專利名稱：一種山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)山羊支原體山羊肺炎亞種基因組DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具體說(shuō)是一種山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明還包括該試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
目前常用的診斷山羊傳染性胸膜肺炎的方法包括凝集和PCR，這些方法都有一定的缺點(diǎn)。凝集試驗(yàn)主要是間接血凝法，該方法的缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度低，會(huì)出現(xiàn)漏檢的情況； 而且這種方法是針對(duì)山羊傳染性胸膜肺炎抗體檢測(cè)，檢測(cè)為陽(yáng)性的動(dòng)物可能是接種支原體疫苗引起的。PCR和LAMP方法都是基于分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的靈敏、特異、高效新型診斷技術(shù)。但山羊傳染性胸膜肺炎PCR過(guò)程比較復(fù)雜，在擴(kuò)增以后要進(jìn)行酶切鑒定才能確定是否為陽(yáng)性，并且該方法需要昂貴的PCR儀來(lái)配合使用，反應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)，反應(yīng)后需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳用凝膠呈像儀觀察結(jié)果，且在動(dòng)物基因組DNA提取過(guò)程中，可能會(huì)有一些遺留的 PCR反應(yīng)的抑制因子影響其特異性和敏感性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服當(dāng)前山羊傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)中的不足，提供一種基于分子生物學(xué)領(lǐng)域的的高敏感性、高特異性、高效性、操作簡(jiǎn)單的山羊傳染性胸膜肺炎快速檢測(cè)試劑盒，同時(shí)提供該試劑盒的制備方法。一種山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒，包括2XLAMP反應(yīng)液、引物混合物、 BstDNA聚合酶、顯色劑、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板以及dd H2O,所述引物混合物包括上游內(nèi)部引物 FIP、下游內(nèi)部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比為FIP =BIP :F3 B3=8 8 1 :1ο所述引物針對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種標(biāo)準(zhǔn)株F38 Η2基因設(shè)計(jì)，引物序列為 上游內(nèi)部引物FIP (Flc+F2)
5 ‘ -TGCTGGTGAATATTTTGTAGCAGGT-TTTT-AAGCCCAAAGTTAATATACCTTGA -3 ‘ 下游外部引物BIP (Blc+B2)
5 ‘ -CAACACCAGATTCAAAGAAAGGTTT-TTTT-GAGTTGAAAGCTTTTTAGATTGT -3 ‘ 上游外部引物 F3: 5 ‘ -ACAACCTAAAGAGATTATTCACTC-3 ‘ 下游外部引物 Β3: 5 ‘ -AACTTGACTTCCAACAACAA-3 ‘
所述2XLAMP反應(yīng)液包括4% pH8. 8的三羥甲基氨基乙烷(Tris-HCl )、20mM氯化鉀 (KCl)、16mM 硫酸鎂(MgSO4)、20mM 硫酸銨((NH4) 2S04)、0· 2% 吐溫 20 (Tween 20)、2· 8mM 脫氧核苷酸混合物(dNTPs)和1.6M甜菜堿。所述山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒的制備方法如下
(1)制備2 X LAMP反應(yīng)液①配置Tris-HCl 配置濃度為12. 11% Tris，并用HCl調(diào)節(jié)pH8. 8，備用 逸配置含有終濃度為22. 2mM的KCl、17. 8mM的MgSO4、22. 2mM的(NH4)2SO4和
1. 78M的甜菜堿的混合溶液，并加入0. 22% Tween 20和4. 4%的Tris-HCl，備用；③將②中配置的溶液與25mM dNTPs按照體積比為9 1的比例混合；
a、制備2 X LAMP反應(yīng)液①配置1Tris-HCl 配置濃度為12. 11% Tris,并用HCl調(diào)節(jié)
pH8. 8，備用(2)配置含有終濃度為 22. 2mM 的 KCl、17. 8mM 的 MgSO4、22. 2mM 的(NH4)2SO4 和
1. 78M的甜菜堿的混合溶液，并加入0. 22% Tween 20和4. 4%的Tris-HCl，備用；③將Cg中配置的溶液與25mM dNTPs按照體積比為9 1的比例混合；
(2)制備引物混合物(!)針對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種H2基因的一段高度保守的區(qū)
域設(shè)計(jì)引物；②混合引物中FIP =BIP :F3 :B3為8 :8 :1 :1，按照如上體積比例混勻。(3)制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板①將山羊支原體山羊肺炎亞種標(biāo)準(zhǔn)株F38接種于改良
KM2液體試管培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待顏色發(fā)生變化，由紅色變?yōu)辄S色后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)接種于30ml液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待顏色發(fā)生變化，由紅色變?yōu)辄S
色后收集菌體；將培養(yǎng)物置4°C離心機(jī)12000rpm離心30min，棄上清，用PH7. 2PBS緩沖
液以同樣條件離洗3次；③提取F38基因組DNA，此為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。反應(yīng)體系為50% 2 X LAMP反應(yīng)液、3. 6%引物混合物、0. 4% BstDNA聚合酶、8%標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板以及；34.4% dd H2O0反應(yīng)條件為65°〇，211;801，51^11;41，永久保存。反應(yīng)后按體積比為25 :1將LAMP產(chǎn)物與顯色劑混合，觀察顏色變化，判斷結(jié)果。本發(fā)明是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，基于山羊支原體山羊肺炎亞種H2基因，應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的方法快速檢測(cè)山羊傳染性胸膜肺炎的試劑盒，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，不需要特殊的儀器設(shè)備，解決了山羊傳染性胸膜肺炎檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、操作復(fù)雜等缺陷，可以用于檢測(cè)臨床樣本是否感染山羊支原體山羊肺炎亞種，以及山羊傳染性胸膜肺炎的早期診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。
具體實(shí)施例方式一種山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒，包括2XLAMP反應(yīng)液、引物混合物、BstDNA聚合酶、顯色劑以及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。2XLAMP 反應(yīng)液包括4% Tris-HCl (pH8.8)、20mM KCl、16mM MgSO4,20mM (NH4) 2S04、0. 2% Tween 20,2. 8mM dNTPs 和 1· 6M 甜菜堿。
引物混合物包括
40pmol上游內(nèi)部引物FIP、40pmol下游內(nèi)部引物BIP、5pmol上游外部引物F3、5pmol下 游外部引物B3。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步詳細(xì)說(shuō)明 實(shí)施例1
(I)制備LAMP反應(yīng)液
①配置Tris-HCl 稱取121. Ig Tris于800mLddH20中溶解，用HCl調(diào)節(jié)pH8. 8，定容至 lOOOmL，備用；
稱取 1. 49g KCl、3. 96g MgSO4 7H20、2. 64g (NH4) 2S04、187. 4g 甜菜堿，并加入 40mL①中配置的Tris-HCl以及2mL Tween 20，加dd H2O定容至900 mL，備用； 取900iiL(|)中配置的溶液，加入100iiL25mM dNTPs，混勻。⑵制備引物混合物
①針對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種H2的一段高度保守的區(qū)域，利用I^rimer Expolorer V4在線軟件設(shè)計(jì)引物；
混合引物包括22. 4ii L FIP和BIP、2. 8iiL F3和B3，混勻。⑶制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板
①將山羊支原體山羊肺炎亞種標(biāo)準(zhǔn)株F38接種于改良KM2液體試管培養(yǎng)基，置37°C
培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待顏色發(fā)生變化，由紅色變?yōu)辄S色后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)接種于30ml液體培養(yǎng)基 中，置37°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待顏色發(fā)生變化，由紅色變?yōu)辄S色后收集菌體；
②將培養(yǎng)物置4°C離心機(jī)12000rpm離心30min，棄上清，用PH7.2PBS緩沖液以同樣 條件離洗3次；
③提取F38基因組DNA，此為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。檢測(cè)時(shí)按照如下反應(yīng)體系 LAMP反應(yīng)液 12. 5 U L BstDNA聚合酶 1 U L引物混合物0. 9 U L
權(quán)利要求
1.一種山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒，包括2XLAMP反應(yīng)液、引物混合物、 BstDNA聚合酶、顯色劑、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板以及dd H2O,其特征在于所述引物混合物包括上游內(nèi)部引物FIP、下游內(nèi)部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比為FIP: BIP :F3 :B3=8 :8 :1 :1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的引物針對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種標(biāo)準(zhǔn)株F38 H2基因設(shè)計(jì)，所述引物序列為上游內(nèi)部引物FIP (Flc+F2)5 ‘ -TGCTGGTGAATATTTTGTAGCAGGT-TTTT-AAGCCCAAAGTTAATATACCTTGA -3 ‘下游外部引物BIP (Blc+B2)5 ‘ -CAACACCAGATTCAAAGAAAGGTTT-TTTT-GAGTTGAAAGCTTTTTAGATTGT -3 ‘上游外部引物 F3: 5 ‘ -ACAACCTAAAGAGATTATTCACTC-3 ‘下游外部引物 B3: 5 ‘ -AACTTGACTTCCAACAACAA-3 ‘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述 2XLAMP 反應(yīng)液包括 4% ρΗ8· 8 的 Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgS04、20mM (NH4)2SO4^O. 2% Tween 20、2. 8mM dNIPs 和 1.6M 甜菜堿。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述山羊傳染性胸膜肺炎肺炎的快速檢測(cè)試劑盒的制備方法， 其特征在于按下述工藝方法制備a、制備2X LAMP反應(yīng)液① 配置Tris-HCl 配置濃度為12. 11% Tris，并用HCl調(diào)節(jié)pH8. 8，備用O配置含有終濃度為22. 2mM的KCl、17. 8mM的MgSO4,22. 2mM的(NH4) 2S04和1. 78M的甜菜堿的混合溶液，并加入0. 22% Tween 20和4. 4%的Tris-HCl，備用；③將②中配置的溶液與25mM dNTPs按照體積比為9 1的比例混合；b、制備引物混合物①針對(duì)山羊支原體山羊肺炎亞種標(biāo)準(zhǔn)株F38H2基因的一段高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物；②混合引物中FIP =BIP :F3 :B3為8 :8 :1 :1，按照如上體積比例混勻；C、制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板①將山羊支原體山羊肺炎亞種標(biāo)準(zhǔn)株F38接種于改良KM2液體試管培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待顏色發(fā)生變化，由紅色變?yōu)辄S色后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)接種于30ml液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待顏色發(fā)生變化，由紅色變?yōu)辄S色后收集菌體；②將培養(yǎng)物置4°C離心機(jī)12000rpm離心30min，棄上清，用PH7. 2PBS緩沖液以同樣條件離洗3次；③提取F38基因組DNA，此為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
全文摘要
一種山羊傳染性胸膜肺炎的快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法，建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，包括2×LAMP反應(yīng)液、引物混合物、BstDNA聚合酶、顯色劑、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板以及ddH2O，所述引物混合物包括上游內(nèi)部引物FIP、下游內(nèi)部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比為FIP∶BIP∶F3∶B3=8∶8∶1∶1。本發(fā)明的試劑盒具有敏感性高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，不需要特殊的儀器設(shè)備，解決了山羊傳染性胸膜肺炎病原分離時(shí)間長(zhǎng)、工作量大及檢測(cè)方法繁瑣操作復(fù)雜等缺陷。可以用于檢測(cè)臨床樣本是感染山羊肺炎支原體山羊肺炎亞種，以及山羊傳染性胸膜肺炎的早期診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102277439SQ20111024856
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者儲(chǔ)岳峰, 張念章, 賀英, 趙萍, 逯忠新, 高鵬程 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所