專利名稱：：一種結(jié)核肽Ag85B_199-207特異性TCR、其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核抗原肽特異性T細(xì)胞受體(TCR)，以及利用該TCR制備得到的一種用于結(jié)核基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染得到的CD8+T細(xì)胞及其在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核是全球范圍內(nèi)感染率最高的傳染病，病死率僅次于艾滋病。近年來(lái)，隨著人口流動(dòng)的增加、HIV與結(jié)核菌伴發(fā)感染、以及耐藥和多重耐藥菌株的流行，使全球結(jié)核病死灰復(fù)燃，呈現(xiàn)卷土重來(lái)之勢(shì)。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)報(bào)告，全世界有1/3人口受到結(jié)核菌感染，結(jié)核病患者達(dá)2000萬(wàn)，每年新發(fā)病人數(shù)800-1000萬(wàn)、因結(jié)核病死亡人數(shù)300萬(wàn)。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)高居全球第二，目前結(jié)核菌感染人數(shù)已超過(guò)6億，結(jié)核病患者達(dá)600萬(wàn)之多，每年新發(fā)病人數(shù)150萬(wàn)、因結(jié)核病死亡人數(shù)25萬(wàn)，全國(guó)肺結(jié)核報(bào)告發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)一直高居各種傳染病之首。目前結(jié)核病治療仍以化療為主，但存在療程長(zhǎng)、毒副作用大等缺點(diǎn)，降低了病人服藥順從性，病人不規(guī)則服藥、自行停藥、選擇性服藥等都可能提高結(jié)核桿菌耐藥的機(jī)率，耐藥菌的產(chǎn)生是導(dǎo)致結(jié)核難治的根本原因，單一調(diào)整化療方案效果有限；而且化療無(wú)法解決因機(jī)體免疫力低下或缺陷引起的內(nèi)源性復(fù)燃和外源性再感染。因此，開創(chuàng)新的有效的治療方法已成為當(dāng)務(wù)之急！T細(xì)胞抗原受體(Tcellreceptor,TCR)是所有T細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，在T細(xì)胞抗原識(shí)別中起關(guān)鍵作用。TCR是由α、β兩條肽鏈構(gòu)成的異二聚體，每條肽鏈又可分為可變區(qū)(V區(qū))，恒定區(qū)(C區(qū))，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分；其胞質(zhì)區(qū)很短，信號(hào)傳遞主要通過(guò)與其以非共價(jià)鍵結(jié)合的CD3分子進(jìn)行。TCR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區(qū)；V區(qū)(Va、νβ)又各有三個(gè)高變區(qū)⑶R1XDR2、⑶R3，其中以⑶R3變異最大，直接決定了TCR的抗原結(jié)合特異性。在TCR識(shí)別MHC-抗原肽復(fù)合體時(shí)，⑶R1、⑶R2識(shí)別和結(jié)合MHC分子抗原結(jié)合槽的側(cè)壁，而CDR3直接與抗原肽相結(jié)合。根據(jù)TCRνα、νβ基因的同源性，可將80多個(gè)TCRVa基因分為32個(gè)家族、60多個(gè)TCRνβ基因分為24個(gè)家族。利用每個(gè)T細(xì)胞克隆均有其獨(dú)特CDR3序列的特點(diǎn)，采用CDR3譜型分析技術(shù)，可測(cè)定各TCR家族各CDR3出現(xiàn)的頻率，由此反映T細(xì)胞的克隆性。未接受抗原刺激的T細(xì)胞中，針對(duì)各種抗原的T細(xì)胞克隆分布均勻，表現(xiàn)為多家族和多克隆性，具體地，表現(xiàn)為各家族均出現(xiàn)呈高斯分布的約8個(gè)CDR3峰；抗原刺激則引起識(shí)別該抗原的某一個(gè)或幾個(gè)特異TCR家族T細(xì)胞反應(yīng)性增生，表現(xiàn)為該家族CDR3成員出現(xiàn)少于4個(gè)峰的寡克隆或單克隆分布，其中具有單克隆CDR3分布(表現(xiàn)為單峰)的TCR家族即是抗原特異單克隆增生的TCR家族。對(duì)該家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，可獲得抗原特異TCRCDR3序列。⑶8+T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一種，通過(guò)抗原識(shí)別受體(TCRαβ)識(shí)別多肽抗原與自體MHCI類分子形成的復(fù)合物，能特異性殺傷表達(dá)其TCR所識(shí)別的抗原表位的靶細(xì)胞，在抗細(xì)菌與病毒感染、急性同異型移植物排斥和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用中是重要的效應(yīng)細(xì)胞，被稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。近年來(lái)，在感染結(jié)核桿菌的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，功能性CD8+T細(xì)胞的缺乏顯著增加小鼠對(duì)結(jié)核桿菌的易感性，表明CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞一樣，在抗結(jié)核感染中具有重要的保護(hù)作用。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，⑶8+T細(xì)胞能識(shí)別結(jié)核桿菌感染的細(xì)胞，通過(guò)釋放IFN-Y、溶解感染的靶細(xì)胞和直接殺傷細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，在抗結(jié)核桿菌感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。鑒定結(jié)核抗原的MHCI限制性CTL表位，對(duì)于闡明CD8+T細(xì)胞在抗結(jié)核中的保護(hù)效應(yīng)、深入了解抗結(jié)核免疫反應(yīng)以及研發(fā)新型抗結(jié)核疫苗等具有至關(guān)重要的作用。Ag85復(fù)合體是結(jié)核桿菌表達(dá)的一種具有免疫顯性的抗原蛋白，由85A、85B和85C3種高度同源的蛋白組成，與分枝桿菌的轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)，參與合成分枝桿菌的細(xì)胞壁，能夠在多數(shù)接觸結(jié)核桿菌的健康人體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和IFN-Y釋放，是結(jié)核疫苗較理想的候選抗原。Ag85B199_2OT肽是一個(gè)高度保守的結(jié)核抗原肽，具有HLA-A*0201限制性，而此等位基因在人群中的頻率超過(guò)40%。Ag85B199_207肽可誘導(dǎo)抗結(jié)核桿菌的Thl型保護(hù)性免疫反應(yīng)，使效應(yīng)性T細(xì)胞表達(dá)IFN-Y和TNF-α等細(xì)胞因子發(fā)揮抗菌作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，以Ag85B199_207免疫HLA-A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠可提高T細(xì)胞增殖水平和細(xì)胞毒性水平。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于篩選出結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCR，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其轉(zhuǎn)染到⑶8+T細(xì)胞中，獲得表達(dá)結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異TCR的⑶8+T細(xì)胞，以及該經(jīng)過(guò)TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異性T細(xì)胞受體(TCR)，包括a鏈和β鏈，其中，α鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:3所述的序列；β鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:4所示的序列。優(yōu)選的，所述結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的a鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的a鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。編碼結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異性TCR的基因。一種結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有編碼結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異性TCR的基因。一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有SEQIDNO:13所示的基因。優(yōu)選的，上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的出發(fā)載體為pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。上述逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞。結(jié)核肽Ag85B特異性TCR，編碼該TCR的基因，含有該基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒，該逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案具體步驟流程如下I、篩選結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCR①采用淋巴細(xì)胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)；②計(jì)數(shù)PBMC，調(diào)整PBMC數(shù)目為IXIO6/孔，每孔細(xì)胞分別加入含結(jié)核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)的10%FBS-1640培養(yǎng)基2ml；③貼壁培養(yǎng)2h后，加入25U/mlIL-2,第3天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續(xù)培養(yǎng)11天；④磁珠分選出⑶8+T細(xì)胞，提取其mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；⑤互補(bǔ)決定區(qū)3(complementaritydeterminingregion3,CDR3)譜型分析檢測(cè)刺激前后⑶R3譜型，找出刺激后呈單克隆增生的結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異的TCRα、β基因家族。2、構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體①根據(jù)GeneBank報(bào)道的人TCRα、β基因家族上游可變區(qū)(variableregion,V)和下游恒定區(qū)(constantregion,C)基因序列，設(shè)計(jì)TCRα、β鏈全長(zhǎng)基因上、下游引物,擴(kuò)增出結(jié)核肽特異的TCRα、β全長(zhǎng)基因。②設(shè)計(jì)C區(qū)突變位點(diǎn)上、下游引物，采用重組PCR方法將TCRα、β鏈C區(qū)的9個(gè)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變(參照文獻(xiàn)Luoff.etal.DevelopmentofgeneticallyengineeredCD4+andCD8+T-cellsexpressingTCRsspecificfora38kDaM.tuberculosisantigen.JMolMed.2011，89(9):903_13)。該步驟的目的在于減少內(nèi)外源性TCRα、β基因的錯(cuò)配，因?yàn)棰?+T細(xì)胞存在內(nèi)源性TCRα、β基因的表達(dá)，通過(guò)突變可以促使外源性α與β基因表達(dá)的蛋白正確裝配成TCR蛋白分子并穩(wěn)定表達(dá)在CD8+T細(xì)胞表面，同時(shí)利于其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD8+T細(xì)胞表面的CD3分子，增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)功能，提高修飾后CD8+T細(xì)胞的抗結(jié)核活性。當(dāng)然，此處還可以釆取其他策略來(lái)減少內(nèi)外源性TCRα.β鏈的錯(cuò)配，如以0)3ζ鏈替換α、β全長(zhǎng)基因部分C區(qū)(Sebestyen，Z.etal.(2008)HumanTCRthatincorporateCD3{zeta}inducehighlypreferredpairingbetweenTCR{alpha}and{beta}chainsfollowinggenetransfer.J.Immunol.180，7736-7746);在外源性α、β基因C區(qū)引入二硫鍵(Boulter，J.M.etal.(2003)Stable,solubleT—cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.ProteinEng.16，707-711);突變外源性α、β基因C區(qū)關(guān)鍵氨基酸以改變?chǔ)?、β鏈之間的靜電荷(Voss，R.H.etal.(2008)MoleculardesignoftheCabinterfacefavorsspecificpairingofintroducedTCRabinhumanTcells.J.Immunol.180，391-401);將外源性α、β基因V區(qū)合并為一條單鏈TCR并與CD3ζ鏈融合(Willemsen，R.A.etal.(2000)GraftingprimaryhumanTlymphocyteswithcancer-specificchimericsinglechainandtwochainTCR.GeneTher.7，1369-1377);利用2A連接外源性α、β基因?qū)崿F(xiàn)平衡表達(dá)(LeisegangMjEngelsB，MeyerhuberP，KiebackE，SommermeyerD，XueSAjReussS，StaussH，UckertW.EnhancedfunctionalityofTcellreceptor-redirectedTcellsisdefinedbythetransgenecassette.JMolMed.2008,86:573-583.)等。③利用重組PCR技術(shù)，將結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異的TCRα、β基因片段通過(guò)自剪切多肽Ρ2Α進(jìn)行連接獲得最小突變TCR基因；④將測(cè)序正確的hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα融合基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP，酶切鑒定；⑤采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒pMX-hVβmCβ-P2A-hVamCa-IRES-GFP與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293；⑥收集48h-72h病毒上清，低溫超速離心濃縮純化病毒；⑦重組病毒感染NIH3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒滴度，計(jì)算公式病毒滴度(IU/ml)=NIH3T3細(xì)胞數(shù)XGFP陽(yáng)性率/病毒濃縮液量(ml)。3、鑒定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞的抗結(jié)核活性①采用Ficoll密度梯度離心法，分離HLA-A*0201型供者外周血PBMC；②磁珠分選CD8+T細(xì)胞；③IL-2和抗CD3單抗活化分選出的T細(xì)胞；④按感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)=13將上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染CD8.T細(xì)胞；⑤使用IL-2和抗⑶3單抗刺激感染后的⑶8+T細(xì)胞；⑥流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒感染后陽(yáng)性細(xì)胞的百分比；⑦測(cè)定病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞的抗TB活性實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組(結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異TCR基因修飾的⑶8+T細(xì)胞+樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DC))、未轉(zhuǎn)染組(未轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載結(jié)核肽Ag85B199_2(l7的DC)、空載體轉(zhuǎn)染組(空載體轉(zhuǎn)染⑶8+T細(xì)胞+負(fù)載結(jié)核肽Ag85B199_2OT的DC)、無(wú)關(guān)肽組(結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載CMVpp65的DC)、TBTd+TB-DC組(結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載結(jié)核肽Ag85B199_2(l7的DC)。用酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y、TNF-α的分泌水平；用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolvedfluoroimmuno-assay,TRFIA)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞對(duì)DC的殺傷活性。其中，CD8+T細(xì)胞是人體內(nèi)的一種細(xì)胞亞群，可由人外周血中分離獲得，并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，分離和培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，技術(shù)成熟。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是由一種逆轉(zhuǎn)錄病毒序列構(gòu)建的基因運(yùn)載工具，能夠攜帶外源基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，并整合到染色體基因組上，目前已成為商業(yè)化產(chǎn)品，容易購(gòu)買和獲得。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法為本領(lǐng)域常用的分子克隆技術(shù)，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染方法是目前常用的生物技術(shù)手段，除本發(fā)明中使用的人工脂質(zhì)體法外，還可以使用其它化學(xué)轉(zhuǎn)染法，包括=DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法；以及物理方法，包括顯微注射、電穿孔、基因槍等。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明成功篩選出結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異的TCR，攜帶該肽特異TCR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞可成功表達(dá)外源性TCR基因，特異性識(shí)別結(jié)核肽Ag85B199_2(l7并介導(dǎo)IFN-y,TNF-α細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒活性，具有結(jié)核病基因治療的應(yīng)用價(jià)值，可為結(jié)核病的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療開辟新徑。圖I結(jié)核肽Ag85B199_207刺激前后CD8.T細(xì)胞TCRα和β鏈CDR3譜型分析；圖2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-hVβ16mCβ_P2A_hVα13mCα-IRES-GFP構(gòu)建示意圖；圖3pMX-hVβ16mCP-P2A-hVa13mCa-IRES-GFP的酶切鑒定(M.DL15000marker；I.pMX-IRES-GFP空載體；2.pMX-IRES-GFP空載體的XhoI酶切產(chǎn)物；3.pMX-hVβ16mC3-P2A-hVa13mCa-IRES-GFP；4.pMX-hVβ16mCβ_P2A_hVa13mCa-IRES-GFP的XhoI酶切產(chǎn)物；5.pMX-hVβ16mCβ_P2A_hVa13mCa-IRES-GFP的Xhol+Notl雙酶切產(chǎn)物)；圖4熒光顯微鏡觀察重組病毒轉(zhuǎn)染后NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)(XlO)(a.明場(chǎng)；b.熒光；c.置加圖);圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組病毒轉(zhuǎn)染后NIH3T3細(xì)胞的GFP表達(dá)陽(yáng)性率(a.未轉(zhuǎn)染；b.pMX-hVβ16mCβ_P2A_hVa13mCa-IRES-GFP)；圖6熒光顯微鏡觀察重組病毒轉(zhuǎn)染后⑶8+T細(xì)胞GFP的表達(dá)(X10；EmTd:空載體轉(zhuǎn)染組；TBTd:重組病毒轉(zhuǎn)染組)；圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組病毒轉(zhuǎn)染后⑶8+T細(xì)胞GFP的表達(dá)(UnTd:未轉(zhuǎn)染組；EmTd空載體轉(zhuǎn)染組JBTd:重組病毒轉(zhuǎn)染組)；圖8ELISA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞IFN-Y的分泌水平；圖9ELISA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞TNF-α的分泌水平；圖10TRFIA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞的殺傷活性。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件操作，例如Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黃培堂等譯，2002，北京科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實(shí)施例中，所有計(jì)量資料結(jié)果用±s表示，采用單因素方差分析(One-Way八勵(lì)￥4)比較各組間細(xì)胞因子正^￥、了即-0分泌水平的差異，方差不齊時(shí)用Welch校正，采用LSD法進(jìn)行各組間兩兩比較，方差不齊時(shí)采用Dunnett’sT3法校正。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。采用SPSS17.Oforwindows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)施例I.篩選結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCRI.I密度梯度離心法分離純化PBMC(1)在15ml刻度無(wú)菌離心管加入適量Ficoll淋巴細(xì)胞分離液；(2)取肝素抗凝的外周靜脈血與等量RPMI1640液充分混勻稀釋，用巴斯德滴管吸取2倍體積的抗凝血沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持界面完整。If20°C，1800"2000rpm/min水平離心2030min；(3)離心后管內(nèi)液體分為四層，上層為血漿和稀釋液，管底主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的灰白色云霧層；(4)用吸管插到灰白色層，吸取單個(gè)核細(xì)胞，置于另一離心管內(nèi)，加入5倍以上體積的RPMI1640液，1820°C，1500rpm/min離心lOmin，洗滌細(xì)胞兩次去除大部分混雜的血小板后為PBMC；(5)細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活力檢測(cè)PBMC細(xì)胞懸液與1/10體積的O.4%臺(tái)酚藍(lán)染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)板上角上四個(gè)大方格總細(xì)胞數(shù)，總細(xì)胞數(shù)的四分之一數(shù)乘以IO4即為每毫升濃度；死細(xì)胞可著色臺(tái)盼藍(lán)，活的不著色，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率[活細(xì)胞率％=(活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))X100%]。I.2制備結(jié)核肽、HIV肽特異T細(xì)胞克隆(1)計(jì)數(shù)PBMC，調(diào)整PBMC數(shù)目為IXIO6/孔，分別加入含50ng/ml結(jié)核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)的10%FBS-1640培養(yǎng)基2ml；·(2)37。C、5%CO2條件下培養(yǎng)2h后，加入IL-225U/ml；(3)第3天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續(xù)培養(yǎng)11天。I.3免疫磁珠(德國(guó)美天旎生物公司)分選⑶8+T細(xì)胞。I.4總RNA提取試劑盒(OMEGA)提取上述收集到的細(xì)胞沉淀的總RNA。I.5逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(Fermentas)合成cDNA。I.6PCR擴(kuò)增34個(gè)TCRVα基因家族CDR3片段(參照文獻(xiàn)XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)利用34條TCRVa家族特異性上游引物和共用下游Ca外、內(nèi)側(cè)引物做半巢式PCR:第一輪PCR:每樣本做34個(gè)PCR反應(yīng)管，第I34管分別加入TCRVaI至Va34家族上游引物，每管加共用下游Ca外側(cè)引物Ιμ，各引物濃度均為10μΜ。每PCR反應(yīng)管體積為25μ1，含cDNA模板I.0μ1，10mmol/LdNTPO.5μ1，IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2L5μ1，TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性3min;95°C30s,60。C30s，72。Clmin，35個(gè)循環(huán)；72。C延伸lOmin。第二輪PCR:反應(yīng)總體積為25μ1，含第一輪PCR產(chǎn)物2μl，10mmol/LdNTP0.5μI,10XBuffer2·5μI，25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U,TCRVα34條家族上游引物1μ1，下游FAM標(biāo)記內(nèi)側(cè)Ca引物Iμ1，各引物濃度均為10μΜ。PCR反應(yīng)條件95。C2min；60°C2min，72。C10min，4個(gè)循環(huán)。I.7PCR擴(kuò)增24個(gè)TCRνβ基因家族CDR3片段(參照文獻(xiàn)XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)每樣本做24個(gè)PCR反應(yīng)管，每管加入TCRCβ-FAM下游引物IμI，第I至第24管分別加入TCRνβ至TCRVβ24上游引物Iμ1，各引物濃度均為10μM15PCR反應(yīng)體積為25μ1，含cDNA模板1μl，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應(yīng)條件94。C變性3min;94。Clmin,55°Clmin，72。Clmin,35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。1.8瓊脂糖凝膠電泳取34個(gè)TCRVa和24個(gè)TCRνβ基因家族PCR產(chǎn)物各5μ1，2%瓊脂糖凝膠電泳，110V，20min,采用凝膠成像系統(tǒng)照相。剩余PCR產(chǎn)物-20°C保存?zhèn)溆?。I.9CDR3譜型分析取34個(gè)Va、24個(gè)νβ基因家族FAM熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物2μ1，在373DNA序列分析儀(ABI,PerkinElmer)上進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，收集電泳過(guò)程中不同時(shí)間出現(xiàn)的不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)，GeneScan672軟件自動(dòng)分析收集的數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換為不同位置、高度和形態(tài)的峰，代表各TCR家族CDR3成員出現(xiàn)的頻率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有單峰分布的TCR家族即是抗原特異性單克隆增生的TCR家族。⑶R3譜型分析結(jié)果顯示，抗原肽刺激⑶8+T細(xì)胞后，部分TCR基因家族譜型發(fā)生改變，由原來(lái)的8個(gè)或多于8個(gè)峰型的高斯分布變?yōu)樯儆?個(gè)峰的單寡峰分布，表明這些家·族是由于抗原肽持續(xù)刺激引起的寡克隆或單克隆增生。比較刺激前后CDR3譜型的變化，找出刺激前為多克隆，結(jié)核肽刺激后分別呈單克隆擴(kuò)增的Va13、Vβ16基因家族(圖I)。測(cè)序顯示，結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)特異的TCRVa13、Vβ16的CDR3區(qū)的核苷酸序列如SEQIDNO:I和SEQIDNO:2所示，兩條⑶R3序列編碼的氨基酸序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。2.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(構(gòu)建流程見圖2)2.I合成引物依據(jù)GeneBank報(bào)道的Va13、Vβ16基因家族V區(qū)序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因上、下游引物，依據(jù)人C區(qū)9個(gè)關(guān)鍵氨基酸突變后的序列(即mCα與mCβ)分別設(shè)計(jì)上、下游引物，依據(jù)Ρ2Α肽連接序列設(shè)計(jì)引物,全部引物由Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物名稱和序列如下權(quán)利要求1.結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異性T細(xì)胞受體(TCR)，包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:3所述的序列；β鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:4所示的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR，其特征在于，所述TCR的α鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異性TCR，其特征在于，所述α鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。4.編碼權(quán)利要求I3任一項(xiàng)所述TCR的基因。5.一種結(jié)核肽Ag85B199_207特異性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。6.一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有權(quán)利要求4或5所述的基因。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，出發(fā)載體包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。8.權(quán)利要求6或7所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。9.權(quán)利要求8所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞。10.權(quán)利要求I3任一項(xiàng)所述的結(jié)核肽Ag85B特異性TCR、權(quán)利要求4或5所述的基因、權(quán)利要求6或7所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、權(quán)利要求8所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒、權(quán)利要求9所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種結(jié)核肽Ag85B199–207特異性TCR、其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與應(yīng)用。本發(fā)明成功篩選出結(jié)核肽Ag85B199–207(KLVANNTRL)特異的TCR，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其轉(zhuǎn)染到CD8+T細(xì)胞中，獲得表達(dá)結(jié)核肽Ag85B199–207特異TCR的CD8+T細(xì)胞。該經(jīng)過(guò)TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞可成功表達(dá)外源性TCR基因，特異性識(shí)別結(jié)核肽Ag85B199–207并介導(dǎo)IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒活性，具有結(jié)核病基因治療的應(yīng)用價(jià)值，可為結(jié)核病的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療開辟新徑。文檔編號(hào)C12N15/62GK102887951SQ201210326569公開日2013年1月23日申請(qǐng)日期2012年9月5日優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日發(fā)明者馬驪,郝佩佩,溫茜,羅微申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)