專利名稱：：金黃色葡萄球菌的多重pcr-mix快速檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食品微生物安全監(jiān)測領(lǐng)域，涉及一種微生物快速檢測方法，利用微生物的特異性基因以及多重PCR技術(shù)對微生物進(jìn)行快速檢測鑒定，具體地，涉及金黃色葡萄球菌多重PCR-MIX快速檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
："民以食為天"，食品是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，食品安全是關(guān)系人類健康和社會發(fā)展的重大問題。近年來，國內(nèi)外食品安全的惡性事件不斷發(fā)生，尤其以金黃色葡萄球菌(S啤/^/ococwsawews)、沙門氏菌(&/wo"e〃fl)、大腸桿菌(五sc/zm'c/zz'aco/z')0157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌("Wehawo"oqytogew^)、副溶血性弧菌(V/6Wo;ara/aewoiy/cjw)和蠟樣芽孢桿菌(BflC///^"mm)等引起的食源性疾病最為突出。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中美兩國由微生物引起的食源性疾病均占總數(shù)的50%以上，食源性疾病己成為國內(nèi)外普遍關(guān)心的問題。金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一，國內(nèi)外由金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒屢屢發(fā)生。據(jù)美國疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的細(xì)菌性食物中毒居第一位，占整個細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則高達(dá)45%。我國每年由于金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也很多。目前世界各國都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定測項(xiàng)目。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。引起食物中毒的食品多為動物性食品、乳及乳制品等。在檢測手段上，目前國內(nèi)外檢測機(jī)構(gòu)仍主要采用FDA、AOAC、ISO和GB等標(biāo)準(zhǔn)對金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，整個過程一般需要3-5天，且操作復(fù)雜，已不能滿足微生物快速準(zhǔn)確檢測的現(xiàn)實(shí)需要。因此，迫切需要建立新的快速檢測技術(shù)和方法。近年來，免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方法的應(yīng)用，使金黃色葡萄球菌的快速檢測有了很大發(fā)展。但是，免疫學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法和乳膠凝集試驗(yàn)等，在操作程序、檢測時間和特異性等方面尚不理想；而在分子生物學(xué)方法方面，如PCR技術(shù)則以敏感、特異、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)被越來越多地應(yīng)用。迄今，己有文獻(xiàn)介紹采用多重PCR方法檢測金黃色葡萄球菌。然而，這些方法大多側(cè)重于耐藥性相關(guān)基因和毒素基因，基因的缺失以及引物特異性不強(qiáng)容易造成假陽性問題。因此，建立特異性強(qiáng)的多重PCR檢測方法顯得尤為重要。針對以上不足，本發(fā)明從分子生物學(xué)的角度出發(fā)，利用金黃色葡萄球菌特異性鑒別基因結(jié)合多重PCR技術(shù)對其進(jìn)行快速檢測。首先，在分析金黃色葡萄球菌特異性基因的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)篩選出細(xì)菌特異性引物，然后通過多重PCR技術(shù)研制出多重PCR體系，同時結(jié)合高效的樣本前處理技術(shù)，建立特異性檢測方法，并開發(fā)一管法的分子檢測試劑盒，用于金黃色葡萄球菌的快速診斷和監(jiān)控，可大大節(jié)省檢測成本和時間，具有更廣泛的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種金黃色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速檢測試劑本發(fā)明所述的多重PCR-MIX快速檢測試劑盒，主要包括有PCRMIX(混合物)，該P(yáng)CRMIX含有l(wèi)xPCRbuffer,1.03.0謹(jǐn)ol/LMgCl2，180220pmol/LdNTPeach,—對堿基序列為SEQNO.l和SEQN0.2的、濃度為100~600nmol/L耐熱脫氧核糖核酸酶"wc基因引物，一對堿基序列為SEQN0.3和SEQN0.4的濃度為100-600nmol/L血漿凝固酶d/4基因引物，一對堿基序列為SEQN0.5和SEQN0.6的濃度為100-600nmol/LSmal限制性酶切片斷特異序列引物，2060UTaq酶和0.25%溴酚藍(lán)5020(V。優(yōu)選為包括有l(wèi)xPCRbuffer,1.03.0mmol/LMgCl2，200pmol/LdNTPeach,150~250nmol/L耐熱脫氧核糖核酸酶基因引物(SEQNO.l和2)，150250nmol/L:血漿凝固酶c//4基因引物(SEQN0.3和4)，150-250nmol/LSmal限制性酶切片斷特異序列引物(SEQN0.5和6)，2535UTaq酶，0.25%溴酚藍(lán)100~150nl。本發(fā)明需要解決的另一技術(shù)問題是提供一種金黃色葡萄球菌的速檢測方法。本發(fā)明所述的檢測方法，主要包括以下步驟提取樣品DNA;多重PCR擴(kuò)增，多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCRMIX2223pL，DNA模板l2iaL，反應(yīng)體系25pL;擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性4min;94。C變性30s、58。C退火45s、72。C延伸1min，共進(jìn)行35個循環(huán)；72。C延伸10min;擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測，分析結(jié)果。優(yōu)選地，在提取樣品DNA之前，對樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基為7.5%NaCl肉湯，培養(yǎng)溫度為36-38°C，培養(yǎng)時間為9-11個小時。本發(fā)明通過篩選金黃色葡萄球菌特異性基因及設(shè)計(jì)引物，建立了金黃色葡萄球菌的多重PCR體系，有較好的特異性，快速、靈敏地實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的檢測，克服了傳統(tǒng)檢測方法費(fèi)時、靈敏度低的缺點(diǎn)；并在此基礎(chǔ)上建立了一管法的金黃色葡萄球菌多重PCR檢測試劑盒，提高了檢測效率；所建立的金黃色葡萄球菌多重PCR檢測試劑盒，可對食品和環(huán)境中金黃色葡萄球菌進(jìn)行全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測，為微生物快速檢測提供了新的途徑。本發(fā)明提供的多重PCR檢測方法和試劑盒配置簡單，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，檢測靈敏，周期短、可操作性強(qiáng)，適用于處理大通量的樣本，可以廣泛應(yīng)用到食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。圖l是金黃色葡萄球多重PCR體系電泳結(jié)果示意圖2是金黃色葡萄球菌特異性驗(yàn)證部分電泳結(jié)果示意圖3是金黃色葡萄球菌基因組DNA檢測靈敏度電泳結(jié)果示意圖4人工污染樣品(奶油面包)靈敏度實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果示意圖5是金黃色葡萄球菌實(shí)際樣品的檢測電泳結(jié)果示意圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:金黃色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速檢測試劑盒的建立一、多重PCR反應(yīng)體系的建立1、引物設(shè)計(jì)査閱參考文獻(xiàn)，確定實(shí)驗(yàn)要研究的相關(guān)特異性基因，選擇3個以上基因作為研究對象。登陸NCBI站點(diǎn)(www.ncbi.nlm.nih.gov)，在GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲得致病菌特異基因的登錄號及其核苷酸序列，進(jìn)行基因信息學(xué)分析。經(jīng)過分析，本研究選擇了咖c、c//4、Smal三個特異性鑒別基因。弓l物采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)分析，了解這些引物的動力學(xué)特征，包括引物的長度、Tm值、二級結(jié)構(gòu)、上下游引物的錯配、3'端的穩(wěn)定性、GC含量及PCR產(chǎn)物的長度等，選擇動力學(xué)性質(zhì)盡可能相近的引物對。所有的引物都在GeneBank上進(jìn)行Blast査詢，確定其特異性。經(jīng)過多方組合試驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出特異性高的3對引物組合如表1所示。表l.特異性引物序列及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小目標(biāo)基因引物序列(5，—3')SEQ.PCR產(chǎn)物(bp)F:GCGATTGATGGTGATACGGTT1279R:AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC2F:GCAAAATCCAGCACAACAGGAAACGA3638R:CTTGATCTCCAGCCATAATTGGTGG4F:TGCGAAACATCCACGACATA5426R:CGTTTGTGCTGATTTCCCTAC62、多重PCR反應(yīng)體系的建立本研究分別進(jìn)行了單重PCR的檢測；而且對多重PCR各反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，從而確定了最佳的反應(yīng)模式(見圖l)。圖1中，M100-bpDNAladders,lclfA基因，2Smal基因，3nuc基因，4clfA，Smal，nuc同時擴(kuò)增一支PCRMIX(600|al)，一支陰性對照DNA(30^1)，一支陽性對照DNA(30nl)，l支無菌水(1000|al)，見表1。表2金黃色葡萄球菌多重PCR-MIX試劑盒組成PCRMIX1支，600plddH20l支，1000^NegativeControlDNA1支，30pi(ATCC8032)PositiveControlDNA1支，30|il(ATCC6538)其中一支PCRMIX的成分包括lxPCRbuffer,1.03.0mmol/LMgCl2，200nmol/LdNTPeach(dATP、dCTP、dGTP禾BdTTP)，150~250nmol/L耐熱脫氧核糖核酸酶"wc基因引物(SEQNO.1和2)，150250nmol/L:血漿凝固酶c//4基因引物(SEQN0.3和4),150-250nmol/LSmal限制性酶切片斷特異序列引物(SEQN0.5和6)，25~35UTaq酶，0.25%溴酚藍(lán)100150Hl。以下每個試驗(yàn)中SEQNO.l和2，SEQN0.3和4和SEQN0.5和6的濃度可為150nmol/L,200nmol/L，250nmol/L，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可按照常識，根據(jù)實(shí)際需要，選用合適的濃度，效果一致。二、引物特異性檢測根據(jù)所設(shè)計(jì)的3對特異性PCR引物對56株常見致病菌進(jìn)行PCR檢測，利用正交反應(yīng)多次試驗(yàn)，陰性、陽性結(jié)果見表2，部分結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示10株金黃色葡萄球菌全部擴(kuò)增出638bp、426bp和279bp的目的片段，其它46株非金黃色葡萄球菌無任何擴(kuò)增條帶；結(jié)果表明，3對引物僅對靶細(xì)菌特異。圖2中，M100-bpDNAladders,1Staphylococusaureus(CMCC26003)，2Staphylococusaureus(ATCC6538),3分離株(a)，4分離株(b)，5分離株(d),6分離株(i)，7分離株(k)，8分離株(T7)，9分離株(R8)，10分離株(T8遠(yuǎn))，11Micrococcusluteus騰黃微球菌，12Staphylococcussaprophyticus腐生葡萄球菌；13Staphylococcusintermedius中間葡萄球菌；14Staphylococcushaemolyticus溶血葡萄球菌；15Staphylococcuscohnii科氏葡萄球菌；16Staphylococcushyicus豬葡萄球菌；17Staphylococcusequorum馬胃葡萄球菌；18Staphylococcushominis人葡萄球菌；19negativecontrol(ddH20)。表2Stop/^/ococcwsawre^引物特異性供試菌株StrainSource/accessionno.CMCC26003+++ATCC6538++++++b+++d+++i+++k+++T7+++R8+++T8遠(yuǎn)+++CMCC28001——DTB80111———5Ya;力/Jococci/siyfer/z7WuDTB801215Yap力j^oc(9cc"6"力ae膨Jj^'cDTB80101DTB80116DTB80122DTB80107DTB80106ATCC8032ATCC29212<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>StrainSource/accessionno.刀i/CS啦/CMCC47001———CMCC50071——CMCC50093—CMCC50098——CMCC50115—一CMCC50023——CMCC50335——CMCC50094——5^^o/7eWa分離株DTB20202——5^^/o/7e^s分離株DTB20203——DTB20204—5^膨/eJia分離株DTB20205———5^〗歷^eWa分離株DTB20206—三、引物靈敏度檢測1、基因組靈敏度培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC6538，抽提基因組DNA，用核酸蛋白分析儀DU640檢測DNA含量，進(jìn)行10倍梯度稀釋，將不同稀釋度的DNA分別作PCR擴(kuò)增，電泳PCR產(chǎn)物，分析結(jié)果(詳見圖3)。從圖中可以看出，金黃色葡萄球菌的PCR反應(yīng)靈敏度達(dá)到1.1973ng。圖3中M100-bpladderMarker,11197.3ng，2119.73ng，311.973ng，41.1973ng，50.11973ng,611.973pg，71.1973pg，80.11973pg，9ddH20。2、人工模擬樣品的靈敏度培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC6538，將計(jì)數(shù)的金黃色葡萄球菌菌液進(jìn)行梯度稀釋，取1mL菌懸液人工污染奶油面包，人工污染奶油面包的起始污染菌量為1.2xl041.2xlOGcfW10g，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白(lmL生理鹽水)對照；增菌培養(yǎng)6h和10h，分別取菌懸液提取DNA，PCR檢出情況見圖4。從圖4可以看出，當(dāng)起始污染菌量為12cfu/10g時，37。C增菌6小時即可檢出。圖4中，1-5:增菌10h，1104，2103，3102，4101，5100，6-10:增菌6h,6104，7103,8102，9101，10100，11樣品對照(未加菌)，12試劑對照(未加模板)，MDL2000Marker。四、多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法與傳統(tǒng)方法的比較(1)一共采集43份樣品(市場和超市)，樣品主要有熱狗、生香腸(4份)、批薩、時蔬、水果拼盤、蛋糕(4份)、烏頭魚、鮮肉腸、釀四寶、壽司、基斯、小西點(diǎn)、木瓜湯、豬肉U3份)；牛肉(7份)；雞肉(2份)，禽內(nèi)臟(2份)。采用傳統(tǒng)方法和多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法兩種不同的檢測過程進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測，檢測結(jié)果為陽性的樣本用法國梅里埃細(xì)菌鑒定系統(tǒng)-APISTAPH生化試劑條和測序進(jìn)行驗(yàn)證。國標(biāo)法樣品一0.85。/。生理鹽水稀釋一7.5XNaCl肉湯增菌一涂布血平板一觀察溶血一血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法樣品一7.5%NaCl肉湯增菌一提取DNA—多重PCR擴(kuò)增一擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測。(2)結(jié)果分析43份實(shí)際樣品中，采用多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法檢測，結(jié)果顯示有3份樣品擴(kuò)增出638bp、426bp和279bp的目的片段，部分結(jié)果見圖5，表明檢出3份疑似樣品；傳統(tǒng)方法檢出2份疑似樣品。多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法檢出的3份疑似樣品中，有2份疑似樣品(水果拼盤和蛋糕)與傳統(tǒng)方法一致，用法國生物梅里埃細(xì)菌鑒定系統(tǒng)-APISTAPH生化試劑條對疑似的菌落進(jìn)行最終鑒定，結(jié)果表明，分離出的疑似菌落均為金黃色葡萄球菌，API試劑條的驗(yàn)證結(jié)果見表3和表4。另外一份疑似樣品(釀四寶)由于傳統(tǒng)方法未檢出，本研究將陽性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，對序列進(jìn)行分析，結(jié)果證明與金黃色葡萄球菌的同源性達(dá)到98%。①水果拼盤樣品疑似菌落經(jīng)APISTAPH生化試劑條驗(yàn)證結(jié)果表3所示，在細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的讀取結(jié)果鑒定是金黃色葡萄球菌(符合率97.8%)。表3API生化試劑條讀取結(jié)果管號試驗(yàn)代碼底物成分反應(yīng)結(jié)果0無底物-1GLUD-葡萄糖+2FRUD-果糖+3函ED-甘露糖+4MAL麥芽糖+5LAC乳糖+6TRED-海藻糖+7MAND-甘露醇+8XLT木糖醇-9MELD-蜜二糖-10NIT硝酸鉀+11PALB-萘基-酸性磷酸鹽+12VP丙酮酸鈉+13RAF棉子糖-14XYL木糖-15SAC蔗糖+16MDGa-甲基-D-葡萄糖武-17NAGN-乙酰-葡萄糖胺+18ADH精氨酸+19URE脲素+20LSTR抗溶葡萄球菌素-②蛋糕樣品疑似菌落經(jīng)APISTAPH生化試劑條驗(yàn)證結(jié)果表4所示，在細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的讀取結(jié)果鑒定是金黃色葡萄球菌(符合率95.5%)。表4API生化試劑條讀取結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>③釀四寶樣品將釀四寶樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，序列比對結(jié)果顯示與金黃色葡萄球菌的相似性為98%。以上的試驗(yàn)結(jié)果表明，多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法檢出的金黃色葡萄球菌比傳統(tǒng)方法多檢出一份(結(jié)果已用測序驗(yàn)證)，說明使用多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法對實(shí)際樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測比傳統(tǒng)方法更靈敏。而且，相比而言，多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法的檢測時間更短，整個檢測過程可在12-20h內(nèi)報(bào)告結(jié)果；而傳統(tǒng)方法除了增菌時間要18h-24h夕卜，還要對疑似菌落進(jìn)一步純化和生化鑒定，整個檢測過程至少需要3-5天。實(shí)施例2多重PCR-MIX快速檢測試劑盒檢測市場豬肉樣品1、試劑盒組成一支PCRMIX(600^1，具體成份如實(shí)施例1所述，不同的是SEQNO.l和2，SEQN0.3和4和SEQNO.5和6的濃度分別為550nmol/L)，一支陰性對照DNAG0nl)，一支陽性對照DNA(30W)，1支無菌水(1000nl)。2、樣品檢測過程(1)富集培養(yǎng)采用無菌操作隨機(jī)取樣10g，加入到90mL含7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)液中，37。C培養(yǎng)10小時。(2)DNA提取1)1.5mL樣品，12000r/min2min，棄上清；2)將沉淀懸浮于200iaL丙酮，振蕩混勻，冰浴5min，10000r/min，2min，棄上清；3)沉淀溶于500pLTE緩沖液，振蕩混勻，10000r/min，5min，棄上清；4)將沉淀重懸于400^L裂解液，反復(fù)吹打均勻，冰浴5min，75°C溫育20min;5)力口入IOO5mol/LNaCl，12000r/min，10min;6)取上清，加入IOO船氯仿，顛倒混勻，10000r/min，10min;7)取上清，加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇，置4'C冰箱30min，12000r/min，10min，棄上清；8)加入500|^70%乙醇漂洗，10000r/min，1min;9)DNA沉淀溶于30pLTE緩沖液，于-2(TC保存?zhèn)溆谩?3)多重PCR擴(kuò)增1)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCRMIX22~23|iL，DNA模板l2pL，反應(yīng)體系25pL。2)擴(kuò)增反應(yīng)條件94'C預(yù)變性4min;94。C變性30s、58。C退火45s、72。C延伸1min，共進(jìn)行35個循環(huán)；72'C延伸10min;于2(TC下保存。(4)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測將擴(kuò)增產(chǎn)物于12g/L瓊脂糖凝膠(Goldview染色)電泳檢測及UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，陽性對照有相應(yīng)的擴(kuò)增片段，陰性對照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，樣品沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，說明檢測的豬肉中未含金黃色葡萄球菌。實(shí)施例3多重PCR-MIX快速檢測試劑盒檢測蛋糕樣品1、試劑盒組成一支PCRMIX(600|al具體成份如實(shí)施例1所述，不同的是SEQNO.l和2，SEQN0.3和4和SEQNO.5和6的濃度分別為300nmol/L)，一支陰性對照DNA(30^1)，一支陽性對照DNAG0(il)，l支無菌水(1000W)。參加實(shí)施例l.2、樣品檢測過程(1)富集培養(yǎng)采用無菌操作隨機(jī)取樣10g，加入到90mL含7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)液中，37°。培養(yǎng)10小時。(2)DNA提取1)1.5mL樣品，12000r/min2min，棄上清；2)將沉淀懸浮于200pL丙酮，振蕩混勻，冰浴5min，10000r/min，2min，棄上清；3)沉淀溶于500pLTE緩沖液，振蕩混勻，10000r/min，5min,棄上清；4)將沉淀重懸于400pL裂解液，反復(fù)吹打均勻，冰浴5min，75°C溫育20min;5)力口入IOO|iL5mol/LNaCl，12000r/min,10min;6)取上清，加入IOO|iL酚氯仿，顛倒混勻，10000r/min，10min;7)取上清，加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇，置4。C冰箱30min，12000r/min，10min，棄上清；8)加入500(iL70X乙醇漂洗，10000r/min，1min;9)DNA沉淀溶于30nLTE緩沖液，于-20°C保存?zhèn)溆谩?3)多重PCR擴(kuò)增1)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCRMIX2223pL，DNA模板l2iaL，反應(yīng)體系25pL。2)擴(kuò)增反應(yīng)條件94'C預(yù)變性4min;94'C變性30s、58'C退火45s、72。C延伸1min，共進(jìn)行35個循環(huán)；72'C延伸10min;于2(TC下保存。(4)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測將擴(kuò)增產(chǎn)物于12g/L瓊脂糖凝膠(Goldview染色)電泳檢測及UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，陽性對照有相應(yīng)的擴(kuò)增片段，陰性對照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，樣品擴(kuò)增出638bp、426bp和279bp的目的片段，說明檢測的蛋糕中含有金黃色葡萄球菌。傳統(tǒng)方法證實(shí)亦檢出金黃色葡萄球菌，符合率為95.5%(前面已有生化反應(yīng)結(jié)果)。實(shí)施例4多重PCR-MIX快速檢測試劑盒檢測釀四寶樣品1、試劑盒組成一支PCRMIX(600|^1，如實(shí)施例1所述)，一支陰性對照DNA(30|al)，一支陽性對照DNA(30^1)，1支無菌水(1000pl)。2、樣品檢測過程(1)富集培養(yǎng)采用無菌操作隨機(jī)取樣10g，加入到90mL含7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)液中，37°。培養(yǎng)10小時。(2)DNA提取1)1.5mL樣品，12000r/min2min,棄上清；2)將沉淀懸浮于200nL丙酮，振蕩混勻，冰浴5min，10000r/min，2min，棄上清；3)沉淀溶于500|iLTE緩沖液，振蕩混勻，10000r/min，5min，棄上清；4)將沉淀重懸于400pL裂解液，反復(fù)吹打均勻，冰浴5min，75。C溫育20min;5)力口入IOOpL5mol/LNaCl，12000r/min，10min;6)取上清，加入IOO酚氯仿，顛倒混勻，10000r/min，10min;7)取上清，加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇，置4'C冰箱30min，12000r/min，10min，棄上清；8)加入500|iL70%乙醇漂洗，10000r/min,1min;9)DNA沉淀溶于30pLTE緩沖液，于-20°C保存?zhèn)溆谩?3)多重PCR擴(kuò)增1)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCRMIX2223^L，DNA模板l2pL，反應(yīng)體系25^L。2)擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性4min;94。C變性30s、58。C退火45s、72。C延伸1min，共進(jìn)行35個循環(huán)；72i:延伸10min;于2(TC下保存。(4)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測將擴(kuò)增產(chǎn)物于12g/L瓊脂糖凝膠(Goldview染色)電泳檢測及UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，陽性對照有相應(yīng)的擴(kuò)增片段，陰性對照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，樣品擴(kuò)增出638bp、426bp和279bp的目的片段，說明檢測的釀四寶中含有金黃色葡萄球菌。傳統(tǒng)方法未檢出金黃色葡萄球菌,但用PCR產(chǎn)物測序方法證實(shí)是含有金黃色葡萄球菌，同源性為98。/。。說明多重PCR-MIX快速檢測試劑盒法比傳統(tǒng)方法更靈敏。序列表〈110〉廣東省微生物研究所〈120〉金黃色葡萄球菌多重PCR-MIX快速檢測試劑盒及檢測方法〈160〉6〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉1gcgattgatggtgatacggtt21〈210>2〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>2agccaagccttgacgaactaaagc24<210〉3<211>26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3gcaaaatccagcacaacaggaaacga26<210〉4〈211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列〈■>4cttgatctccagccataattggtgg25<210>5<211>20<212>DNA〈213>人工序列tgcgaaacatccacgacata〈210〉6〈211〉21〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉6cgtttgtgctgatttccctac202權(quán)利要求1.一種金黃色葡萄球菌的多重PCRMIX快速檢測試劑盒，其特征是，主要包括有一管PCRMIX，該P(yáng)CRMIX含有1×PCRbuffer，1.0～3.0mmol/LMgCl2，180～220μmol/LdNTPeach，濃度為100～600nmol/L、堿基序列為SEQNO.1和SEQNO.2的耐熱脫氧核糖核酸酶nuc基因引物對，濃度為100～600nmol/L、堿基序列為SEQNO.3和SEQNO.4的血漿凝固酶clfA基因引物對，濃度為100～600nmol/L、堿基序列為SEQNO.5和SEQNO.6的SmaI限制性酶切片斷特異序列引物對，20～60UTaq酶，0.25％溴酚藍(lán)50～200μl。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌的多重PCRMIX快速檢測試劑盒，其特征是，所述耐熱脫氧核糖核酸酶基因引物、血漿凝固酶基因引物、Smal限制性酶切片斷特異序列引物的濃度分別為150250nmol/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌的多重PCRMIX快速檢測試劑盒，其特征是，PCRMIX還包括有陰性對照DNA和陽性對照DNA。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的金黃色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速檢測試劑盒，其特征是，所述陰性對照DNA是來自菌株ATCC8032;陽性對照DNA是來自菌株ATCC6538。5.—種金黃色葡萄球菌的速檢測方法，其特征是，使用權(quán)利要求1-3任一所述的多重PCR-MIX快速檢測試劑盒，主要包括以下步驟提取樣品DNA;多重PCR擴(kuò)增，多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCRMIX2223nL，DNA模板l2iaL，反應(yīng)體系25nL;擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性4min;94。C變性30s、58。C退火45s、72。C延伸1min，共進(jìn)行35個循環(huán)；72。C延伸10min;擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測，分析結(jié)果。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的金黃色葡萄球菌的速檢測方法，其特征是，在提取樣品DNA之前，對樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基為7.5%NaCl肉湯，培養(yǎng)溫度為36-38°C，培養(yǎng)時間為9-11個小時。全文摘要本發(fā)明公開了一種金黃色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒主要包括有PCRMIX，該P(yáng)CRMIX含有2×PCRbuffer，1.0～3.0mmol/LMgCl²，180～220μmol/LdNTPeach，堿基序列為SEQNO.1和SEQNO.1的濃度為100～600nmol/L耐熱脫氧核糖核酸酶nuc基因引物，堿基序列為SEQNO.3和SEQNO.4的濃度為100～600nmol/L血漿凝固酶clfA基因引物，堿基序列為SEQNO.5和SEQNO.6的濃度為100～600nmol/LSmaI限制性酶切片斷特異序列引物，20～60UTaq酶和溴酚藍(lán)染料。本發(fā)明提供的多重PCR檢測方法和試劑盒配置簡單，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，檢測靈敏，周期短、可操作性強(qiáng)，適用于處理大通量的樣本，可以廣泛應(yīng)用到食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。文檔編號C12Q1/68GK101613745SQ20091004130公開日2009年12月30日申請日期2009年7月21日優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日發(fā)明者吳清平,張菊梅,徐曉可,鄧梅清,郭偉鵬申請人:廣東省微生物研究所;廣東環(huán)凱微生物科技有限公司