、γ)、寡脫氧核苷酸(ODN)、毒素(例如霍亂毒素(CT)、葡萄球菌腸毒素B(SEB)、熱標(biāo)記大腸桿菌(E.Coli)腸毒素(HLT))以及任何其它已知在本領(lǐng)域用于增強(qiáng)或刺激對抗原分子的免疫應(yīng)答的佐劑。
裝配物可包括作為唯一的脂質(zhì)樣成分的sphingoid-聚烷基胺綴合物(非甲基化或甲基化的)，或與其它輔助脂質(zhì)物質(zhì)組合。所述輔助脂質(zhì)物質(zhì)可以以不同的與該脂質(zhì)樣化合物的摩爾比包含非陽離子脂質(zhì)樣DOPE、DOPC、DMPC、膽固醇、油酸或其它。膽固醇是優(yōu)選的用于體內(nèi)使用的添加物質(zhì)，而DOPE可以是優(yōu)選的用于體外使用的輔助脂質(zhì)。在該特定的實(shí)施方案中，膽固醇對陽離子脂質(zhì)的摩爾比在0.01-1.0范圍內(nèi)，優(yōu)選地在0.1-0.4范圍內(nèi)。
裝配物也可以包括增強(qiáng)物(如本領(lǐng)域已知的，例如CaCl2和可溶性聚烷基胺)。
其它可包括在脂質(zhì)裝配物中和已知用于類似結(jié)構(gòu)中的組分是空間穩(wěn)定劑。普便使用的空間穩(wěn)定劑的一個(gè)示例是lipopolymer家族，例如聚乙二醇衍生的脂質(zhì)(PEG-脂質(zhì)綴合物)。已知該化合物家族尤其可增加(延長)脂質(zhì)的循環(huán)時(shí)間。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所形成的脂質(zhì)體可被塑形成具有大約50-5000nm直徑的大小不一的異質(zhì)和異層(heterolamellar)小泡(UHV)。通過進(jìn)一步處理可減少所形成的UHV的尺寸并轉(zhuǎn)化成具有大約50-100nm直徑的大(更均一)的單層小泡。小泡的結(jié)構(gòu)和尺寸例如其形狀和大小對其作為將活性生物學(xué)實(shí)體遞送到靶的載體的效力可具有重要的意義，即，這些決定其遞送性能。
上文已就式(I)在結(jié)構(gòu)上定義了形成sphingoid-聚烷基胺綴合體的部分的優(yōu)選的一組聚烷基胺鏈。根據(jù)該實(shí)施方案，在式(I)的綴合體中可以相同或不同的聚烷基胺鏈選自精胺、亞精胺、聚烷基胺類似物或其組合。術(shù)語聚烷基胺類似物表示任何聚烷基胺鏈，并且根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案是指包含1至10個(gè)胺基團(tuán)，優(yōu)選地3至6個(gè)和更優(yōu)選地3或4個(gè)胺基團(tuán)的聚烷基胺。聚烷基胺鏈內(nèi)的每個(gè)烷基胺可以是相同的，或不同的，并且可以是伯、仲、叔或季胺。
在聚烷基胺鏈內(nèi)可以是相同或不同的烷基部分優(yōu)選地是C1-C6脂肪族重復(fù)單元。一些非限定性的聚烷基胺示例包括亞精胺、N-(2-氨乙基)-1，3-丙烷-二胺、3，3’-亞氨基二丙基胺、精胺和精胺的二(乙基)衍生物、聚乙烯亞胺。
本發(fā)明的最優(yōu)選的sphingoid-聚烷基胺綴合物為N-棕櫚酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲?；?CCS)。該綴合物包含通過氨基甲酰鍵而與精胺連接的神經(jīng)酰胺。
本發(fā)明的sphingoid-聚烷基胺綴合物優(yōu)選用于制備疫苗。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，sphingoid-聚烷基胺綴合物，優(yōu)選地為CCS，用于制備流感疫苗。在該特定的實(shí)施方案中，生物學(xué)活性物質(zhì)來源于流感病毒或來源于流感病毒的分子的生物學(xué)活性類似物。這些類似物包括任何這樣的物質(zhì)，即所述物質(zhì)包含來源于引起免疫應(yīng)答的來源于流感的抗原片段。
具體的來源于流感的抗原物質(zhì)是血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)分子，組合稱作HN。
本發(fā)明也涉及用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括用sphingoid-聚烷基胺綴合體和生物學(xué)活性物質(zhì)治療所述受試者。
組合治療包括將sphingoid-聚烷基胺綴合物和生物學(xué)活性物質(zhì)一起或在預(yù)先確定的時(shí)間間隔例如數(shù)小時(shí)或數(shù)天之內(nèi)施用(任選地和免疫刺激劑一起)。然而，根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，在給受試者施用前將綴合物和生物學(xué)活性物質(zhì)混合在一起。
將sphingoid-聚烷基胺和生物學(xué)活性物質(zhì)一起施用涉及本發(fā)明的另一個(gè)方面。因此，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含生理學(xué)可接受的載體以及有效量的sphingoid-聚烷基胺綴合物和生物學(xué)活性物質(zhì)。藥物組合物任選地包含免疫刺激劑。
可將sphingoid-聚烷基胺綴合物與生物學(xué)活性物質(zhì)一起施用并且根據(jù)考慮了個(gè)體患者的臨床狀況、施用的位點(diǎn)和方法、施用的時(shí)間安排、患者年齡、性別、體重和醫(yī)生已知的其它因素的良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐來確定劑量。
此處的“有效量”是指相對于在無sphingoid-聚烷基胺綴合物的情況下提供生物學(xué)活性物質(zhì)給受試者時(shí)所獲得的效應(yīng)，可有效地調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或刺激，如上面所定義的)受試者的免疫應(yīng)答的量。優(yōu)選地，所述量對獲得有效的受試者抗特定疾病或病癥的免疫是有效的。
盡管如上所述，所述量可以為對獲得遏制或抑制免疫應(yīng)答例如用于治療過敏或自身免疫應(yīng)答是有效的。
包含與生物學(xué)活性物質(zhì)結(jié)合的sphingoid-聚烷基胺的本發(fā)明組合物可以各種方式施用。非限定性的施用途徑的示例包括經(jīng)口、皮下(s.c.)、腸胃外(包括靜脈內(nèi)(i.v.)、動脈內(nèi)(i.a.)、肌內(nèi)(i.m.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、直腸內(nèi)(i.r.)和鼻內(nèi)(i.n.)施用，以及通過輸注技術(shù)進(jìn)行眼內(nèi)施用。優(yōu)選的施用模式是鼻內(nèi)或肌內(nèi)施用。
根據(jù)本發(fā)明，生理學(xué)可接受的載體通常是指惰性的、非毒性的固體或液體物質(zhì)，所述物質(zhì)優(yōu)選地不與生物學(xué)活性物質(zhì)或綴合物反應(yīng)并且是對于有效地遞送具有生物學(xué)活性分子的綴合物所需的。
生理學(xué)可接受的載體的非限定性示例包括水、鹽水、5％葡萄糖、10％蔗糖等，單獨(dú)地或與少量(至多10％)醇例如乙醇一起。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物是液體制劑，包括懸浮液、水溶液或以氣霧劑的形式存在，所有這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的?？蓪忪F劑制劑置于加壓的可接受的推進(jìn)劑中，例如丙烷、氮?dú)獾取Ｋ鼈円部膳渲瞥伤幬?，其用于非加壓制劑，例如在噴霧器或霧化器中合適的載體。
具體實(shí)施例的描述流感裝載HN抗原的陽離子脂質(zhì)體的表征在膽固醇(Chol)存在或不存在的情況下，以不同脂質(zhì)/蛋白w/w比例(3/1-300/1)檢驗(yàn)裝載至各種陽離子脂質(zhì)體制劑的HN(商業(yè)可獲得的來源于流感病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶制劑)的封裝效率。表1顯示該實(shí)驗(yàn)(使用陽離子脂質(zhì)DOTAP和CCS)的結(jié)果。
表1-脂質(zhì)(DOTAP，CCS)/蛋白比例和膽固醇(Chol)對HN封裝效率的影響
單價(jià)疫苗用于DOTAP，三價(jià)疫苗用于CCS。
在Chol存在或不存在的情況下，使用50/1至300/1的脂質(zhì)/蛋白w/w比例裝載DOTAP的百分比是75-90％。在30/1至300/1的脂質(zhì)/蛋白w/w比例下獲得大約90％的抗原裝載，在10/1和3/1的w/w比例下，分別下降至79％和35％。在1/1和2/1的DOTAP/Chol摩爾比例下，向制劑中加入Chol不影響裝載，在4/1的比例下加入Chol會稍微降低封裝(80％)。對于CCS，在Chol存在或不存在的情況下，加載效率較低(在100/1-300/1的w/w比例下，64-73％)。
也已確定通過簡單地將可溶性抗原與預(yù)制的空脂質(zhì)體混合使HN與脂質(zhì)體結(jié)合。在該情況下，無論何種制劑，使用100/1至300/1的脂質(zhì)/蛋白w/w比例可使40-60％的抗原與脂質(zhì)體結(jié)合。
這些發(fā)現(xiàn)總地表明在所有制劑中使用簡單和快速(5分鐘)方法可獲得高裝載效率(＞60％)。此外，甚至在水懸浮液中預(yù)制的脂質(zhì)體也能夠有效地與流感病毒表面抗原結(jié)合。
也估計(jì)了各種脂質(zhì)/抗原w/w比例(在加入或不加入膽固醇的情況下)的免疫原性。
在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在用裝載HN的中性、陰離子或陽離子脂質(zhì)體鼻內(nèi)接種幼(2個(gè)月大小)BALB/c小鼠后測定HI、IgG1和IgG2a抗體的血清水平(表2A)。所述HN抗原是來源于A/New Caledonia(H1N1)株系的單價(jià)亞單位疫苗。在相同的實(shí)驗(yàn)中，也檢測HI、IgG1、IgG2a和IgA抗體在肺和鼻中的水平和由脾細(xì)胞產(chǎn)生的INFγ水平(表2B和2C)。
表2A-HI、IgG1和IgG2a抗體的血清水平
F-HN，游離抗原；Chol，膽固醇；CT，霍亂毒素。第5-10組是陽離子脂質(zhì)體。在圓括號內(nèi)，血清轉(zhuǎn)變百分?jǐn)?shù)-具有HI滴度≥40的小鼠的百分?jǐn)?shù)。
特別地，關(guān)于在兩次鼻內(nèi)施用后誘導(dǎo)局部和全身性應(yīng)答對內(nèi)裝HN抗原的中性(DMPC)、陰離子(DMPC/DMPG，9/1摩爾比)和陽離子(6種制劑)裝配物(Lip)進(jìn)行比較。對于所有制劑，脂質(zhì)/HN w/w比例為300/1，陽離子脂質(zhì)/Chol或陽離子脂質(zhì)/DOPE摩爾比為1/1。平行地檢測游離的抗原(F-HN)和與作為佐劑的霍亂毒素(CT，1μg)一起施用的F-HN。在第0和7天施用疫苗，3μg/劑(每鼻孔10μl)，在第二次施用疫苗后4-6周測定應(yīng)答。
表2B-IgG1、IgG2a和IgA抗體的肺和鼻洗出水平
表2C-脾INFγ水平(pg/ml)
如表2A-2C中所示，游離的抗原以及中性和陰離子Lip-HN實(shí)際上是無效的粘膜疫苗。相反地，陽離子Lip-HN，特別是稱作DOTAP-HN、DMTAP-HN和CCS-HN的那些引起強(qiáng)烈的具有高IgG1、IgG2a和IgA抗體水平的全身性粘膜體液應(yīng)答，即混合的Th1+Th2應(yīng)答。沒有檢測到IgE抗體。包含DOTAP-HN、DMTAP-HN和CCS-HN的陽離子脂質(zhì)體疫苗在經(jīng)抗原刺激的脾細(xì)胞中也誘導(dǎo)高水平的IFNγ(但不是IL-4)。由CCS-HN產(chǎn)生的應(yīng)答甚至比由以CT為佐劑的F-HN誘導(dǎo)的應(yīng)答要強(qiáng)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，只可進(jìn)一步使用陽離子脂質(zhì)體制劑DOTAP-HN、DMTAP-HN和CCS-HN。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，測定脂質(zhì)/HN w/w比例對裝載HN的陽離子脂質(zhì)體和與可溶性抗原簡單混合的預(yù)制的脂質(zhì)體的免疫原性。顯示于表3A-3C中的數(shù)據(jù)表明所有這三種制劑都誘導(dǎo)強(qiáng)的全身性(血清)和局部性(肺)應(yīng)答，并且顯示將脂質(zhì)/HN w/w比例降低至低于100/1可顯著地降低應(yīng)答。
表3A-HI、IgG1、IgG2a和IgA抗體的血清水平
在第18-20組中預(yù)制的脂質(zhì)體與可溶性抗原混合。
表3B-HI、IgG1、IgG2a和IgA的肺水平
表3C-脾INFγ水平(pg/ml)
通過高水平的血清和肺IgG2a和IgA抗體(組12-16)的反映，再一次看到Lip CCS-HN疫苗優(yōu)于其它疫苗制劑的優(yōu)勢。有趣地，將可溶性抗原與預(yù)制的脂質(zhì)體簡單混合產(chǎn)生與封裝有所述抗原的質(zhì)脂體相同的非常有效的疫苗(組18-20)。這暗示著真正的抗原封裝對陽離子裝配物/脂質(zhì)體的佐劑性可能不是必需的。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)?zāi)懝檀紝ρb載HN的脂質(zhì)體的免疫原性的影響。表4A-4C顯示該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)果表明在2/1和4/1的摩爾比例(組4，5)下，Chol的加入稍微減少了對DOTAP-HN的全身性HI應(yīng)答，但在1/1的摩爾比例(組3)下沒有減少該應(yīng)答，而在所有比例(組7-9)下中度地增加了對DMTAP-HN的總體應(yīng)答和在1/1的比例(組11)下中度地增加了對CCS-HN的局部(肺)應(yīng)答。
表4A-HI、IgG1、IgG2a和IgA抗體的血清水平
表4B-HI、IgG1、IgG2a和IgA抗體的肺水平
表4C-脾INFγ水平(pg/ml)
在對老(18個(gè)月)C57BL/6小鼠肌內(nèi)(一次，在第0天)或鼻內(nèi)(2次，第0和7天)分別施用1μg和2μg亞單位(HN)疫苗(來源于A/Panama[H3N2]病毒)后評估CCS-HN疫苗的免疫原性。脂質(zhì)裝配物由CCS/膽固醇(3∶2的摩爾比例)組成，脂質(zhì)/HN w/w比例為200∶1。與商業(yè)可購得的疫苗的0活性相反，CCS-HN疫苗引起高水平的血清HI和IgG2a抗體(接種后4周檢測的)和肺(接種后6周檢測的)IgG2a和IgA抗體，可在表5A和5B中看到所述結(jié)果(數(shù)據(jù)顯示平均滴度)。
表5A-老年小鼠中HI、IgG1、IgG2a和IgA的血清水平
表5B-老年小鼠中IgG1、IgG2a和IgA的肺水平
此外，檢測各種疫苗制劑對于細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。具體地，用各種陽離子脂質(zhì)體制劑鼻內(nèi)免疫幼年小鼠并在接種6周后測量脾細(xì)胞應(yīng)答-細(xì)胞毒性、增殖和IFNγ的產(chǎn)生。在所述實(shí)驗(yàn)中，所得結(jié)果顯示于表6中，裝載HN的脂質(zhì)體(組3-10)和單獨(dú)給予的(組2)或與預(yù)制的空脂質(zhì)體混合的(組11-13)游離抗原(F-HN)之間進(jìn)行比較。也測定以不同脂質(zhì)/HN w/w比例(30/1-300/1)制備的Lip(DMTAP)-HN和Lip(CCS)-HN的免疫原性。
表6-通過鼻內(nèi)施用的陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)
只用100/1的脂質(zhì)/HN w/w比例的CCS-HN(組8)和用所有三種預(yù)制的與游離抗原共施用的脂質(zhì)體(DOTAP、DMTAP和CCS)獲得優(yōu)選的抗特定靶細(xì)胞(用流感肽脈沖的P815)的細(xì)胞毒性。用DMTAP-HN在50/1和30/1的脂質(zhì)/HN w/w比例下和用CCS-HN在300/1、100/1和50/1的比例下觀察到最大的增殖應(yīng)答。由最有效的脂質(zhì)體制劑引起的增殖和細(xì)胞素性應(yīng)答比由游離抗原誘導(dǎo)的高2-3倍。
這些發(fā)現(xiàn)暗示在體液應(yīng)答(表3)中，在100/1-300/1的脂質(zhì)/HN w/w比例下獲得測量的所有類型抗體的最高水平，與之相比，較低w/w比例(例如，30/1-100/1)對細(xì)胞應(yīng)答是最佳的。此外，盡管DMTAP-HN引起強(qiáng)體液應(yīng)答，但與CCS-HN相比，該制劑是較弱的細(xì)胞毒性活性的誘導(dǎo)劑。有趣地，用懸浮液中游離抗原和預(yù)制的陽離子脂質(zhì)體(所有三種制劑)的混合物進(jìn)行疫苗接種引起良好的細(xì)胞應(yīng)答，所述應(yīng)答在程度上與由封裝的抗原誘導(dǎo)的應(yīng)答相似。因此，簡單地將游離抗原與預(yù)制的陽離子脂質(zhì)體混合可足以誘導(dǎo)強(qiáng)體液(表3A-3C)和細(xì)胞(表6)應(yīng)答。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，其結(jié)果顯示于表7A-7C，就免疫原性和對活病毒攻擊的保護(hù)性免疫性方面，在通過肌內(nèi)施用1劑、通過鼻內(nèi)施用1或2劑和經(jīng)口施用2劑包含DOTAP、DMTAP或CCS的裝載單價(jià)HN的陽離子脂質(zhì)體之間進(jìn)行比較。在該實(shí)驗(yàn)中，脂質(zhì)/HN w/w比例是300/1，對于DOTAP和DMTAP系統(tǒng)陽離子脂質(zhì)/Chol比例為1/1，對于CCS系統(tǒng)為3/2。在這三條途徑中，鼻內(nèi)施用兩次產(chǎn)生最強(qiáng)的體液和細(xì)胞應(yīng)答以及保護(hù)性免疫性。在3種制劑中，CCS誘導(dǎo)最高的應(yīng)答，特別是在IgG2a和IgA抗體方面。
表7A-HI、IgG1、IgG2a和IgA的血清水平
表7B-肺抗體
表7C-細(xì)胞應(yīng)答和保護(hù)性免疫性
在描述于表8-10的實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)商業(yè)可獲得的三價(jià)疫苗并在單劑基于CCS的疫苗(使用2或4μg各病毒株系的抗原[HN])和兩劑疫苗(2μg/株/劑)之間進(jìn)行比較，施用之間間隔3、7或14天。脂質(zhì)裝配物由3/2摩爾比例的CCS/Chol(膽固醇)組成，對于所有制劑脂質(zhì)/HN w/w比例是100/1。作為對照，標(biāo)準(zhǔn)的三價(jià)商業(yè)可購得的疫苗(HN)單獨(dú)地或與1μg霍亂毒素(CT)(用作粘膜佐劑)一起施用。在第一劑疫苗接種后5-6周檢測血清、肺勻漿和鼻洗出物中的HI抗體(表8)以及抗原特異性IgG1、IgG2a、IgA和IgE抗體(圖9)。此外，用活病毒(使用小鼠適應(yīng)的重排列X-127病毒)鼻內(nèi)攻擊來自選出組的5只小鼠并在4天后通過定量肺部病毒滴度估量保護(hù)性(表10)。
與弱的或無免疫原性的商業(yè)可獲得的流感疫苗(HN)(組2-6)相反，CCS/Chol-流感疫苗誘導(dǎo)高滴度的所有類型的受試抗體(除了IgE未檢測到)，特別是抗兩個(gè)A病毒株系(組8-11；表8，9)的抗體。對于2劑方案，1周的間隔似乎是最優(yōu)的(組10)。對于單劑方案，4μg抗原，但不是2μg(組8和組7相比較)，誘導(dǎo)高滴度的血清HI、IgG1和IgG2a抗體和肺IgG1抗體。然而，與2劑方案相比，所述1劑方案既不引發(fā)肺IgG2a和IgA抗體，也不引發(fā)鼻抗體(表9)。
在保護(hù)性測定(表10)中，鼻內(nèi)施用(一次(4μg)或兩次(2μg/劑))的CCS-流感疫苗提供完全的抗病毒感染的保護(hù)(肺部病毒滴度減少6個(gè)log)，而標(biāo)準(zhǔn)的疫苗僅減少0.5-1個(gè)log的病毒滴度。因此，盡管對于某些抗體同種型，使用CCS-流感疫苗的單劑方案不如兩劑方案，但兩種方案都提供相似程度的保護(hù)性。
在該實(shí)驗(yàn)中，我們也比較了單獨(dú)的CCS和作為疫苗載體的CCS/Chol，并且在免疫原性上在兩種制劑之間沒有發(fā)現(xiàn)差異(數(shù)據(jù)未顯示)。另一種制劑修飾是通過擠出(直徑≤0.02μm)減小CCS/Chol脂質(zhì)裝配物的大小(直徑0.05-5μm)。由經(jīng)擠出的疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度比由非擠出的疫苗產(chǎn)生的滴度低50-80％(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在膽固醇存在或不存在的情況下，大小不一的CCS脂質(zhì)裝配物作為三價(jià)流感疫苗的疫苗載體是高度有效的。
表8-在用游離的和在CCS脂質(zhì)裝配物中的三價(jià)流感疫苗(以不同的時(shí)間間隔給幼(2個(gè)月)BALB/C小鼠施用一次或兩次)進(jìn)行鼻內(nèi)接種后，對血凝抑制(HI)抗體的引發(fā)
a用游離的(F-HN)或整合入CCS/Chol(3/2摩爾比例)脂質(zhì)裝配物(第7，9，10，11組0.6mg；第8組1.2mg)的Fluvirin2003/2004三價(jià)亞單位疫苗制劑免疫小鼠，所述制劑由A/New Caledonia/20/99(H1N1)-like、A/Moscow/10/99(H3N2)-like和B/Hong Kong/330/2001-like組成b在第一劑疫苗施用后35天在單個(gè)小鼠上測定血清HI滴度。在第42天檢測肺(匯集的)HI滴度。在括號中，具有HI滴度≥40.0的小鼠百分?jǐn)?shù)表示HI滴度＜20。
表9-在用游離的和在CCS脂質(zhì)裝配物中的三價(jià)流感疫苗(以不同的時(shí)間間隔給幼(2個(gè)月)BALB/C小鼠施用一次或兩次)進(jìn)行鼻內(nèi)接種后，對血清、肺和鼻抗原特異性IgG1、IgG2a和IgA抗體的引發(fā)
a實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)參見表8。在第一劑疫苗施用后42天匯集樣品并通過抗3個(gè)病毒株系(匯集的HN)的ELISA檢測樣品。0表示滴度＜10。
表10-在用游離的和在CCS脂質(zhì)裝配物中的三價(jià)流感疫苗進(jìn)行鼻內(nèi)接種后，幼BALB/c小鼠抗病毒攻擊的保護(hù)性
a實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)參見表8。在第4，5組中脂質(zhì)/HN w/w比例是100/1。
b在第一劑疫苗施用后42天，使用大約106個(gè)卵感染劑量50％(EID50)的小鼠適應(yīng)的重排列X-127病毒(A/Beijing/262/95[H1N1]×X-31[A/Hong Kong/1/68×A/PR/8/34)鼻內(nèi)感染小鼠。4天后收集肺，勻漿、系列稀釋并注射到10天的受精雞蛋的尿囊中。在37℃下48小時(shí)后和在4℃下16小時(shí)后，取出0.1mL尿囊液體并通過血細(xì)胞凝集檢查病毒的存在。
在描述于表11和12的實(shí)驗(yàn)中，使用各種量的HN抗原和脂質(zhì)，用CCS/Chol脂質(zhì)裝配物配制三價(jià)流感疫苗。在該實(shí)驗(yàn)中，使用下列材料制備所述疫苗(a)變化的量的抗原(每個(gè)病毒株系0.25-2μg)和脂質(zhì)(0.075-0.6mg)，保持脂質(zhì)/HN w/w比例恒定在100/1；(b)分級變化的量的抗原(0.25-2μg)和恒定量的脂質(zhì)(0.6mg)，從而改變脂質(zhì)/HN w/w比例，從100/1至800/1。如在表11(HI滴度)和表12(同種型滴度)中可看到的，分別使用2或1μg各株系的抗原和0.6或0.3mg脂質(zhì)以100/1的脂質(zhì)/HN w/w比例配制的疫苗產(chǎn)生高的和相似水平的抗所述3個(gè)病毒株系的抗體(組2，3)。在較低的抗原(0.5，0.25μg/株系)和脂質(zhì)(0.15，0.075mg)劑量下，所述應(yīng)答特別是粘膜應(yīng)答(肺、鼻)顯著降低(組4，5)(表12)。當(dāng)使用恒定劑量的脂質(zhì)時(shí)，即使使用兩個(gè)更低劑量的抗原(0.25，0.5μg/株系)(組6-8)也獲得高水平的抗體。因此，CCS脂質(zhì)的量是極其重要的，在合適的脂質(zhì)劑量下所述抗原的劑量可降低4-8倍(從1-2μg至0.25-0.5μg)。
表11-在使用用CCS脂質(zhì)裝配體配制的三價(jià)流感疫苗鼻內(nèi)接種(給幼(2個(gè)月)BALB/c小鼠施用2次(以1星期的間隔))后，抗原劑量和脂質(zhì)劑量對誘導(dǎo)HI抗體的影響
a實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)參見表8。
表12-在使用用CCS脂質(zhì)裝配體配制的三價(jià)流感疫苗鼻內(nèi)接種(給幼BALB/c小鼠施用2次(以1星期的間隔))后，抗原劑量和脂質(zhì)劑量對誘導(dǎo)血清、肺和鼻抗原特異性IgG1、IgG2a和IgA抗體的影響
a實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)參見表8、9。
在另一實(shí)驗(yàn)中，對游離的(HN)或與CCS/Chol脂質(zhì)裝配物結(jié)合的(Lip HN)亞單位流感疫苗就其誘導(dǎo)HI抗體的能力進(jìn)行檢測，所述HI抗體與各種不包含于所述疫苗中的流感A和B亞株系交叉反應(yīng)。顯示于表13中的數(shù)據(jù)表明用單價(jià)或三價(jià)基于CCS的流感疫苗實(shí)施一或二次的鼻內(nèi)(i.n.)和肌內(nèi)(i.m.)接種引發(fā)抗免疫株系的HI抗體和與幾種A/H1N1、A/H3N2和B株系(在1986-1999年流行并且不包含于所述疫苗中)交叉反應(yīng)的HI抗體的高血清滴度。在鼻內(nèi)單劑施用疫苗(組6和組7對比)后發(fā)現(xiàn)稍微降低的HI滴度。肺勻漿HI滴度(組4，8)比對應(yīng)的血清滴度低。因此，用基于CCS的疫苗進(jìn)行腸胃外或鼻內(nèi)疫苗接種可提供抗廣譜A和B病毒株系的保護(hù)作用。這些抗原變體可在由于抗原飄移導(dǎo)致的流感流行/全球流行期間出現(xiàn)。相反地，鼻內(nèi)施用的標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)可購得的疫苗在誘導(dǎo)抗同源和異源株系的抗體方面完全無效(組1，5)。
表13-在用基于CCS的單價(jià)和三價(jià)流感疫苗鼻內(nèi)或肌內(nèi)接種幼BALB/c小鼠后對株系交叉反應(yīng)性HI抗體的誘導(dǎo)
a檢測接種5周后獲得的匯集的血清和肺勻漿中的HI抗體。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)參見表8。脂質(zhì)(Lip)裝配物由CCS/Chol(3/2的摩爾比例)組成，在組2-4中脂質(zhì)/HN w/w比例是300/1，組6-8中為100/1。除了組3和6以外，兩劑疫苗之間間隔1周。粗體表示抗免疫株系的抗體滴度。0表示HI滴度＜10。
載有HN并鼻內(nèi)施用的陰離子和陽離子脂質(zhì)體的生物分布在生物分布實(shí)驗(yàn)中，將空的或載有流感HN抗原的脂質(zhì)裝配物的3種制劑DMPC/DMPG(陰離子)、DOTAP/Chol(陽離子)和CCS/Chol(陽離子)經(jīng)鼻內(nèi)施用(每只小鼠200μg脂質(zhì)，2μg抗原)給BALB/c小鼠。然后在24小時(shí)內(nèi)(在施用后1，5和24小時(shí))在各種組織的勻漿中追蹤熒光標(biāo)記的脂質(zhì)。
可在下列的表14和在圖2A-2F中看出，在1和5小時(shí)后，經(jīng)施用的所檢測的所有三種制劑的脂質(zhì)回收了75-100％。然而在所有制劑中(除了CCS制劑外)該回收率在24小時(shí)時(shí)顯著下降。在3個(gè)靶器官(鼻、肺、GI道)中含有HN抗原的CCS制劑表現(xiàn)最長的保留時(shí)間(＞24小時(shí))，而在腦中沒有脂質(zhì)積累并且在其它受試器官(肝、腎、心臟、脾)中沒有顯著的積累。
表14鼻內(nèi)施用的熒光標(biāo)記的脂質(zhì)裝配物在1、5和24小時(shí)的回收率
當(dāng)使用125I標(biāo)記的HN時(shí)，其生物分布類似于熒光脂質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。CCS疫苗組分在呼吸道和GI道中的這種長時(shí)間保留可部分地解釋其優(yōu)于其它脂質(zhì)體制劑的免疫原性。這顯示于下列追蹤疫苗的抗原組分的研究中。用125I標(biāo)記HN蛋白，并游離地或與一種用于熒光生物分布實(shí)驗(yàn)中的脂質(zhì)制劑一起經(jīng)鼻內(nèi)施用。在滴注后1，5和24小時(shí)測定各種組織的放射性。
表15說明在該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中抗原的回收率也很高。在圖3A-3D中可看出，125I標(biāo)記的HN生物分布模式與脂質(zhì)(圖2A-2F)的生物分布模式相似，進(jìn)一步確定(a)在體內(nèi)HN蛋白和脂質(zhì)裝配物之間確實(shí)存在結(jié)合，和(b)當(dāng)與陽離子脂質(zhì)裝配物結(jié)合時(shí)抗原在鼻內(nèi)延長的保留可歸因于陽離子裝配物而不是HN蛋白本身的性質(zhì)，因?yàn)楫?dāng)HN蛋白自身以可溶形式施用時(shí)無HN保留。
該實(shí)驗(yàn)還可說明當(dāng)單獨(dú)地或與脂質(zhì)裝配物(主要出于安全考慮使用鼻內(nèi)接種)結(jié)合施用HN蛋白時(shí)在腦中無HN蛋白積累。因?yàn)榉派湫宰粉櫡椒ㄟh(yuǎn)比熒光方法靈敏，所以該結(jié)果更具可信性。
表15單獨(dú)地或與脂質(zhì)裝配體結(jié)合地經(jīng)鼻內(nèi)施用的125I標(biāo)記的HN在1、5和24小時(shí)的回收率
為了檢測在各種組織中蛋白和脂質(zhì)是否以相似或不同的動力學(xué)保留和/或清除，進(jìn)行另一種數(shù)據(jù)分析，其中確定在各時(shí)間點(diǎn)在各種組織中抗原保留百分?jǐn)?shù)(占施用的總劑量)和脂質(zhì)保留百分?jǐn)?shù)之間的比例。當(dāng)比例是恒定的且恒等于1，其表示在相同的器官中兩種組分都得以相似地保留，而當(dāng)該比例大于或小于1時(shí)，其暗示各組分的清除動力學(xué)不相同，并且一種組分的清除快于另一組分。
從下面的表16中可看出，隨時(shí)間保持恒定的比例只有CCS/Chol-HN在鼻中的比例(比例為大約0.45)。這暗示著(a)相對于DMPC/DMPG，在鼻中使用CCS和DOTAP的抗原的高保留性與結(jié)合的水平相關(guān)，并且歸因于這些制劑與鼻粘膜的結(jié)合；和(b)其它制劑的組分在體內(nèi)解離并以不同的速率被清除，而基于CCS-HN的制劑是穩(wěn)定的，特別是在鼻中，這可能是在使用基于CCS的疫苗時(shí)觀察到增強(qiáng)的免疫原性的原因。
表16 在鼻內(nèi)施用后脂質(zhì)和HN抗原的保留
所述值顯示所施用的總脂質(zhì)或HN蛋白的保留百分?jǐn)?shù)鼻內(nèi)流感疫苗的初步安全研究毒性(局部的、全身的)是使用肌內(nèi)和鼻內(nèi)疫苗的主要考慮問題，因此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性毒性研究。對小鼠(n＝4/組)鼻內(nèi)施用(兩次，間隔1周)載有流感抗原血凝素+神經(jīng)氨酸酶(HN)的陽離子脂質(zhì)制劑(基于DMTAP、DOTAP、CCS)，72小時(shí)后進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)(總的，分類的)、血液化學(xué)和組織學(xué)檢查(鼻、肺切片)。小鼠顯示沒有明顯的任何毒性跡象。血細(xì)胞計(jì)數(shù)和血液化學(xué)在正常的范圍之內(nèi)，并且如所預(yù)期的，在用陽離子制劑處理的小鼠的鼻和肺內(nèi)觀察到最小至中等的炎癥應(yīng)答。類似地，雖然較不顯著，也在一些單獨(dú)地用鹽水或用非封裝的抗原處理的小鼠中觀察到炎癥應(yīng)答。
小鼠中CCS-流感疫苗的免疫調(diào)節(jié)活性在這些實(shí)驗(yàn)中，用具有或不具有HN抗原的各種脂質(zhì)體制劑(0.5-1mg脂質(zhì))(由DMPC、DMPC/DMPG、DOTAP/Chol、CCS/Chol組成)腹膜內(nèi)注射小鼠。在注射脂質(zhì)體制劑前2天用巰基乙酸鹽(TG，增加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生)腹膜內(nèi)注射或不處理小鼠。在施用脂質(zhì)體后24-48小時(shí)收獲腹膜細(xì)胞，然后就這樣使用或在37℃下在吸附至塑料培養(yǎng)皿4小時(shí)并除去非粘附的細(xì)胞后使用。在其他實(shí)驗(yàn)中，從TG處理的小鼠中收獲腹膜細(xì)胞并用脂質(zhì)體制劑溫育24-48小時(shí)。通過流式細(xì)胞儀就MHC II和共刺激劑分子CD40和B7的表達(dá)檢測細(xì)胞。檢測上清液中的細(xì)胞因子干擾素γ(IFNγ)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細(xì)胞介素12(IL-12)，和檢測一氧化氮(NO)。
所有陽離子制劑(CCS/Chol、DOTAP/Chol、DMTAP/Chol)在上調(diào)B7和CD40的表達(dá)方面超過其它制劑(DMPC[中性]、DMPC/DMPG[陰離子])并且誘導(dǎo)更高水平的IFNγ和IL-12。在一些情況下，CCS/Chol制劑比其它陽離子制劑更有效。沒有任何一種所述制劑誘導(dǎo)顯著的TNFα和NO水平。陽離子制劑導(dǎo)致的抗原呈遞細(xì)胞上的共刺激分子的增強(qiáng)表達(dá)和IL-12和TNFγ的誘導(dǎo)可部分地解釋這些制劑更高的佐劑活性。這些發(fā)現(xiàn)和在鼻內(nèi)施用后CCS-流感疫苗在呼吸道內(nèi)的長保留時(shí)間(圖2C和2F以及圖3A-3D)可解釋為什么CCS是如此有效的粘膜疫苗載體/佐劑。
甲型肝炎病毒(HAV)除了流感以外，也就通過鼻內(nèi)(i.n.)和直腸內(nèi)(i.r.)途徑施用的HAV疫苗檢測了CCS脂質(zhì)裝配物的免疫增強(qiáng)潛力。
以2周的間隔兩次施用10EU(約1.5μg蛋白)的HAV疫苗(Aventis Pasteur)，并在第二劑疫苗施用之后3周通過ELISPOT技術(shù)檢測應(yīng)答。以10μg/劑的量施用用作粘膜佐劑的CpG-ODN。根據(jù)上面描述的用于流感疫苗的方法(表1)制備HAV-CCS脂質(zhì)裝配物。
表17中提供的數(shù)據(jù)顯示，盡管商業(yè)可購得的HAV疫苗不能通過兩條施用途徑(鼻內(nèi)，直腸內(nèi))在兩種受試組織(固有層，淋巴集結(jié))中誘導(dǎo)IgA應(yīng)答，但用CCS或CpG-ODN配制的疫苗在大多數(shù)情況下產(chǎn)生顯著的應(yīng)答。HAV-CCA脂質(zhì)裝配物與CpG-ODN的組合在所有情況下導(dǎo)致協(xié)同應(yīng)答。因此，CCS脂質(zhì)裝配物單獨(dú)地和特別是與CpG-ODN一起作為用于抗HAV的粘膜接種的載體/佐劑也是有效的。
表17-在用甲型肝炎病毒(HAV)疫苗單獨(dú)地和與CCS脂質(zhì)裝配物和/或CpG-ODN一起通過鼻內(nèi)(i.n.)或直腸內(nèi)(i.r.)接種BALB/c小鼠后，對IgA抗體的誘導(dǎo)
AFC-抗體形成細(xì)胞肉毒梭菌(C.BOTULINUM)在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用0.4μg劑量的商業(yè)可購得肉毒梭菌類毒素(作為bioterror劑的模型，Uruguay，不含明礬)鼻內(nèi)免疫小鼠，在第二劑疫苗施用后4周通過ELISA檢測抗體滴度。
用肉毒梭菌類毒素進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果歸納于表18中，所述結(jié)果顯示在鼻內(nèi)滴注后CCS-類毒素制劑優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)疫苗，特別是在小腸和糞便中的IgA水平方面。預(yù)期這些抗體在口部暴露時(shí)中和毒素。單獨(dú)地用疫苗鼻內(nèi)免疫的小鼠不產(chǎn)生IgA。
表18-在用游離的或CCS結(jié)合的肉毒梭菌(Clostridium botulinum)類毒素(CBT)鼻內(nèi)接種(兩次，之間間隔1周)的BALB/c小鼠中，IgG1、IgG2a和IgA抗體的誘導(dǎo)
材料化學(xué)N-棕櫚?；鵇-赤式鞘氨醇基-1-氨基甲?；?CCS)的合成(i)通過加熱將N-棕櫚?；拾贝?1.61g，3mmol)溶解在無水THF(100ml)中。將澄清的溶液置于室溫下并加入N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸鹽(1.92g，7.5mmol)。加入DMAP(0.81g，7.5mmol)并攪拌，進(jìn)一步攪拌反應(yīng)16小時(shí)。在減少的壓力的情況下除去溶劑，從正庚烷中重結(jié)晶殘留物，產(chǎn)生1.3g(68％)的白色粉末狀的二琥珀酰亞胺基神經(jīng)酰胺基碳酸鹽(熔點(diǎn)73-76℃)。
(ii)通過攪拌將精胺(0.5g，2.5mmol)和二琥珀酰亞胺基神經(jīng)酰胺基碳酸鹽(0.39g，0.5mmol)溶解在無水二氯甲烷中，然后用催化量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)處理。在室溫下攪拌溶液16小時(shí)，蒸發(fā)溶劑并用水處理殘留物，過濾并在真空下干燥，產(chǎn)生0.4g(82％)粗材料，通過使用60∶20∶20丁醇∶AcOH∶H2O洗脫液在硅膠上進(jìn)行柱層析進(jìn)一步純化所述材料。
(iii)為獲得該化合物的季胺，可用DMS或CH3I甲基化步驟(ii)中的產(chǎn)物。
通過1H-和13C-NMR光譜測定法確定CCS的結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)未顯示)。在共同未決的國際專利申請?zhí)朹__________中對所述分析進(jìn)行了詳細(xì)的描述。
其它合成方法類似于上述方法，可使用下列方法圖1A中所描述的線性單取代神經(jīng)酰胺-精胺的合成在DMAP存在的情況下將1當(dāng)量的神經(jīng)酰胺與2.5當(dāng)量的二琥珀酰亞胺基碳酸鹽反應(yīng)以獲得相應(yīng)的1，3-二-O-琥珀酰亞胺基衍生物。
在室溫下使用催化量的DMAP將所獲得的二琥珀酰亞胺基衍生物與等當(dāng)量的精胺反應(yīng)以獲得圖1B的3-單取代的神經(jīng)酰胺-精胺綴合物。
圖1B中所描述的線性雙取代神經(jīng)酰胺-精胺綴合物的合成在80℃下在催化量的DMAP存在的情況下將1當(dāng)量如上所述制備的1，3-二-O-琥珀酰亞胺基sphinogid衍生物與2.5當(dāng)量的精胺反應(yīng)。結(jié)果獲得1，3-雙取代的CCS。
圖1C中描述的線性雙取代的神經(jīng)酰胺-支化的精胺綴合物的合成在80℃下在催化量的DMAP存在的情況下將1當(dāng)量如上所述制備的1，3-二-O-琥珀酰亞胺基神經(jīng)酰胺衍生物與2.5當(dāng)量的α-ω雙保護(hù)的精胺反應(yīng)。
除去保護(hù)從而獲得1，3-“支化的”雙取代神經(jīng)酰胺-精胺綴合物。
圖1D所描述的線性雙取代神經(jīng)酰胺-環(huán)狀精胺綴合物的合成在80℃下在催化量DMAP存在的情況下將1當(dāng)量如上所述制備的1，3-二-O-琥珀酰亞胺基神經(jīng)酰胺衍生物與0.75當(dāng)量的精胺反應(yīng)。
流感抗原由Berna Biotech，Bern，Switzerland的Drs.Gluck和Zurbriggen慷慨提供來源于流感A/New Caledonia/20/99-like(H1N1)株系的單價(jià)亞單位抗原制劑。該制劑(此處稱為HN)由80-90％血凝素、5-10wt％神經(jīng)氨酸酶和微量NP和M1蛋白組成。含有來源于A/NewCaledonia/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)和B/Shangdong/7/97的HN的商業(yè)可購得的三價(jià)亞單位疫苗(Fluvirin)(2003/2004季)獲自Evans Vaccines Ltd.，Liverpool，UK。在封裝前將該疫苗濃縮大約8倍(Eppendorf Concentrator 5301，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)。將整個(gè)失活的病毒用于一些進(jìn)行體外刺激的實(shí)驗(yàn)中。
脂質(zhì)磷脂(PL)二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)來自Lipoid GmbH，Ludwigshafen，Germany。除了DMPC(中性)和DMPC/DMPG(9/1摩爾比，陰離子)脂質(zhì)體之外，制備6種陽離子脂質(zhì)體/脂質(zhì)裝配物的制劑。單陽離子脂質(zhì)，二甲基氨基乙烷氨基甲?；懝檀?DC-Chol)、1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨-丙烷(氯化物鹽)(DSTAP)、二油?；?3-三甲基銨-丙烷(氯化物鹽)(DOTAP)和二肉豆蔻酰基-3-三甲基銨-丙烷(氯化物鹽)(DMTAP)來自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL，USA)。單陽離子脂質(zhì)，二甲基二(十八烷基)銨溴化物(DDAB)和膽固醇(Chol)來自Sigma。新型的、專有的聚陽離子鞘脂，N-棕櫚?；鵇-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(醋酸鹽)(神經(jīng)酰胺氨基甲?；?精胺，CCS)來自Biolab Ltd.，Jerusalem，Israel。其中說明，以1/1至4/1的脂質(zhì)/輔助脂質(zhì)摩爾比使用輔助脂質(zhì)(DOPE、Chol)。
小鼠使用(每組5-10只)無特定病原體(SPF)的雌性BALB/c小鼠(6-8周大)和C57BL/6小鼠(18個(gè)月大)。在SPF條件下飼養(yǎng)動物。
方法流感抗原在脂質(zhì)體/脂質(zhì)裝配物中的封裝將HN抗原(參見上面)封裝在大的(平均直徑0.1-5μm)異質(zhì)的(大小不一的)小泡中。下列方法通常用于制備所有疫苗制劑。將脂質(zhì)(10-30mg)溶解在1ml叔丁醇中，然后通過過濾(GF92，Glasforser，Vorfilter no.421051，Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)滅菌。將滅菌的脂質(zhì)溶液于-72℃下冷凍，然后凍干24小時(shí)至完全干燥?？蓪⒔?jīng)干燥的脂質(zhì)貯存在4℃下超過2年而無顯著(＜5％)的脂質(zhì)降解或“封裝”能力的丟失。在需要時(shí)，用抗原溶液(在PBS pH7.2中)以3/1至800/1的脂質(zhì)抗原(蛋白)w/w比例水化脂質(zhì)粉末。以20-50μl的增量逐漸加入抗原溶液并在每次加入后劇烈渦旋振蕩，直至終體積為0.5-1ml。在一些實(shí)驗(yàn)中，用PBS水化經(jīng)干燥的脂質(zhì)并將預(yù)制的“空”脂質(zhì)裝配物與抗原溶液混合。渦旋振蕩混合物1-2分鐘并在30-60分鐘內(nèi)使用。
為確定“封裝”的效率，依賴于制劑，使用兩種方法，其導(dǎo)致游離抗原和與脂質(zhì)結(jié)合的抗原之間≥80％的分離。對于所有疫苗制劑，除了CCS外，使用下列的分離技術(shù)。將含有HN抗原(50-100μg蛋白)的脂質(zhì)裝配物(1-30mg脂質(zhì))懸浮于0.5ml PBS中并小心地加到0.5mlD2O(99.9％，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，USA)上面。然后將樣品在30℃在45,000rpm下離心1小時(shí)。游離的、非封裝的HN沉淀下來而被裝配的(脂質(zhì)體的)HN和無蛋白的裝配物/脂質(zhì)體保留在上清液中。收集整個(gè)上清液，通過向上清液和沉淀部分加入0.2ml溫?zé)岬?0％Triton X-100而溶解裝配物/脂質(zhì)體。通過經(jīng)改進(jìn)的Lowry技術(shù)測定兩個(gè)部分的蛋白濃度。對于CCS制劑，將CCS-HN懸浮于0.5ml的PBS-D2O(1體積的PBS X10+9體積的D2O)中，然后與0.5ml PBS混合。然后將該混合物在20℃在10,000rpm下離心10分鐘。CCS+/-抗原沉淀而游離HN保留在上清液中。如上所述在兩個(gè)部分中進(jìn)行脂質(zhì)溶解和蛋白測定。在兩種分離技術(shù)中，HN抗原的總回收率大于95％。
免疫一次肌內(nèi)(i.m.，30μl)、一次或間隔3、7或14天的兩次鼻內(nèi)(i.n.，每個(gè)鼻孔5-50μl)或間隔1周的兩次經(jīng)口(50μl)施用游離的(F-HN)和經(jīng)裝配的/脂質(zhì)體的(Lip-HN)疫苗，0.25-4μg抗原/株系/劑和0.075-1.2mg脂質(zhì)/劑。在所有情況下，將0.15ml 4％的PBS中的水合氯醛經(jīng)腹膜內(nèi)施用而輕微麻醉小鼠。對于經(jīng)口的接種，在接種前30分鐘用0.5ml抗酸溶液(8份Hanks’平衡的鹽溶液+2份7.5％的碳酸氫鈉)經(jīng)口處理小鼠。在所有實(shí)驗(yàn)中使用霍亂毒素(CT，Sigma，USA)(1μg/劑)作為用于比較的標(biāo)準(zhǔn)粘膜佐劑。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用游離的或脂質(zhì)體的CpG-ODN(ODN 1018，由University ofCalifornia，San Diego，CA，USA的Dr.E.Raz慷慨提供)(10μg/劑)作為佐劑。
體液應(yīng)答的評估在接種后4-6周，從1/10或1/20樣品稀釋度開始，單個(gè)地或匯集地檢測血清、肺勻漿和鼻洗出物。從1/10樣品稀釋度開始，通過標(biāo)準(zhǔn)的血凝抑制(HI)測定法測定血凝抑制性抗體。具有HI滴度≥40(在人中被認(rèn)為是保護(hù)性滴度)的小鼠被確定為血清轉(zhuǎn)變的小鼠。通過ELISA測量抗原特異性IgG1、IgG2a、IgA和IgE水平。產(chǎn)生高于對照(抗原+正常小鼠血清，OD＜0.1)0.2 OD的吸光度的最高樣品稀釋度被認(rèn)為是ELISA抗體滴度。
細(xì)胞應(yīng)答的評估在用抗原在體外刺激后，就增殖應(yīng)答、IFNγ和IL-4產(chǎn)生和細(xì)胞毒性活性對接種后5-6周獲得的脾細(xì)胞進(jìn)行檢測。在5×10-5M 2-巰基乙醇存在(用于細(xì)胞毒性)或不存在的情況下，在37℃下在補(bǔ)充有5％(用于增殖，細(xì)胞因子)或10％(用于細(xì)胞毒性)胎牛血清(FCS)的富集RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。如下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(i)增殖在抗原(每孔0.5-5μg)存在或不存在的情況下，以終體積0.2ml將每孔0.5×106個(gè)細(xì)胞按三份重復(fù)溫育在U型96孔板中。72-96小時(shí)后，用1μCi3H胸苷脈沖培養(yǎng)物16小時(shí)。結(jié)果以Δcpm＝(用抗原培養(yǎng)的細(xì)胞的每分鐘平均計(jì)數(shù))-(無抗原培養(yǎng)的細(xì)胞的每分鐘平均計(jì)數(shù))表示。(ii)細(xì)胞因子在抗原(每孔5-10μg)存在或不存在的情況下，以終體積1ml將每孔2.5×106至5×106個(gè)細(xì)胞按二份重復(fù)溫育在24孔板中。48-72小時(shí)后收集上清液并使用Opt EIA Set(Pharmingen，USA)通過ELISA檢測上清液中鼠IFNγ和IL-4。(iii)細(xì)胞毒性如(ii)中一樣將響應(yīng)性脾細(xì)胞(2.5×106)和等數(shù)目的刺激性BALB/c細(xì)胞一起溫育7天，所述刺激性BALB/c細(xì)胞已用X/127(H1N1)流感病毒感染(參見下面)。為進(jìn)行感染，用150血凝單位/1×106脾細(xì)胞的病毒與所述脾細(xì)胞在37℃下在RPMI 1640培養(yǎng)基(無FCS)中溫育(間歇攪拌)3小時(shí)，之后洗滌。隨后，在10IU/ml rhIL-2存在的情況下以1/4的效應(yīng)/刺激細(xì)胞比例用經(jīng)感染的、經(jīng)輻射的(3,000rad)脾細(xì)胞再刺激接觸過抗原的效應(yīng)細(xì)胞5天。使用標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放測定法以100/1的效應(yīng)/靶細(xì)胞比例測量細(xì)胞毒性。所使用的被標(biāo)記的靶細(xì)胞是未修飾的P815和用HA2189-199肽(IYSTVASSLVL，20μg/1×106細(xì)胞)在37℃脈沖90分鐘的P815。
保護(hù)性免疫性的測定將小鼠麻醉并用重排列的病毒X-127(A/Beijing/262/95(H1N1)×X-31(A/HongKong/1/68×A/PR/8/34)以每個(gè)鼻孔25μl活病毒懸浮液(大約107EID 50(卵感染劑量50％))進(jìn)行施用，所述病毒對小鼠具有感染性并且與A/New Caledonia交叉反應(yīng)。在第4天取出肺，在冷PBS中清洗三次，在PBS(1.5ml/肺/小鼠，稱作1/10稀釋)中勻漿。匯集各組的勻漿液并在4℃和2000rpm下離心30分鐘，收集上清液。進(jìn)行系列10倍稀釋并以兩份重復(fù)將0.2ml各稀釋度的液體注射入11天大的含胚雞蛋的尿囊中。在37℃進(jìn)行48小時(shí)和4℃進(jìn)行16小時(shí)后，取出0.1ml的尿囊液并用雞紅細(xì)胞(0.5wt.％，0.1ml)通過血細(xì)胞凝集(在室溫下30分鐘)檢查病毒的存在。肺病毒滴度被確定為在尿囊液中產(chǎn)生病毒的(陽性的血細(xì)胞凝集)肺勻漿物的最高稀釋度。各種熒光標(biāo)記的脂質(zhì)制劑和放射性標(biāo)記的HN抗原的生物分布和藥物動力學(xué)用20μl空的或與三價(jià)亞單位流感疫苗(HN)結(jié)合的麗絲胺羅丹明標(biāo)記的脂質(zhì)裝配物制劑接種小鼠一次。在1，5或24小時(shí)后，殺死小鼠并取出各種器官。將器官貯存在-20℃下過夜，第二天上午在裂解緩沖液中勻漿。隨后將0.2ml的勻漿液轉(zhuǎn)移至eppendorf管中，加入0.8mL異丙醇，并離心15分鐘以便將熒光探針釋放到上清液中。將50μL上清液加入384黑色平板中并讀取熒光(Em545，Ex596)。
在另外的測定中，將450μg三價(jià)HN疫苗(5mL)逆DDW進(jìn)行透析(以除去鹽)，然后濃縮1000倍至5μL。然后將蛋白在0.1M硼酸鹽緩沖液(pH8.5)中稀釋至15μL中有450μg的母液。然后按照廠商說明書，使用Bolton Hunter試劑用125I標(biāo)記蛋白。給小鼠提供125I標(biāo)記的HN(2μg)，并在1,5和24小時(shí)殺死小鼠，取出各種器官(參見圖3)放入瓶中并在經(jīng)校準(zhǔn)用于125I的γ-計(jì)數(shù)器中讀數(shù)。
本發(fā)明由所附的權(quán)利要求定義，其內(nèi)容將被看成包括在本說明書的公開內(nèi)容中。
權(quán)利要求
1.sphingoid-聚烷基胺綴合物在制備用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的藥物組合物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物包含sphingoid主鏈，所述主鏈通過氨基甲酰鍵攜帶至少一個(gè)聚烷基胺鏈。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述調(diào)節(jié)包括刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其與生物學(xué)活性分子組合。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述生物學(xué)活性分子在生理學(xué)pH下具有凈負(fù)偶極矩或凈負(fù)電荷或含有至少一個(gè)具有凈負(fù)電荷的區(qū)域。
6.權(quán)利要求4或5的用途，其中所述生物學(xué)活性分子是免疫調(diào)節(jié)性氨基酸分子、核酸分子或低分子量化合物。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述生物學(xué)活性分子是抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽、糖類或免疫刺激劑。
8.權(quán)利要求6的用途，其中所述核酸分子是寡脫氧核苷酸(ODN)。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的用途，其與免疫刺激劑組合。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物形成脂質(zhì)裝配物。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物形成小泡、微團(tuán)或其混合物。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的用途，其中所述sphingoid選自神經(jīng)酰胺、二氫神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、二氫植物神經(jīng)酰胺、ceramine、dihydroceramine、phytoceramine、dihydrophytoceramine。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述sphingoid是神經(jīng)酰胺。
14.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的用途，其中所述聚烷基胺選自精胺、亞精胺、聚烷基胺類似物或其組合。
15.權(quán)利要求4至14中任一項(xiàng)的用途，其中將所述sphingoid-聚烷基胺綴合物與所述生物學(xué)活性分子共凍干，或?qū)⑺錾飳W(xué)活性物質(zhì)與預(yù)制的sphingoid-聚烷基胺綴合物裝配物混合。
16.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物是N-棕櫚?；鵇-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(CCS)。
17.權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的用途，用于制備疫苗。
18.權(quán)利要求17的用途，用于制備流感疫苗。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述生物學(xué)活性物質(zhì)來源于流感病毒或?yàn)閬碓从诹鞲胁《镜姆肿拥念愃莆铩?br> 20.權(quán)利要求19的用途，其中所述生物學(xué)活性物質(zhì)是血凝素和神經(jīng)氨酸酶的組合物(HN)。
21.權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的用途，用于鼻內(nèi)或肌內(nèi)接種物的制備。
22.N-棕櫚?；鵇-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(CCS)用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于增強(qiáng)或刺激受試者對流感病毒的免疫應(yīng)答。
23.用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括為所述受試者提供治療有效量的sphingoid-聚烷基胺綴合物和生物學(xué)活性分子。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物包含sphingoid主鏈，所述主鏈通過氨基甲酰鍵攜帶至少一個(gè)聚烷基胺鏈。
25.權(quán)利要求23或24的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
26.權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物學(xué)活性分子與所述sphingoid-聚烷基胺綴合物結(jié)合。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述生物學(xué)活性分子在生理學(xué)pH下具有凈負(fù)偶極矩或凈負(fù)電荷或含有至少一個(gè)具有凈負(fù)電荷的區(qū)域。
28.權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物學(xué)活性分子是選自核酸分子、氨基酸分子或低分子量化合物的免疫調(diào)節(jié)劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述生物學(xué)活性分子選自抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽或糖類。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述核酸分子是寡脫氧核苷酸(ODN)。
31.權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)的方法，其包括施用與生物學(xué)活性分子結(jié)合的所述Sphingoid-聚烷基胺綴合物以及免疫刺激劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中將所述免疫刺激劑與所述sphingoid-聚烷基胺綴合物一起施用，或在施用sphingoid-聚烷基胺綴合物前后一定的時(shí)間間隔內(nèi)施用。
33.權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)的方法，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物形成脂質(zhì)裝配物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述脂質(zhì)裝配物包含小泡或微團(tuán)或其組合。
35.權(quán)利要求23至34中任一項(xiàng)的方法，其中所述sphingoid選自神經(jīng)酰胺、二氫神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、二氫植物神經(jīng)酰胺、ceramine、dihydroceramine、phytoceramine、dihydrophytoceramine。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述sphingoid是神經(jīng)酰胺。
37.權(quán)利要求23至36中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚烷基胺選自精胺、亞精胺、聚烷基胺類似物或其組合。
38.權(quán)利要求23至37中任一項(xiàng)的方法，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物是N-棕櫚酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲?；?精胺(CCS)。
39.權(quán)利要求23至38中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物學(xué)活性物質(zhì)來源于流感病毒或?yàn)閬碓从诹鞲胁《镜姆肿拥念愃莆铩?br> 40.權(quán)利要求39的方法，其中所述生物學(xué)活性物質(zhì)是血凝素和神經(jīng)氨酸酶的組合(HN)。
41.權(quán)利要求23至40中任一項(xiàng)的方法，其包括鼻內(nèi)或肌內(nèi)施用所述綴合物。
42.用于調(diào)節(jié)受試者對流感病毒的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括為所述受試者提供N-棕櫚?；鵇-赤式鞘氨醇基氨基甲?；?精胺(CCS)和流感抗原。
43.用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的藥物組合物，所述組合物包含(i)至少一種sphingoid-聚烷基胺綴合物；和(ii)至少一種生物學(xué)活性分子。
44.權(quán)利要求43的藥物組合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物包含sphingoid主鏈，所述主鏈通過氨基甲酰鍵攜帶至少一個(gè)聚烷基胺鏈。
45.權(quán)利要求43或44的組合物，其包含至少一種生理學(xué)可接受的載體。
46.權(quán)利要求43至45中任一項(xiàng)的組合物，其中所述調(diào)節(jié)包括刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
47.權(quán)利要求43至46中任一項(xiàng)的組合物，其中所述生物學(xué)活性分子在生理學(xué)pH下具有凈負(fù)偶極矩或凈負(fù)電荷或含有至少一個(gè)具有凈負(fù)電荷的區(qū)域。
48.權(quán)利要求43至47中任一項(xiàng)的組合物，其中所述生物學(xué)活性分子是選自氨基酸分子、核酸分子或低分子量分子的免疫調(diào)節(jié)劑。
49.權(quán)利要求48的組合物，其中所述生物學(xué)活性分子選自抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽或糖類。
50.權(quán)利要求48的組合物，其中所述核酸分子是寡脫氧核苷酸(ODN)。
51.權(quán)利要求43至50中任一項(xiàng)的組合物，其包含免疫刺激劑。
52.權(quán)利要求43至51中任一項(xiàng)的組合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物形成脂質(zhì)裝配物。
53.權(quán)利要求52的組合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物形成小泡或微團(tuán)或其組合。
54.權(quán)利要求43至53中任一項(xiàng)的組合物，其中所述sphingoid主鏈選自神經(jīng)酰胺、二氫神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、二氫植物神經(jīng)酰胺、ceramine、dihydroceramine、phytoceramine、dihydrophytoceramine。
55.權(quán)利要求54的組合物，其中所述sphingoid是神經(jīng)酰胺。
56.權(quán)利要求43至55中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚烷基胺選自精胺、亞精胺或者精胺或亞精胺的聚烷基胺類似物。
57.權(quán)利要求43至56中任一項(xiàng)的組合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物是N-棕櫚酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲?；?CCS)。
58.權(quán)利要求43至57中任一項(xiàng)的組合物，所述組合物用于接種受試者抵抗流感病毒。
59.權(quán)利要求58的組合物，其中所述生物學(xué)活性分子來源于流感病毒或?yàn)閬碓从诹鞲胁《镜姆肿拥念愃莆铩?br> 60.權(quán)利要求59的組合物，其中所述生物學(xué)活性分子是血凝素和神經(jīng)氨酸酶的組合(NH)。
61.權(quán)利要求43至60中任一項(xiàng)的組合物，其以適合鼻內(nèi)或肌內(nèi)施用的劑型存在。
62.包含N-棕櫚酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲?；?精胺(CCS)和血凝素神經(jīng)氨酸酶的疫苗。
63.一種復(fù)合物，其包含(i)sphingoid-聚烷基胺綴合物和(ii)能夠調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的生物學(xué)活性分子。
64.權(quán)利要求63的復(fù)合物，其中所述sphingoid通過氨基甲酰鍵連接至少一個(gè)聚烷基胺鏈。
65.權(quán)利要求63或64的復(fù)合物，其中所述生物學(xué)活性分子在生理學(xué)pH下具有凈負(fù)偶極矩或凈負(fù)電荷或含有至少一個(gè)具有凈負(fù)電荷的區(qū)域。
66.權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述生物學(xué)活性物質(zhì)是選自氨基酸分子、核酸分子或低分子量分子的免疫調(diào)節(jié)劑。
67.權(quán)利要求66的復(fù)合物，其中所述生物學(xué)活性分子選自抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽或糖類。
68.權(quán)利要求66的復(fù)合物，其中所述核酸分子是寡脫氧核苷酸(ODN)。
69.權(quán)利要求63至68中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物形成脂質(zhì)裝配物。
70.權(quán)利要求69的復(fù)合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物形成小泡或微團(tuán)或其組合。
71.權(quán)利要求63至70中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述sphingoid選自神經(jīng)酰胺、二氫神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、二氫植物神經(jīng)酰胺、ceramine、dihydroceramine、phytoceramine、dihydrophytoceramine。
72.權(quán)利要求71的復(fù)合物，其中所述sphingoid是神經(jīng)酰胺。
73.權(quán)利要求63至71中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述聚烷基胺選自精胺、亞精胺或者精胺或亞精胺的多胺類似物。
74.權(quán)利要求63至73中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺綴合物是N-棕櫚?；鵇-赤式鞘氨醇基氨基甲?；?CCS)。
75.用于捕獲生物學(xué)活性分子的試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)定義的sphingoid-聚烷基胺綴合物，和作為捕獲劑的所述綴合物的使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為生物學(xué)活性分子(例如抗原)的捕獲劑的sphingoid－聚烷基胺綴合物的用途。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，使用sphingoid－聚烷基胺制備用于調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的藥物組合物。本發(fā)明的其它方面涉及通過使用所述綴合物、包含sphingoid－聚烷基胺綴合物和能夠調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的生物學(xué)活性分子的復(fù)合物、包含所述綴合物的組合物來調(diào)節(jié)受試者免疫應(yīng)答的方法，以及利用所述綴合物的試劑盒。本發(fā)明優(yōu)選的綴合物是N－棕櫚?；鵇－赤式鞘氨醇基－1－氨基甲酰基精胺。
文檔編號A61P37/02GK1829535SQ200480021919
公開日2006年9月6日 申請日期2004年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日
發(fā)明者Y·巴蘭霍爾茨, A·約瑟夫, E·科達(dá) 申請人:耶路撒冷希伯來語大學(xué)依蘇姆研究開發(fā)公司, 生物試驗(yàn)室有限公司