專利名稱：解淀粉芽孢桿菌凝乳酶凍干粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體的說是一種解淀粉芽孢桿菌凝乳酶凍干粉的制備方法。
背景技術(shù)：
凝乳酶是干酪和干酪素生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵性酶，其主要作用是專一性的剪切酪蛋白Wie 105-Met 106的肽鍵，從而使酪蛋白膠粒發(fā)生沉淀。凝乳酶主要有三種來源，分別為動物凝乳酶，植物凝乳酶和微生物凝乳酶。動物凝乳酶中使用最廣泛的是小牛皺胃酶。隨著干酪工業(yè)的發(fā)展，小牛皺胃酶來源不穩(wěn)定，而且價格昂貴。植物凝乳酶分布于植株的果實、葉、莖和根等部位，但制成的干酪?guī)в幸欢ǖ目辔?，而且成品得率較低，質(zhì)地也稍軟，致使商品價值很低。自1964年Arima首先發(fā)現(xiàn)了微小毛霉(Mucor microus)可以產(chǎn)凝乳性的蛋白酶， 并對其作了詳細(xì)的研究以來，微生物凝乳酶就成為動物性凝乳酶替代品的研究重點。微生物具有生長周期短，生長速度快，生長條件易于控制，生產(chǎn)成本低等特點，目前各國的發(fā)酵工業(yè)都比較發(fā)達(dá)，發(fā)酵產(chǎn)物的提取工藝比較完善。因此，對由微生物所分泌的凝乳酶的研究和開發(fā)有廣闊的前景。但目前已報道的細(xì)菌產(chǎn)生的凝乳酶很少，且大多活力較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種凝乳酶液酶活高的解淀粉芽孢桿菌凝乳酶凍干粉的制備方法。使用的微生物
用來生產(chǎn)本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌凝乳酶凍干粉是一種解淀粉芽孢桿菌 (.Bacillus amyloliquefaciens) D4 CGMCC NO. 3290,在本申請人 2010. 01. 15 提交的 CN102041237A專利申請中已經(jīng)提交微生物保藏。本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌凝乳酶的制備方法，是利用麩皮汁作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基，采用本實驗室分離的解淀粉芽孢桿菌為菌種制備發(fā)酵液，得到的發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sephadex A-25離子交換層析和冷凍干燥得到凝乳酶。該制備方法為下列步驟
(1)種子液制備
將解淀粉芽孢桿菌D4 CGMCC NO. 3290的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C溫度下，轉(zhuǎn)速140 r/min的搖床中培養(yǎng)M小時，得到菌種種子液； 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制法如下
將麩皮按每20 g麩皮加入100 mL自來水的比例加水后煮沸10 min，過濾后用自來水補足原體積，得到麩皮汁，將所得的麩皮汁，115°C滅菌20min，室溫下冷卻至30°C作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
(2)發(fā)酵液制備按3%的接種量，將菌種種子液加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C溫度下，轉(zhuǎn)速200 240r/min振蕩培養(yǎng)48 60小時，得到菌種發(fā)酵液；
(3)發(fā)酵液的離心
將菌種發(fā)酵液在4°C、8000r/min條件下離心lOmin，得到菌種粗酶液；
(4)酶的分級沉淀
將硫酸銨烘干研細(xì)，取菌種粗酶液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至菌種粗酶液飽和度達(dá)到30%，在4°C溫度下靜置2小時后，以7000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心lOmin，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨粉末至菌種粗酶液飽和度達(dá)到70%，在4°C溫度下靜置2小時后，以8000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心lOmin，沉淀溶于濃度0. Olmol/L的磷酸鹽緩沖液中，磷酸鹽緩沖液的pH值為 6. 8，在4°C溫度下透析48小時；
(5)酶的膜過濾濃縮
將透析過的菌種粗酶液，用截留分子量為2萬道爾頓的超濾膜除去大量的水分，即得菌種濃縮凝乳酶液；
(6)酶的冷凍干燥
在菌種濃縮凝乳酶液中加入凍干保護劑，凍干保護劑的加入比例按每IOOmL菌種濃縮凝乳酶液加入30g凍干保護劑的，與-20°C溫度下預(yù)冷8小時，然后保持物料溫度在-30°C 下干燥M小時，得到凝乳酶凍干粉；
(7)粉碎、包裝
將凝乳酶凍干粉粉碎后進(jìn)行包裝。作為本發(fā)明制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(6)中采用的凍干保護劑的重量比組成為，甘氨酸環(huán)糊精甘露醇氯化鈉=1 2 2 1。本發(fā)明將解淀粉芽孢桿菌凝乳酶發(fā)酵液，經(jīng)硫酸銨分級沉淀、膜過濾濃縮、低溫冷凍干燥和粉碎后得到凝乳酶凍干粉，其凝乳活力較CN102041237A直接發(fā)酵得到的凝乳酶液的酶活高190 200倍，同時由于使發(fā)酵生成的酶由液體變成固體，便于酶制劑的保存和運輸。
具體實施例方式實施例1
將麩皮按每20 g麩皮加入100 mL自來水的比例加水后煮沸10 min，過濾后用自來水補足原體積，得到麩皮汁。將所得的麩皮分裝到500mL三角瓶，115°C滅菌20min，室溫下冷卻至30°C作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基。將解淀粉芽孢桿菌D4接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 140 r/min搖床培養(yǎng)M 小時，得到種子液。將種子液按3%的接種量，加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)48小時，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液在4°C、8000r/min條件下離心lOmin，得到粗酶液，測得凝乳活力為2310. 5SU/mL。將硫酸銨烘干研細(xì)，向粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到30%，4°C靜置2小時后，以7000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到 70%，4°C靜置2小時后，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，沉淀溶于0. Olmol/L, pH6. 8的磷酸鹽緩沖液中，4°C透析48小時，測得凝乳活力為2276. 5SU/mL。
將透析過的粗酶液，用截留分子量為2萬道爾頓的超濾膜除去大量的水分，即得濃縮酶液，凝乳活力達(dá)四594. 5SU/mL。在濃縮酶液中按每IOOmL酶液加入30g凍干保護劑的比例加入凍干保護劑，凍干保護劑的重量比組成為，甘氨酸環(huán)糊精甘露醇氯化鈉=1 2 2 1，-20°C預(yù)冷8小時， 然后保持物料溫度在-30°C干燥M小時，得到凍干物料粉碎后得到精制凝乳酶，凝乳活力達(dá)45^20. 5SU/g，是直接發(fā)酵后所得粗酶液酶活(2310. 5SU/mL)的195. 98倍。實施例2
將麩皮按每20 g麩皮加入100 mL自來水的比例加水后煮沸10 min，過濾后用自來水補足原體積，得到麩皮汁。將所得的麩皮分裝到500mL三角瓶，115°C滅菌20min，室溫下冷卻至30°C作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基。將解淀粉芽孢桿菌D4接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 140 r/min搖床培養(yǎng)M 小時，得到種子液。將種子液按3%的接種量，加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、240r/min振蕩培養(yǎng)討小時，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液在4°C、8000r/min條件下離心lOmin，得到粗酶液，測得凝乳活力為2336. 5SU/mL。將硫酸銨烘干研細(xì)，向粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到30%，4°C靜置2小時后，以7000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到 70%，4°C靜置2小時后，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，沉淀溶于0. Olmol/L, pH6. 8的磷酸鹽緩沖液中，4°C透析48小時，測得凝乳活力為2318. 5SU/mL。將透析過的粗酶液，用截留分子量為2萬道爾頓的超濾膜除去大量的水分，即得濃縮酶液，凝乳活力達(dá)30139. 5SU/mL。在濃縮凝乳液中按每IOOmL酶液加入30g凍干保護劑的比例加入凍干保護劑，凍干保護劑的重量比組成為，甘氨酸環(huán)糊精甘露醇氯化鈉=1 2 2 1，-20°C預(yù)冷8小時，然后保持物料溫度在-30°C干燥M小時，得到凍干物料粉碎后得到精制凝乳酶，凝乳活力達(dá)453418. 5SU/g，是直接發(fā)酵后所得粗酶液酶活(2336. 5SU/mL)的194. 05倍。實施例3
將麩皮按每20 g麩皮加入100 mL自來水的比例加水后煮沸10 min，過濾后用自來水補足原體積，得到麩皮汁。將所得的麩皮分裝到500mL三角瓶，115°C滅菌20min，室溫下冷卻至30°C作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基。將解淀粉芽孢桿菌D4接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 °C,140 r/min搖床培養(yǎng)M 小時，得到種子液。將種子液按3%的接種量，加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、220r/min振蕩培養(yǎng)60小時，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液在4°C、8000r/min條件下離心lOmin，得到粗酶液，測得凝乳活力為2318. 5SU/mL。將硫酸銨烘干研細(xì)，向粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到30%，4°C靜置2小時后，以7000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨粉末至其飽和度達(dá)到 70%，4°C靜置2小時后，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，沉淀溶于0. Olmol/L, pH6. 8的磷酸鹽緩沖液中，4°C透析48小時，測得凝乳活力為2312. 5SU/mL。將透析過的粗酶液，用截留分子量為2萬道爾頓的超濾膜除去大量的水分，即得濃縮酶液，凝乳活力達(dá)30101. 5SU/mL。在濃縮凝乳液中按每IOOmL酶液加入30g凍干保護劑的比例加入凍干保護劑，凍干保護劑的重量比組成為，甘氨酸環(huán)糊精甘露醇氯化鈉=1 2 2 1，-20°C預(yù)冷8小時，然后保持物料溫度在-30°C干燥M小時，得到凍干物料粉碎后得到精制凝乳酶，凝乳活力達(dá)453220. 5SU/g，是直接發(fā)酵后所得粗酶液酶活(2318. 5SU/mL)的195. 48倍。
權(quán)利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌凝乳酶凍干粉的制備方法，其特征在于該制備方法為下列步驟(1)種子液制備將解淀粉芽孢桿菌D4 CGMCC NO. 3290的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C溫度下，轉(zhuǎn)速140 r/min的搖床中培養(yǎng)M小時，得到菌種種子液；液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制法如下將麩皮按每20 g麩皮加入100 mL自來水的比例加水后煮沸10 min，過濾后用自來水補足原體積，得到麩皮汁，將所得的麩皮汁，115°C滅菌20min，室溫下冷卻至30°C作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)發(fā)酵液制備按3%的接種量，將菌種種子液加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C溫度下，轉(zhuǎn)速200 240r/min振蕩培養(yǎng)48 60小時，得到菌種發(fā)酵液；(3)發(fā)酵液的離心將菌種發(fā)酵液在4°C、8000r/min條件下離心lOmin，得到菌種粗酶液；(4)酶的分級沉淀將硫酸銨烘干研細(xì)，取菌種粗酶液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至菌種粗酶液飽和度達(dá)到30%，在4°C溫度下靜置2小時后，以7000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心lOmin，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨粉末至菌種粗酶液飽和度達(dá)到70%，在4°C溫度下靜置2小時后，以8000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心lOmin，沉淀溶于濃度0. 01moI/L的磷酸鹽緩沖液中，磷酸鹽緩沖液的pH值為 6. 8，在4°C溫度下透析48小時；(5)酶的膜過濾濃縮將透析過的菌種粗酶液，用截留分子量為2萬道爾頓的超濾膜除去大量的水分，即得菌種濃縮凝乳酶液；(6)酶的冷凍干燥在菌種濃縮凝乳酶液中加入凍干保護劑，凍干保護劑的加入比例按每IOOmL菌種濃縮凝乳酶液加入30g凍干保護劑的，與-20°C溫度下預(yù)冷8小時，然后保持物料溫度在-30°C 下干燥M小時，得到凝乳酶凍干粉；(7)粉碎、包裝將凝乳酶凍干粉粉碎后進(jìn)行包裝。
2.如權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌凝乳酶凍干粉的制備方法，其特征在于所述步驟 (6)中采用的凍干保護劑的重量比組成為，甘氨酸環(huán)糊精甘露醇氯化鈉=1 2 2 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌凝乳酶凍干粉的制備方法。本發(fā)明采用解淀粉芽孢桿菌D4為菌種，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心、硫酸銨分級沉淀、膜過濾濃縮、低溫冷凍干燥和粉碎后得到凝乳酶。本發(fā)明以廉價的農(nóng)副產(chǎn)品麩皮等為主要原料，采用液體發(fā)酵方法生產(chǎn)凝乳酶，工藝流程短、成本低、工業(yè)化生產(chǎn)效率高、酶活力高，同時由于使發(fā)酵生成的酶由液體變成固體，便于酶制劑的保存和運輸。
文檔編號C12N9/54GK102321601SQ201110248559
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者喬海軍, 張衛(wèi)兵, 張炎, 梁琪, 甘伯中, 米蘭 申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)