專利名稱：烷基胺改進(jìn)甲醛固定的生物樣品組分的檢測(cè)的制作方法
烷基胺改進(jìn)甲醛固定的生物樣品組分的檢測(cè)背景技術(shù)在過(guò)去的100年中，病理學(xué)家已經(jīng)常規(guī)地通過(guò)用曱醛固定生物樣品來(lái)保存它們?nèi)缃M織。雖然曱醛處理保持了組織的細(xì)胞特征，但甲醛 處理也會(huì)導(dǎo)致化學(xué)交聯(lián)，這使得樣品的許多生物組分不能充分適于或 不適于檢測(cè)、量化和表征。甲醛通過(guò)使蛋白質(zhì)中的伯胺基團(tuán)與蛋白質(zhì)或DNA中的其它附近的氮原子通過(guò)-CH2-鍵交聯(lián)，而保存或固定組織 或細(xì)胞。因此，例如盡管聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可用于檢測(cè)和量化生物 樣品中的核酸，但PCR通常不能充分地或不能有效地分析曱醛交聯(lián)的 樣品中的核酸，特別是在期望定量結(jié)果時(shí)。因此，在曱醛的作用下核酸交聯(lián)到細(xì)胞組分對(duì)檢測(cè)各種細(xì)胞組分 提出了挑戰(zhàn)、包括檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)。雖然已經(jīng)描述了一些途徑用于 改進(jìn)從曱醛交聯(lián)的樣品擴(kuò)增核酸，但該改進(jìn)通常僅僅包括降解樣品中的蛋白質(zhì)或提供通常不改變形成交聯(lián)的共價(jià)鍵的洗滌劑。本發(fā)明解決 這個(gè)及其他問(wèn)題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了用于分析曱醛交聯(lián)的生物樣品的 一 種或多種組分的 方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括使樣品與充足量的烷基胺接觸， 以釋放至少一部分交聯(lián)的組分，從而改進(jìn)用于分析的一種或多種組分 的可沖全測(cè)度(accessibility )。在一些實(shí)施方案中，生物樣品來(lái)自動(dòng)物的組織樣品。 在一些實(shí)施方案中，烷基胺的量在0.01 %(約2mM)至5% (約800 mM )之間。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品和烷基胺被加熱一段時(shí)間。 在一些其它的優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)組分。 在一些實(shí)施方案中，在檢測(cè)步驟之前，將烷基胺基本上從樣品中除去。在一些實(shí)施方案中，在檢測(cè)步驟前，烷基胺的濃度降低至小于約0.5% (約80 mM)(例如小于約0.2%或0.1%)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括定量檢測(cè)組分。3在一些實(shí)施方案中，組分是核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸是DNA。 在一些實(shí)施方案中，組分是RNA。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)核酸。在一些實(shí)施方 案中，檢測(cè)步驟包括擴(kuò)增核酸。在一些實(shí)施方案中，在允許形成探針 和核酸的條件下，使核酸組分接觸探針，并且檢測(cè)雙鏈體的存在。在 一些實(shí)施方案中，探針連接到固相載體上。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增 步驟包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在一些實(shí)施方案中，組分是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該方法 進(jìn)一步包括檢測(cè)蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括質(zhì)語(yǔ)或電 泳。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)譜包括基質(zhì)輔助激光解吸/離子化(MALDI)。 在一些實(shí)施方案中，在接觸步驟前，樣品被包埋在石蠟中。 在一些實(shí)施方案中，烷基胺選自乙二胺、乙醇胺和丙胺。 在一些實(shí)施方案中，與如果不進(jìn)行接觸步驟可用于分析的部分相 比，可用于分析的組分的部分被提高到至少約兩倍。在一些實(shí)施方案 中，與如果不進(jìn)行接觸步驟可用于分析的部分相比，可用于分析的組分的部分被提高到至少約十倍。在 一 些實(shí)施方案中，該方法進(jìn) 一 步包括使樣品與蛋白酶接觸以降 解樣品中的蛋白質(zhì)，從而使得核酸更可用于分析。本發(fā)明還提供了試劑盒，其用于改進(jìn)甲醛交聯(lián)的生物樣品的 一種 或多種組分的利用度。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括烷基胺；和 用于從生物樣品除去烷基胺的設(shè)備，例如蛋白酶或試齊'J或設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括用于從生物樣品除去烷基胺的 試劑或設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，該設(shè)備是用于純化核酸的柱。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括蛋白酶。在一些實(shí)施方案中， 蛋白酶是蛋白酶K。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒進(jìn)一步包括核苷酸和/或熱穩(wěn)定聚合 酶。在一些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定聚合酶是Taq聚合酶。本發(fā)明還提供了反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包 括甲醛交聯(lián)的生物樣品；和充足量的烷基胺以釋放至少一部分交聯(lián)的 組分。在一些實(shí)施方案中，烷基胺的量在0.01 %至5°/。之間。在一些實(shí)施 方案中，烷基胺選自乙二胺、乙醇胺和丙胺。在一些實(shí)施方案中，生物樣品來(lái)自動(dòng)物的組織樣品。定義"甲醛交聯(lián)的生物樣品"是指已經(jīng)被甲醛處理成在蛋白質(zhì)中的氮 與其他含氮的蛋白質(zhì)和/或核酸之間形成交聯(lián)的生物樣品。生物樣品典 型地包含細(xì)胞。生物樣品可以是例如，來(lái)自動(dòng)物的組織樣品。通過(guò)將 它們包埋在石蠟中而存儲(chǔ)許多甲醛處理的樣品。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"烷基胺"是指直或支鏈的、飽和或不飽 和的分子，其具有l(wèi)-10或更多碳原子和一個(gè)或多個(gè)氨基。烷基胺的烷 基部分可以是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁 基、仲丁基、叔丁基等。氨基可以是伯氨基或仲氨基。烷基胺可進(jìn)一步被不大于2(即0、 1或2)個(gè)取代基取代，其包括但不限于一個(gè)或多 個(gè)羥基基團(tuán)?？捎糜诒景l(fā)明的烷基胺包括但不局限于乙胺、丙胺、異 丙胺、乙二胺和乙醇胺。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解其它烷基胺也可用于 本發(fā)明。短語(yǔ)"檢測(cè)組分，，是指至少測(cè)定組分的存在或不存在，并可以包 括組分或部分組分的進(jìn)一步定量測(cè)定或其它表征。生物樣品的"組分，，是指一類分子(例如蛋白質(zhì)、核酸等)或人們希 望檢測(cè)的具體的目標(biāo)如具體的蛋白質(zhì)或核酸序列。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"核酸"是指脫氧核糖核苷酸的聚合物(包 含2-脫氧-D-核糖)(即DNA)、多核苷酸(包含D-核糖)(即RNA)和任何 其它。票呤或嘧"定;咸類的N-糖苷類似物、或經(jīng)修飾的嘌呤或嘧咬^咸基。短語(yǔ)"以釋放至少一部分交聯(lián)的組分，，是指改變?cè)谏飿悠返膬?種組分(例如核酸和蛋白)指尖形成交聯(lián)的共價(jià)鍵，以便這兩種組分不再 通過(guò)共價(jià)鍵連接。該短語(yǔ)包括但不限于完全逆轉(zhuǎn)交聯(lián)過(guò)程。如本文中使用的，短語(yǔ)"用于分析的可檢測(cè)度"是指測(cè)定特定的 靶分子存在或不存在和/或量的檢測(cè)方法。例如許多檢測(cè)方法為至少部 分阻止檢測(cè)曱醛交聯(lián)的生物樣品中的蛋白質(zhì)或核酸，因此某些交聯(lián)的 組分不〃可用于〃檢測(cè)。 一旦通過(guò)用烷基胺處理釋放交聯(lián)，則組分的提高 量(例如至少多約10%和典型地是至少約2倍，或有時(shí)是約至少10或 100倍)可以祐J險(xiǎn)測(cè)和定量測(cè)定。


圖1描繪了核酸甲醛交聯(lián)到賴氨酸以及在添加烷基胺后交聯(lián)逆轉(zhuǎn) 的實(shí)例。圖2描繪了實(shí)施例1中所述未經(jīng)處理的低聚核苦酸的質(zhì)語(yǔ)分析。 圖3描繪了實(shí)施例1中所述福爾馬林處理的低聚核普酸的質(zhì)語(yǔ)分析。圖4描繪了實(shí)施例1中所述福爾馬林處理的低聚核苷酸和賴氨酸 的質(zhì)譜分析。圖5描繪了如實(shí)施例1中所述使用乙醇二胺(ethanoldiame )處理 從而從交聯(lián)的DNA再生起始DNA后福爾馬林處理的低聚核苷酸和賴 氨酸混合物的質(zhì)譜分析。圖6描繪了未經(jīng)處理的合成RNA的質(zhì)譜分析。 圖7描繪了在與福爾馬林孵育1小時(shí)后合成RNA的質(zhì)譜分析。 圖8描繪了與福爾馬林孵育5小時(shí)后合成RNA的質(zhì)語(yǔ)分析。 圖9描繪了與福爾馬林孵育24小時(shí)后合成RNA的質(zhì)譜分析。 圖10描繪了在與福爾馬林和賴氨酸孵育1小時(shí)后合成RNA的質(zhì) 譜分析。圖11描繪了在于福爾馬林和賴氨酸孵育1小時(shí)以及隨后利用乙醇 二胺(ethanoldiame ) ( EDA)釋放解除交聯(lián)化學(xué)后合成RNA的質(zhì)譜分 析。該圖顯示從交聯(lián)的核糖核酸-賴氨酸加合物再生起始RNA。圖12描繪了乙醇二胺(EDA)的作用。所使用EDA的濃度是作為 百分?jǐn)?shù)顯示的。值得注意地，在這個(gè)系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)0.2% (約50mM)和 更高的EDA會(huì)抑制PCR反應(yīng)。圖13描繪了在福爾馬林固定的石蠟包埋組織(FFPET)樣品中利用 EDA逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。圖的上面部分顯示較低濃度的EDA,無(wú)論是否進(jìn)行 QIAquickTM純化都發(fā)生擴(kuò)增。然而，擴(kuò)增的量與其他泳道相比低。在 抑制擴(kuò)增(例如高于0.1% (大約25mM))的EDA濃度下，僅僅在進(jìn) 行QIAquickTM純化時(shí)才發(fā)生擴(kuò)增，這證明了在擴(kuò)增之前除去或以其他 方式滅活EDA的優(yōu)點(diǎn)。圖的一部分提供了循環(huán)極限對(duì)比信號(hào)的圖表， 并證明提高EDA的量結(jié)合EDA除去步驟能有效地顯著提高樣品中可 用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的DNA的量。圖14還描繪了在樣品制備物中利用提高量的EDA處理達(dá)到了核酸用于擴(kuò)增的利用度的改進(jìn)。在圖的上面部分，將循環(huán)極限(X-軸)針對(duì)擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)行作圖。在下面部分中，循環(huán)極限是y-軸，EDA的濃度 ;1: x-摔由。圖15描繪了 SDS-PAGE凝膠，并顯示福爾馬林交聯(lián)牛血清白蛋白 (BSA)和后續(xù)通過(guò)用EDA處理而逆轉(zhuǎn)交聯(lián)的結(jié)果。發(fā)明詳述I.介紹如圖1所示，甲趁導(dǎo)致蛋白中的核酸與伯胺，特別是氨基酸例如 賴氨酸和精氨酸的交聯(lián)。作為交聯(lián)的結(jié)果，曱醛固定的樣品中各種生 物組分不能被現(xiàn)代檢測(cè)方法檢測(cè)。本發(fā)明提供了逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，由此使得 有更多的生物組分能夠被檢測(cè)的方法。逆轉(zhuǎn)曱醛處理的樣品的交聯(lián)是通過(guò)將樣品與充足量烷基胺接觸以 釋放交聯(lián)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。圖1描繪了交聯(lián)逆轉(zhuǎn)的一個(gè)實(shí)例(在該實(shí)例中 顯示了核酸通過(guò)甲醛與賴氨酸交聯(lián)，隨后用烷基胺使反應(yīng)逆轉(zhuǎn)。一旦交聯(lián)的樣品與烷基胺接觸，則核酸和蛋白質(zhì)的交聯(lián)減少或消 除，從而允許改進(jìn)這些組分的^^測(cè)。//.炎/,Jt農(nóng)^邀為、^ ^"趁f W才法本發(fā)明提供了用于使得生物樣品的甲醛交聯(lián)的組分更可用于檢測(cè) 的方法，其通過(guò)使樣品與烷基胺接觸。用于使得組分更可使用的烷基 胺的數(shù)量可以變化，并且部分依賴于所使用具體的烷基胺、待檢測(cè)的 組分，和所使用的檢測(cè)方法，因?yàn)椴煌臋z測(cè)方法具有不同的敏感性 因此可能需要程度不同的可使用的組分。理想地，使得可用于特定的檢煩'J方法的組分的量是樣品中組分的 全部量。然而，通常被使得可用于檢測(cè)的組分的量低于樣品中組分的 全部量。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在與不使用烷基胺處理樣品相 比，可用于檢測(cè)的可使用組分的量為至少約2倍(使用相同的檢測(cè)方 法)的條件下，使用充足量的烷基胺。在一些實(shí)施方案中，在與不使 用烷基胺處理樣品相比，可用于檢測(cè)的可使用組分的量為至少約5、 10、 20、 100倍(使用相同的檢測(cè)方法)的條件下，使用充足量的烷基胺。 在一些實(shí)施方案中，用于釋放樣品交聯(lián)的烷基胺的濃度在約0.01%至約5% (或更多)之間，例如在約0.01 %至約1 %之間、在約0.05%至約2% 之間，約0.05%至約1 %之間，約0.1%至約1 %之間。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解樣品和烷基胺結(jié)合的狀態(tài)(例如時(shí)間和溫 度)將影響交聯(lián)逆轉(zhuǎn)的能力和量。烷基胺處理在環(huán)境溫度(例如在20 - 40 或5CTC)之間下是有效的，因此不必然地需要加熱步驟以釋放交聯(lián)。這 在檢測(cè)相對(duì)不穩(wěn)定的組分時(shí)是特別有用的，如RNA。然而，較高的溫 度(例如80 100°C、 90 - 100°C、 90 - 99。C等)可以進(jìn)一步改進(jìn)核酸或蛋 白質(zhì)用于檢測(cè)的可沖企測(cè)度。
此外，烷基胺與樣品孵育的時(shí)間的量將影響被使得可用于檢測(cè)的 組分的量。例如，樣品可以與烷基胺孵育至少約5、 10、 20、 30、 60、 120分鐘或更多。雖然更長(zhǎng)的孵育時(shí)間可以提高從交聯(lián)釋放的組分的 量，但這需要與特定組分的不穩(wěn)定程度相平衡。例如，當(dāng)將檢測(cè)不穩(wěn) 定的組分如RNA時(shí)，可期望使用較短的孕育時(shí)間。相反，較穩(wěn)定的 組分如蛋白質(zhì)或DNA可以#:暴露4交長(zhǎng)的事件而不損害組分。
需要認(rèn)識(shí)到可使用不同的烷基胺釋放交聯(lián)。在不限制本發(fā)明范圍 的前提下，所選擇的烷基胺通常能夠從甲醛誘導(dǎo)的交聯(lián)鍵釋放組分并 且復(fù)原組分(例如核酸和/或蛋白質(zhì))成與甲醛交聯(lián)之前所存在的基本上 相同的組分。交聯(lián)反應(yīng)被認(rèn)為是通過(guò)甲醛的反應(yīng)所進(jìn)行的可逆過(guò)程， 第一胺形成半縮醛胺(hemiaminal)，隨后脫水得到亞胺。亞胺與第二 胺反應(yīng)，得到產(chǎn)物縮醛胺(aminal)。該方法通過(guò)亞胺與水代替第二胺 的反應(yīng)回復(fù)到起始原料。相信本發(fā)明的烷基胺從甲醛誘導(dǎo)的交聯(lián)鍵釋 放組分，其通過(guò)作為亞胺和縮醛胺(aminal)形成中的竟?fàn)幮苑磻?yīng)物。 當(dāng)交聯(lián)鍵作為部分平衡過(guò)程釋放時(shí)，亞胺中間體和甲醛與烷基胺反應(yīng)， 從而將組分從曱醛誘導(dǎo)的交聯(lián)鍵釋放。通常，任何烷基胺與伯胺(和有 時(shí)仲胺)將是有效的。需要理解可以對(duì)烷基胺進(jìn)行各種取代，而基本上 不影響胺逆轉(zhuǎn)交聯(lián)或產(chǎn)生其它將與樣品組分反應(yīng)的反應(yīng)性部分的能 力，只要這樣的取代基本上不妨礙胺進(jìn)行反應(yīng)的能力。例如乙醇胺能 有效地逆轉(zhuǎn)交聯(lián)鍵。乙二胺也是有效的，盡管需要承認(rèn)其它二胺將同 樣能有效地用于本發(fā)明的方法。進(jìn)一步，雖然有時(shí)可以優(yōu)選較短的烷 基鏈(例如具有l(wèi)、 2、 3、 4、 5個(gè)碳)，但較長(zhǎng)的碳鏈也可以使用。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以使用任何類型的甲醛交聯(lián)的生物樣品。 通常，組織樣品源自于動(dòng)物組織。在一些實(shí)施方案中，樣品包埋在石
8蠟中。例如樣品可以是福爾馬林固定石蠟包埋的組織(FFPET)。在一些 實(shí)施方案中，樣品是從動(dòng)物(例如人)中獲得并隨后保存在包含曱醛的溶 液中，以在分析之前穩(wěn)定樣品，從而交聯(lián)樣品中的核酸和/或蛋白質(zhì)。 例如子宮頸或其它婦科拭子(例如用于檢測(cè)性傳播疾病)可以被保存在 包含曱醛的溶液中，從而交聯(lián)樣品中的核酸和/或蛋白質(zhì)。隨后可以根 據(jù)本發(fā)明的方法使用烷基胺逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。
為了進(jìn)一步使得樣品組分可用于檢測(cè)，在本發(fā)明的方法中包括額 外的純化或其他步驟。例如，如果將要檢測(cè)樣品的核酸組分，可能有 幫助的是使用蛋白酶處理樣品(例如在烷基胺處理之前或之后)，或者 以其他方式降解樣品中的蛋白質(zhì)。示范性的蛋白酶是蛋白酶K,盡管 需要理解可以替換成各種其他的蛋白酶。
同樣依賴于隨后使用的檢測(cè)方法，期望除去或至少減少與檢測(cè)組 分之前與樣品結(jié)合的烷基胺的量。例如，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有幫助的是
從樣品的其他組分以及從烷基胺純化樣品中的核酸，其通過(guò)使用試齊'J 或設(shè)備例如離心柱以從樣品的其他部分純化核酸。示范性的設(shè)備是與 核酸具有親和力的硅基離心柱(例如來(lái)自Qiagen,Valencia,CA的 QiaquickTM離心柱)，盡管當(dāng)然也可以使用其他純化方法除去烷基胺。 或者，胺可以被化學(xué)中和以不再能夠顯著干擾特定組分的檢測(cè)。
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可以將上述烷基胺處理與任何檢測(cè)方法結(jié)合以檢測(cè)之前交聯(lián)的樣 品的組分。正如下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的，樣品中交l關(guān)干擾檢測(cè)的組分 包括核酸和蛋白質(zhì)。組分的才全測(cè)可以包括僅僅確定特定組分或組分一 部分(例如特定蛋白質(zhì)或核酸序列)的存在或不存在。可替換的，檢 測(cè)可以包括定量測(cè)定組分，和/或表征組分。表征可以包括例如肽或核 酸測(cè)序和/或確定飯以后或翻譯修飾包括例如糖基化、磷酸化等。 A裙^
本領(lǐng)域中已知許多用于檢測(cè)核酸的方法。DNA或RNA (包括 mRNA、 rRNA等)或者二者都可以被檢測(cè)。檢測(cè)可以包括定量測(cè)定特定 的序列或RNA和/或表征核酸，例如通過(guò)核苷酸測(cè)序或序列特異性雜交 技術(shù)(例如諸如用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)等)。
由于許多石蠟包埋的甲醛處理的樣品相對(duì)小，因此，通常希望使用擴(kuò)增方法擴(kuò)增特定的核酸以輔助檢測(cè)核酸?？梢允褂萌魏晤愋偷臄U(kuò) 增方法，包括指數(shù)擴(kuò)增方法，線性擴(kuò)增，熱循環(huán)，等溫方法等。適當(dāng)
的擴(kuò)增方法包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) (Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich， Freeman Press, NY， N.Y., 1992): PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis,等人,Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, including supplemental updates through April 2004; Sambrook & Russell ， Mo/ecwAar C7ow,力g， 爿丄a6orafo^y M"w認(rèn)/ (3rd Ed， 2001)), 連接酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(美國(guó)專利No. 5,185,243, 5,679,524和5,573,907; EP 0 320 308 Bl; WO 90/01069; WO 89/12696;和WO 89/09835)，循環(huán)探 針技術(shù)(美國(guó)專利No. 5,011,769， 5,403,711, 5,660,988, 和 4,876,187, 和PCT公開(kāi)申請(qǐng)WO 95/05480, WO 95/1416, 和WO 95/00667), Invader 技術(shù)(美國(guó)專利No. 5,846,717; 5,614, 402; 5,719,028; 5,541,311;和5,843,669), Q-卩復(fù)制酶技術(shù)(美國(guó)專利No. 4,786,600) ， NASBA(美國(guó)專利No. 5,409,818; EP-0 329 822), TMA (美國(guó)專利No. 5,399,491, 5,888,779, 5,705,365, 5,710,029), SDA (美國(guó)專利No. 5,455,166和5,130,238)。在擴(kuò)增中可以使用多種不同的 聚合酶。從粞熱水生菌(T7z^7m^ m,"cm ) (Taq)分離的代表性熱穩(wěn) 定酶描述于美國(guó)專利No. 4,889,818中，在常規(guī)PCR中使用它的方法描 述于Saiki等人，1988， Sc/e"ce 239:487-91中。另一種代表性熱穩(wěn)定 酶包括棲熱菌屬(7T2ermz^)物種Z05 DNA聚合酶。參見(jiàn)例如美國(guó)專 利No. 5,674,738。任選地，可以使用實(shí)時(shí)PCR或其他定量4支術(shù)以定量 測(cè)定特定的核酸序列。定量擴(kuò)增的方法公開(kāi)在例如美國(guó)專利No. 6,180,349; 6,033,854;和5,972,602,以及在例如Gibson等人， i^searc/z 6:995-1001 (1996); DeGraves , 等人， Sz.o^c/zm々wes 34(1): 106-10, 112-5 (2003); Deiman B, 等人， A/o/ 20(2):163-79 (2002)中。遵循反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT-PCR)特別有用的，以便可 以測(cè)量樣品中一種或者多種基因的RNA水平。RT-PCR方法是本領(lǐng)域 才支術(shù)人員公知的(參見(jiàn)例如 Cw/TeW尸ra&coAs z'w A^o/ecw/(2r A'o/ogy (Ausubel等人，eds., 2002)),并且容易被改造用于定量擴(kuò)增方法。 也可以使用其他方法用于沖企測(cè)核酸。例如，可以從樣品分離核酸并與探針雜交。在某些情況中，探針可以連接到固體載體(例如微陣 列)。
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也可以在使用烷基胺后檢測(cè)樣品的蛋白質(zhì)組分。根據(jù)本發(fā)明的方 法可以采用各種任何蛋白質(zhì)沖企測(cè)和表征方法。
示范性的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法是質(zhì)語(yǔ)。示范'性的質(zhì)譜方法包括但不限
于電噴射離子化和基質(zhì)輔助激光解吸/離子化(MALDI)包括MALDI飛 行時(shí)間(MALDI-TOF)方法。參見(jiàn)例如Karas, M.; Hillencamp， F. Anal. Chem. 60:2301 1988); Beavis, R. C. Org. Mass Spec. 27:653 (1992); Creel， H. S. 7>e"ASc. 1(11):336 (1993)。
利用質(zhì)i普檢測(cè)的替代是利用電泳以分離和隨后檢測(cè)感興趣的蛋白 質(zhì)。電泳法包括雙向電泳方法。該方法可能任選地包括隨后的利用抗 體Western印跡4全測(cè)蛋白質(zhì)。
其他選項(xiàng)包括免疫檢測(cè)蛋白質(zhì)。各種ELISA及用于免疫檢測(cè)蛋白 質(zhì)的其他形式是公知的。
肌試W盒
本發(fā)明還提供了試劑盒，其可以用于使用本發(fā)明上述的方法。因 而，試劑盒可以包括一種或多種本文中所述的試劑。任選地，試劑盒 可以包括用于使用它們的書寫(紙)或電子的說(shuō)明書。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒將包括烷基胺以及至少 一種 額外的試劑用于檢測(cè)或改進(jìn)檢測(cè)核酸或蛋白質(zhì)。例如，在一些實(shí)施方 案中，試劑盒包括烷基胺和蛋白酶(包括但不限于蛋白酶K)用于降解蛋 白質(zhì)和使得核酸更可以用于檢測(cè)。用于檢測(cè)或改進(jìn)檢測(cè)核酸或蛋白質(zhì) 的其它試劑包括例如可用于擴(kuò)增的試劑。例如典型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 可以包括但不限于作為試劑的上游和下游引物、至少一種才莫板、脫氧 核糖核普三磷酸包括(dATP、 dCTP、 dGTP、 TTP、 dUTP)、聚合酶、 緩沖液、金屬陽(yáng)離子和鹽。用于RT-PCR反應(yīng)的試劑盒還可以包括逆 轉(zhuǎn)錄酶和/或引物。對(duì)于定量(例如"實(shí)時(shí)")擴(kuò)增，使用一種或多種多 核苷酸探針以雜交到期望的目標(biāo)。探針典型地被可檢測(cè)的標(biāo)簽例如熒 光標(biāo)記所標(biāo)記。示范性的探針是TaqmanTM探針，盡管可以理解能夠使
ii用其他類型的探針以監(jiān)控定量擴(kuò)增反應(yīng)中的目標(biāo)?；诤怂嵝蛄械臄U(kuò)
增(NASBA)反應(yīng)可以包括引物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNaseH和DNA聚合酶。 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA )反應(yīng)可以包括引物、反轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶。 鏈置換擴(kuò)增(SDA)反應(yīng)可以包括修飾的核苦酸和限制性內(nèi)切核酸酶。 某些擴(kuò)增反應(yīng)還可以包括脫氧尿苷糖基化酶(UNG)作為輔助擴(kuò)增試劑 (例^口 Amperase , Roche Molecular Sciences, Alameda, CA ) (# JS，Kleiboeker,F/to/J (2005) 11:29)。
用于檢測(cè)或改進(jìn)檢測(cè)核酸或蛋白質(zhì)的其他試劑包括例如用于純化 蛋白質(zhì)或核酸的試劑或設(shè)備，例如本文所描述的。
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本發(fā)明還提供了反應(yīng)混合物。如這里所述，示范性的反應(yīng)混合物 將包括甲醛固定的樣品，任選地包括石蠟，和烷基胺。反應(yīng)混合物可 以包括上述濃度的烷基胺。進(jìn)一步，反應(yīng)混合物任選地是以上述溫度 的。反應(yīng)混合物可能任選地進(jìn)一步包括蛋白酶(例如蛋白酶K)。
實(shí)施例
該實(shí)施例描繪了利用烷基胺逆轉(zhuǎn)核酸的交聯(lián)化學(xué)。 在存在賴氨酸(0.3M)時(shí)，使用福爾馬林(福爾馬林緩沖溶液， 10%, Sigma-Aldrich,HT50-1-1 )處理合成寡聚核芬酸(DNA序歹廿 AAG TCA GAA GGE AAA [E = 5-甲基-dC]，SEQ ID NO: 1; 3 nM)或 RNA序列FCC CUC GCA GCC GUC CAA CAA CUC A [F =熒光素], SEQ ID NO: 2; 3 |uM )并在4。C下孵育24小時(shí)。通過(guò)LC-MS分析監(jiān)控 交聯(lián)化學(xué)的動(dòng)力學(xué)。MS數(shù)據(jù)暗示反應(yīng)混合物中的產(chǎn)物由通過(guò)亞甲基橋 與賴氨酸交聯(lián)的寡聚核苷酸，以及寡聚核苦酸-福爾馬林加合物構(gòu)成。 在24小時(shí)后，所有被檢測(cè)的寡聚核苷酸似乎在反應(yīng)混合物都被交聯(lián)。 在亞乙基胺處理之前，從反應(yīng)混合物分離過(guò)量的福爾馬林和賴氨酸。 向該反應(yīng)混合物(400jul)中，加入亞乙基胺(1002.0 M)，并在室 溫下孵育1.0小時(shí)。樣品的LC-MS分析確認(rèn)了交聯(lián)化學(xué)的定量逆轉(zhuǎn)， 從所有交聯(lián)的加合物再生起始寡聚核苷酸。改程序各個(gè)步驟中LC-MS 分析的結(jié)果描繪于圖2~5中。交聯(lián)逆轉(zhuǎn)的其他實(shí)施例描繪于圖6 11中，這時(shí)使用合成RNA分子作為例子。
-滋辦2
下面提供檢測(cè)DNA的示范性規(guī)程
步驟l: 組織切片
使用Microtom RM2255切出20 p組織切片，并將切片置于1.5mL微量離心管(Eppendorf)或螺旋蓋管中.0.0。
步驟2: 裂解試劑
將EDA加入到裂解試劑達(dá)到終濃度為500 mM/225 pL。向每個(gè)含有樣品的試管中加入200 pL裂解試劑/EDA。
步驟3: 加熱步驟
在設(shè)置在98。C的加熱塊中孵育每一種樣品30分鐘。在最初5分鐘之后，從加熱塊除去每一種樣品并且輕樣i渦旋。在渦旋之后，在20,817 rcf下離心(例如Eppendorf 5417C,14,000 rpm) 5秒，以使得全部石蠟和組織進(jìn)入溶液中。確保在管的側(cè)面上沒(méi)有剩下石蠟與組織?；氐郊訜釅K持續(xù)剩余25分鐘。
在25分鐘之后，從加熱塊除去樣品并且在20， 817 rcf下離心(例如Eppendorf 5417C, 14,000 rpm) 5秒，以使得全部石蠟和組織進(jìn)入溶液中。在室溫下冷卻每一種樣品5分鐘。
步驟4: 裂解+蛋白酶K步驟
向每一個(gè)含有樣品的試管中加入20 nLPK。輕微渦旋，接著在20,817 rcf下離心(例如Eppendorf 5417C, 14,000 rpm) 5秒，以使得全部石蠟和組織進(jìn)入溶液中。確保在管的側(cè)面上沒(méi)有剩下石蠟與組織。
在設(shè)置在65。C的加熱塊中孵育每一種樣品1小時(shí)。輕微渦旋，接著在20， 817rcf下離心(例如Eppendorf 5417C， 14,000 rpm) 5秒,以使得全部石蠟和組織進(jìn)入溶液中。
13步驟5: 蛋白酶K滅活歩驟
在設(shè)置在98。C的加熱塊中孵育每一種裂解樣品10分鐘。孵育IO分鐘后，快速?gòu)脑O(shè)定在98。C的加熱快移出每一種樣品并在20， 817 rcf (例如Eppendorf 5417C， 14,000 rpm)離心20分鐘，以從裂解液除去碎片。如果將裂解液在離心前進(jìn)行過(guò)分地冷卻，則將不會(huì)形成石蠟固化頂層，并且石蠟將會(huì)連同裂解液被移出。優(yōu)選，石蠟形成固化的頂層。
步驟6:離心步驟以除去碎片
用合適的樣品鑒別，對(duì)每種樣品標(biāo)記一個(gè)新的1.5mL螺旋蓋管。將裂解液轉(zhuǎn)移到新標(biāo)記的1.5mL試管。避免石蠟頂層和沉淀中的
細(xì)胞碎片出現(xiàn)在試管的底層。
如果樣品需要進(jìn)一步清理，將裂解液進(jìn)一步離心額外的15分鐘，
20, 817 rcf(例如Eppendorf 5417C,14,000 rpm)。將裂解液轉(zhuǎn)移到新
才示i己的1.5mLi式管。
PCR前裂解液清理
將100 )iL裂解液轉(zhuǎn)到新標(biāo)記的1.5mL試管中。根據(jù)QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN Sciences)的方法。使用最終lOO^iL的體積洗脫樣品。
豸滋辨3
本實(shí)施例描繪了利用乙二胺逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)交聯(lián)化學(xué)。將牛血清白蛋白(BSA)蛋白質(zhì)(100 ng, 10ng/mL)加入到曱醛液(65nl,甲醛緩沖液，10%, Sigma-Aldrich, HT50 - 1 - 1 )中并且在4。C孵育。在14小時(shí)和36小時(shí)之后取等分的樣品(每個(gè)點(diǎn)取25 ^L)。接著，將乙二胺(25jal， 2.0M)力。入到這些等分中，并在室溫下孵育1小時(shí)。接著通過(guò)SDS凝膠分析樣品(圖15)。如圖15的泳道4所示(在福爾馬林中在4。C下孵育蛋白質(zhì)14小時(shí))，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)是完全的。圖15的泳道5 (在室溫下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)的產(chǎn)物與乙二胺孵育1小
時(shí))表明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)化學(xué)在存在乙二胺下是可逆的。然而、如果延長(zhǎng)在福爾馬林中的交聯(lián)，則交聯(lián)會(huì)不完全逆轉(zhuǎn)(圖15的泳道6-8)。需要理解本文中所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅僅是為了說(shuō)明的目的，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員在本文的教導(dǎo)下會(huì)暗示各種改變與變化，并且也包括在該應(yīng)用的主旨和范圍內(nèi)，以及在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.用于分析甲醛交聯(lián)的生物樣品的一種或多種組分的方法，該方法包括將樣品與充足量的烷基胺接觸以釋放至少一部分交聯(lián)的組分，從而提高一種或多種組分對(duì)于分析的可檢測(cè)度；和任選地檢測(cè)組分。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中烷基胺的量在0.01 %至5%之間。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中在檢測(cè)步驟之前，將烷基胺基本上從 樣品中除去。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中在檢測(cè)步驟之前，將烷基胺的濃度降 低至小于約0.5%。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述組分是核酸。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中檢測(cè)步驟包括擴(kuò)增核酸。
7. 權(quán)利要求5的方法，其中在允許形成探針和核酸的條件下，使 核酸組分接觸探針，并且檢測(cè)雙鏈體的存在。
8. 權(quán)利要求l的方法，其中組分是蛋白質(zhì)。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中檢測(cè)步驟包括質(zhì)譜或電泳。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中在接觸步驟前，樣品被包埋在石蠟中。
11. 權(quán)利要求l的方法，其中烷基胺選自乙二胺、乙醇胺和丙胺。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中與如果不進(jìn)行接觸步驟可用于分析的 部分相比，可用于分析的組分的部分被提高到至少約兩倍。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1和5的方法，所述方法進(jìn)一步包括將樣品與蛋 白酶接觸以降解樣品中的蛋白質(zhì)，從而使得核酸更可用于分析。
14. 試劑盒，其用于提高甲醛交聯(lián)的生物樣品的一種或多種組分的 利用度，該試劑盒包括烷基胺；和用于從生物樣品除去烷基胺的設(shè)備。
15. 權(quán)利要求14的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括核苷酸和/或熱 穩(wěn)定聚合酶。
16. 反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包括曱醛交聯(lián)的生物樣品；和充 足量的烷基胺以釋放至少 一部分交聯(lián)的組分。
17. 權(quán)利要求16的反應(yīng)混合物，其中烷基胺的量在0.01%至5%之間。
全文摘要
烷基胺起作用以釋放在生物樣品中發(fā)生的甲醛交聯(lián)。因此，將烷基胺接觸甲醛固定的樣品是可以用于使得樣品的生物組分，包括核酸或蛋白質(zhì)更易于檢測(cè)和表征的方法。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101657711SQ200880010876
公開(kāi)日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2008年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者E·H·菲斯, R·沙希尼安, S·G·威爾, V·博德普迪 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司