壺菌的lamp快速檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明壺菌的LAMP快速檢測方法及試劑盒，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。所述快速檢測方法，包括下述步驟：(1)提取待測樣本總的DNA核酸作為反應(yīng)模板；(2)按溶液1∶溶液2∶溶液3＝1∶1∶3的體積比配置LAMP反應(yīng)溶液；(3)將步驟(1)提取的樣本總DNA加入到步驟(2)配制的LAMP反應(yīng)溶液中，混合；(4)在62℃恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘；(5)診斷結(jié)果：將步驟(4)擴(kuò)增反應(yīng)后產(chǎn)物用電泳檢測或熒光染料技術(shù)進(jìn)行鑒定。本方法具有操作簡單、低成本，反應(yīng)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點，且用時短，靈敏度比普通PCR高100倍，對壺菌早期診斷準(zhǔn)確性更高的特點。
【專利說明】壺菌的LAMP快速檢測方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及壺菌的LAMP快速檢測方法以 及與該方法配套實用的檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 壺菌引發(fā)兩棲類壺菌病。LAMP技術(shù)的全稱是環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification)。由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新型的基因擴(kuò)增技術(shù)。但 是，目前尚沒有將LAMP技術(shù)應(yīng)用在壺菌的檢測上。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于公開了壺菌的LAMP快速檢測方法。
[0004] 本發(fā)明的第二個目的在于公開了用于壺菌LAMP快速檢測方法的試劑盒。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] 壺菌的LAMP快速檢測方法，包括下述步驟：
[0007] (1)、提取待測樣本總DNA作為反應(yīng)模板；
[0008] (2)、按溶液1 :溶液2 :溶液3 = 1 : 1 : 3的體積比配置LAMP反應(yīng)溶液； [0009] (3)、將步驟（1)提取的樣本總DNA加入到步驟⑵配制的LAMP反應(yīng)溶液中，混 合；
[0010] (4)、在62 °C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘；
[0011] (5)、診斷結(jié)果：將步驟（4)擴(kuò)增反應(yīng)后產(chǎn)物用電泳檢測或熒光染料技術(shù)進(jìn)行鑒 定，呈陽性的表示樣本含有壺菌，呈陰性的表示樣本不含有壺菌。
[0012] 上述技術(shù)方案所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其中，步驟（2)中的溶液1為2X 反應(yīng)緩沖液，所述2X反應(yīng)緩沖液由900 μ L2XLAMP反應(yīng)緩沖液和100 μ L濃度為25mM的 dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應(yīng)緩沖液的組成為：1M pH8. 8Tris-HC140mL，KC11. 49g， MgS04l. 93g，（NH4) 2S042. 64g，Tween20 2mL 和 Betainel87. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液 由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0013] 溶液2為引物混合物，所述引物混合物由20yL FIP、20yL BIP、2. 5yLF3和 2· 5 μ LB3組成，其中FIP、BIP、F3和B3的濃度均為100 μ Μ ;
[0014] 溶液3為超純水。
[0015] 上述技術(shù)方案所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其中，步驟（3)中樣本總DNA與 LAMP反應(yīng)溶液之間的體積比為1 : 25。
[0016] 上述技術(shù)方案所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其中，步驟（5)中電泳檢測的過程 為：取產(chǎn)物5μ L進(jìn)行2. 0%核酸瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90V，25min ;電泳圖出現(xiàn)條帶 的為陽性，沒有出現(xiàn)條帶的為陰性。
[0017] 上述技術(shù)方案所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其中，步驟（5)中的熒光染料技術(shù) 鑒定過程為：在步驟（2)配置的LAMP反應(yīng)溶液中加入染色劑，反應(yīng)后在紫外燈下呈現(xiàn)綠色 為陽性，不呈現(xiàn)綠色的為陰性。
[0018] 上述技術(shù)方案中所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其特征在于：染色劑與步驟（2) 配置的LAMP反應(yīng)溶液的體積比為1 : 25。
[0019] 上述技術(shù)方案中任一技術(shù)方案所述的壺菌的LAMP快速檢測方法的試劑盒，其中， 所述試劑盒由溶液1、溶液2和溶液3組成，其中溶液1、溶液2和溶液3之間的體積比為 1:1:3;
[0020] 溶液1為2X反應(yīng)緩沖液，所述2X反應(yīng)緩沖液由900 μ L2XLAMP反應(yīng)緩 沖液和lOOyL濃度為25mM的dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應(yīng)緩沖液的組成 為：1M pH8.8Tris-HC140mL，KC11.49g，MgS041.93g，（NH4)2S0 42.64g，Tween20 2mL 和 Betainel87.4g;其中 100yL 的 dNTP 混合液由 25yL dATP、25yL dCTP、25yL dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0021] 溶液2為引物混合物，所述引物混合物由20yL FIP、20yL BIP、2. 5yL F3和 2· 5 μ L B3組成，其中FIP、BIP、F3和B3的濃度均為100 μ Μ ;
[0022] 溶液3為超純水。
[0023] 本發(fā)明操作步驟中的步驟（1)中待測樣本總DNA提取的操作按照TIANGEN組織 DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0024] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0025] 1、本發(fā)明根據(jù)GenBank公布的壺菌標(biāo)準(zhǔn)株-ΑΥ598034的基因序列，針對壺菌序列 保守區(qū)域設(shè)計了壺菌的lamp檢測方法的特異性引物2對，一對外引物F3、B3和一對內(nèi)引物 FIP、BIP，4條引物序列如上圖表所示。以提取樣本總DNA為模板，建立了快速檢測壺菌的 LAMP技術(shù)。
[0026] 2、本發(fā)明LAMP檢測技術(shù)利用特異引物（4條），以識別壺菌靶基因的幾個特定區(qū) 域，特異性更強(qiáng)。反應(yīng)在等溫（62°C )條件下進(jìn)行，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器，擴(kuò)增反應(yīng) 極快，一般30分鐘完成，擴(kuò)增產(chǎn)物量大，利用電泳檢測或熒光染料技術(shù)鑒定出待測樣本是 否含有壺菌；靈敏度高、特異性強(qiáng)，適合壺菌的快速準(zhǔn)確檢測。
[0027] 3、本發(fā)明LAMP技術(shù)不需要單獨反轉(zhuǎn)錄過程和巢式PCR的二次擴(kuò)增，減少分子檢測 的一些環(huán)節(jié)，降低了檢測的污染率。且實驗證明檢測靈敏度比PCR高100倍，是該方法對兩 棲類壺菌病的早期診斷更準(zhǔn)確。
[0028] 4、本方法具有操作簡單、低成本，反應(yīng)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點，且用時 短，靈敏度比普通逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈鎖反應(yīng)（PCR)高100倍，對壺菌早期診斷準(zhǔn)確性更高。 可廣泛用于樣本快速檢測、壺菌流行監(jiān)控。
[0029] 5、本發(fā)明還根據(jù)檢測方法相應(yīng)地建立了檢測試劑盒，本發(fā)明方法和試劑盒可快 速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測壺菌，適合樣本快速檢測、壺菌流行監(jiān)控等。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0030] 1、圖1為壺菌的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的引物特異性檢測電泳圖。
[0031] 2、圖2為壺菌的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的靈敏度實驗電泳圖。 3、 圖3為壺菌的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的靈敏度實驗電泳圖。 4、 圖4為壺菌的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的靈敏度實驗熒光顯示圖。

【具體實施方式】：
[0032] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗例對本發(fā)明壺菌的LAMP快 速檢測方法及試劑盒作進(jìn)一步的說明。
[0033] 本發(fā)明提供一種壺菌的快速檢測方法。根據(jù)GenBank公布的壺菌標(biāo)準(zhǔn)株-- AY598034的基因序列，針對壺菌保守區(qū)域的序列（序列如SEQ No. 1所示）設(shè)計了壺菌的 LAMP檢測方法的4條特異性引物分別為外引物F3 (序列如SEQ No. 2所示）、外引物B3 (序 列如SEQ No. 3所示）、內(nèi)引物FIP(序列如SEQ No. 4所示）和內(nèi)引物BIP(序列如SEQ No. 5 所示），以壺菌標(biāo)準(zhǔn)株--AY598034為模板，建立了檢測所有壺菌的LAMP方法。然后依據(jù) 電泳圖譜診斷。
[0034] 以下實施例中涉及的各種真菌均可從市場直接購買。
[0035] 實施例1 :壺菌的LAMP方法檢測
[0036] 本實施例中待測樣本中的陽性樣本即壺菌由美國專家Joyce提供，陰性樣本為純 水。
[0037] 具體的檢測方法步驟為：
[0038] (1)、按照TIANGEN組織DNA提取試劑盒說明書的步驟提取陽性樣本和陰性樣本的 總DNA核酸作為反應(yīng)模板；
[0039] (2)、配置LAMP反應(yīng)溶液：按總反應(yīng)體積25 μ L為例，擴(kuò)增體系由5 μ L溶液1、5 μ L 溶液2和15 μ L溶液3組成；
[0040] 其中溶液1為2Χ反應(yīng)緩沖液，所述2Χ反應(yīng)緩沖液由900yL2XLAMP反應(yīng) 緩沖液和l〇〇yL濃度為25mM的dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應(yīng)緩沖液的組成 為：lMpH8.8Tris-HC140mL，KC11.49g，MgS0 41.93g，（NH4)2S042.64g，Tween20 2mL 和 Betainel87. 4g ;其中 100μ L 的 dNTP混合液由 25μ LdATP、25y L dCTP、25y L dGTP和 25μ L dTTP組成；
[0041] 溶液2為引物混合物（100μΜ Primer stock)，所述引物混合物由20yL FIP、 20 μ L ΒΙΡ、2· 5 μ L F3 和 2· 5 μ L B3 組成，其中 FIP、BIP、F3 和 B3 的濃度均為 100 μ Μ ;
[0042] 溶液3為超純水；
[0043] (3)、取步驟1)提取的樣本總DNA1 μ L加入到步驟2)配制的LAMP反應(yīng)溶液中，混 合；
[0044] (4)、在62 °C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘；
[0045] (5)、診斷結(jié)果：取產(chǎn)物5μ L進(jìn)行2. 0%核酸瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90V， 25min ;電泳圖出現(xiàn)條帶的為陽性，沒有出現(xiàn)條帶的為陰性。
[0046] 凝膠電泳圖如圖1所示，其中泳道1和2為待測樣本，結(jié)果為陽性；泳道3為陰性 對照，結(jié)果為陰性。
[0047] 實施例2 :壺菌的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的特異性實驗：
[0048] 本實施例中的引物和操作步驟與實施例1完全相同。
[0049] 用實施例1的引物和操作步驟在壺菌基因組、毛霉菌基因組、水霉菌基因組、青霉 菌基因組、酵母菌基因組、虹彩病毒基因組、皰疹病毒基因組共7個樣本進(jìn)行檢測，陰性樣 本為純水。
[0050] 具體的檢測方法為：
[0051] (1)、按照TIANGEN組織DNA提取試劑盒說明書的步驟分別提取壺菌基因組、毛霉 菌基因組、水霉菌基因組、青霉菌基因組、酵母菌基因組、虹彩病毒基因組、皰疹病毒基因和 純水的總DNA作為反應(yīng)模板；
[0052] (2)、配置LAMP反應(yīng)溶液：按總反應(yīng)體積25 μ L為例，擴(kuò)增體系由5 μ L溶液1、5 μ L 溶液2和15 μ L溶液3組成；
[0053] 其中溶液1為2Χ反應(yīng)緩沖液，所述2Χ反應(yīng)緩沖液由900yL2XLAMP反應(yīng) 緩沖液和l〇〇yL濃度為25mM的dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應(yīng)緩沖液的組成 為：lMpH8.8Tris-HC140mL，KC11.49g，MgS0 41.93g，（NH4)2S042.64g，Tween20 2mL 和 Betainel87.4g;其中 100yL 的 dNTP 混合液由 25yL dATP、25yL dCTP、25yL dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0054] 溶液2為引物混合物（100 μ M Primer stock)，所述引物混合物由20 μ L FIP、 20 μ L ΒΙΡ、2· 5 μ L F3 和 2· 5 μ L B3 組成，其中 FIP、BIP、F3 和 B3 的濃度均為 100 μ Μ ;
[0055] 溶液3為超純水；
[0056] (3)、分別將步驟（1)提取的總DNA1 μ L加入到步驟⑵配制的25 μ L LAMP反應(yīng) 溶液中，混合；
[0057] (4)、在62 °C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘；
[0058] (5)、診斷結(jié)果：取產(chǎn)物5μ L進(jìn)行2. 0%核酸瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90V， 25min。電泳圖出現(xiàn)條帶的為陽性，沒有出現(xiàn)條帶的為陰性。
[0059] 如圖2所示，其中圖2中，M :marker (分子標(biāo)尺）；泳道1 :壺菌基因組；泳道2 :毛 霉菌基因組；泳道3 :水霉菌基因組；泳道4 :青霉菌基因組；泳道5 :酵母菌基因組；泳道6 : 虹彩病毒基因組；泳道7 :皰疹病毒基因組；泳道8 :陰性對照。由圖2所示，只有壺菌基因 組呈陽性，說明該方法對壺菌檢測特異。本試驗例中的各種真菌及病毒基因均可從市場購 買并通過常規(guī)方法進(jìn)行提取或者由東北林業(yè)大學(xué)保護(hù)醫(yī)學(xué)與生態(tài)安全研究中心保存和提 取，東北林業(yè)大學(xué)保護(hù)醫(yī)學(xué)與生態(tài)安全研究中心保證從申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放生物 材料。
[0060] 實施例3 :壺菌的LAMP快速檢測方法所用試劑盒的靈敏度實驗：
[0061] 本實施例中的引物和操作步驟與實施例1完全相同，待測樣本中的陽性樣本即壺 菌由美國專家Joyce提供，陰性樣本為純水
[0062] 為壺菌病毒LAMP引物擴(kuò)增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果，擴(kuò)增條件為 62°C，擴(kuò)增時間為30min。1. 028X 107-1. 028X 101個拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，和對 照組均無條帶產(chǎn)生，此圖可看出本研究所設(shè)計的通用LAMP引物在62°C下，擴(kuò)增30min之后 最少可檢出1. 028X101個拷貝的模板（如附圖3和圖4)。
[0063] 具體檢測步驟如下：
[0064] (1)、按照TIANGEN組織DNA提取試劑盒說明書的步驟提取待測樣本總的DNA核 酸，將提取的DNA分別加水稀釋從10 7到101，稀釋后的DNA作為反應(yīng)模板；
[0065] (2)、配置LAMP反應(yīng)溶液：按總反應(yīng)體積25 μ L為例，擴(kuò)增體系由5 μ L溶液1、5 μ L 溶液2和15 μ L溶液3組成；
[0066] 其中溶液1為2Χ反應(yīng)緩沖液，所述2Χ反應(yīng)緩沖液由900yL2XLAMP反應(yīng) 緩沖液和100 μ L濃度為25mM的dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應(yīng)緩沖液的組成 為：lMpH8.8Tris-HC140mL，KC11.49g，MgS041.93g，（NH4)2S0 42.64g，Tween20 2mL 和 Betainel87.4g;其中 100yL 的 dNTP 混合液由 25yL dATP、25yL dCTP、25yL dGTP 和 25 μ L dTTP 組成；
[0067] 溶液2為引物混合物（100 μ M Primer stock)，所述引物混合物由20 μ L FIP、 20 μ L ΒΙΡ、2· 5 μ L F3 和 2· 5 μ L B3 組成，其中 FIP、BIP、F3 和 B3 的濃度均為 100 μ Μ ;
[0068] 溶液3為超純水；
[0069] (3)、當(dāng)結(jié)果需要用熒光染料技術(shù)檢測時，在步驟（2)的25 μ L LAMP反應(yīng)中加入 1 μ L熒光染料；
[0070] (4)、取步驟（1)提取的樣本總DNA1 μ L加入到步驟（3)配制的LAMP反應(yīng)溶液中， 混合；
[0071] (5)、在62°C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘；
[0072] (6)、診斷結(jié)果：1.瓊脂糖電泳觀察結(jié)果；
[0073] 2.在紫外燈的直接照射下，觀察實驗結(jié)果。
[0074] 結(jié)果如圖3所示，其中圖3中，M:marker (分子標(biāo)尺）；泳道1 :1.028X 107個拷 貝；泳道2 :1. 028 X 106個拷貝；泳道3 :1. 028 X 105個拷貝；泳道4 :1. 028 X 104個拷貝；泳 道5 :1. 028X 103個拷貝；泳道6 :1. 028X 102個拷貝；泳道7 :1. 028X 101個拷貝；泳道8 : 1. 028 X 10°個拷貝；泳道9 :1. 028 X ΚΓ1個拷貝；10泳道：陰性對照。
[0075] LAMP反應(yīng)過程中可通過熒光染料使其顯色，如圖4可以看出，最低可以看出10個 拷貝的壺菌濃度，與靈敏度后瓊脂糖電泳結(jié)果檢測一致。
[0076] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限 制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技 術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依 據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本 發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 壺菌的LAMP快速檢測方法，包括下述步驟： (1) 、提取待測樣本總DNA作為反應(yīng)模板； (2) 、按溶液1 :溶液2 :溶液3 = 1 : 1 : 3的體積比配置LAMP反應(yīng)溶液； (3) 、將步驟⑴提取的樣本總DNA加入到步驟⑵配制的LAMP反應(yīng)溶液中，混合； (4) 、在62 °C恒溫水浴中反應(yīng)30分鐘； (5) 、診斷結(jié)果：將步驟（4)擴(kuò)增反應(yīng)后產(chǎn)物用電泳檢測或熒光染料技術(shù)進(jìn)行鑒定，呈 陽性的表示樣本含有壺菌，呈陰性的表示樣本不含有壺菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其特征在于，步驟⑵中的溶液 1為2X反應(yīng)緩沖液，所述2X反應(yīng)緩沖液由900μ?2ΧυνΜΡ反應(yīng)緩沖液和lOOyL濃度 為25mM的dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應(yīng)緩沖液的組成為：1M pH8. 8Tris-HC140mL， KC11. 49g，MgS04l. 93g，（NH4)2S042. 64g，Tween20 2mL 和 Betainel87. 4g ;其中 100μ L 的 dNTP 混合液由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ LdTTP 組成； 溶液2為引物混合物，所述引物混合物由20yL FIP、20yL BIP、2. 5yL F3和2. 5yL B3組成，其中FIP、BIP、F3和B3的濃度均為100 μ Μ ; 溶液3為超純水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其特征在于，步驟⑶中樣本總DNA 與LAMP反應(yīng)溶液之間的體積比為1 : 25。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其特征在于，步驟（5)中電泳檢測 的過程為：取產(chǎn)物5 μ L進(jìn)行2. 0%核酸瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90V，25min ;電泳圖出 現(xiàn)條帶的為陽性，沒有出現(xiàn)條帶的為陰性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其特征在于，步驟（5)中的熒光染 料技術(shù)鑒定過程為：在步驟（2)配置的LAMP反應(yīng)溶液中加入染色劑，反應(yīng)后在紫外燈下呈 現(xiàn)綠色為陽性，不呈現(xiàn)綠色的為陰性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的壺菌LAMP快速檢測方法，其特征在于：染色劑與步驟（2)配 置的LAMP反應(yīng)溶液的體積比為1 : 25。
7. 用于權(quán)利要求1?5中任一權(quán)利要求所述的壺菌的LAMP快速檢測方法的試劑盒，其 特征在于：所述試劑盒由溶液1、溶液2和溶液3組成，其中溶液1、溶液2和溶液3之間的 體積比為1 : 1 : 3; 溶液1為2X反應(yīng)緩沖液，所述2X反應(yīng)緩沖液由900 μ L2XLAMP反應(yīng)緩沖液 和100 μ L濃度為25mM的dNTP混合液組成；其中2XLAMP反應(yīng)緩沖液的組成為： 1M pH8.8Tris-HC140mL，KC11.49g，MgS041.93g，（NH4)2S0 42.64g，Tween20 2mL 和 Betainel87. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 組成； 溶液2為引物混合物，所述引物混合物由20yL FIP、20yL BIP、2. 5yL F3和2. 5yL B3組成，其中FIP、BIP、F3和B3的濃度均為100 μ Μ ; 溶液3為超純水。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195224SQ201410310285
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】王曉龍, 張子群 申請人:東北林業(yè)大學(xué)