專利名稱：快速檢測尿液中糞腸球菌的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種泌尿道感染性疾病病原體基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種快速
檢測尿液中糞腸球菌(^^erococ^/aeca乃's， ￡ /aeca7^s)的熒光定量PCR (聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))試劑盒，適用于糞腸球菌定性定量檢測。
背景技術(shù)：
泌尿道感染是一種常見的細菌性感染疾病。在我國的醫(yī)院感染中，泌尿道感 染僅次于肺部感染，位于第2位。糞腸球菌是泌尿道感染分離率最高的革蘭氏陽 性菌病原菌。糞腸球菌是重要的醫(yī)院感染病原菌，多與尿路器械操作、留置導(dǎo)尿、 尿路結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。臨床表現(xiàn)為尿頻、尿急、尿痛、尿渾濁；嚴重病人有發(fā)熱、 寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、腹痛甚至可以發(fā)展為敗血癥等。
糞腸球菌導(dǎo)致的泌尿道感染一般起病較急，應(yīng)及時治療，否則可反復(fù)發(fā)作， 遷延不愈而轉(zhuǎn)為慢性感染。
近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR， FQ-PCR) 技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達水平分析(Nellemann C, Vinggaard AM， Dalgaard M, et al. Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology [J]. Toxicology, 2001， 163:29—38)、 病原體的定性(McGoldrick A， Lowings JP， Ibata G， et al. A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe (TaqMan) [J]. J. Virol. Methods,1998， 72:125—135.; Bhudevi B， Weinstock D. Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus [J]. Vet. Microbiol.， 2001， 83:1-10.)和定量檢測(Desire N， Dehee A， Schneider V， et al. Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load bya TaqMan Real-Time PCR Assay [J]. J. Clin. Microbiol, 2001, 39: 1303-1310. ; Martell M， Gomez J， Esteban JI， et al. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA [J]. J. Clin, Microbiol, 1999， 37:327-332. ; Kearns AM， Turner AJL， Eltringham GJA， et al. Rapid Detection and Quantification of CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J]. J. Clin. Virol， 2002,24:131-134; Florence KP， GlauciaPB， MireilleS， et al. Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry [J]. J. Virol. Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且己經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量的 主要方法，國內(nèi)目前已有關(guān)于丙肝、乙肝、支原體、艾滋病、結(jié)核定量檢測的試 劑盒上市。臨床檢測上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法具有靈敏度低、特異性差、耗時費力、存在假陰性 等缺點；常規(guī)PCR法雖然有簡便、快速、靈敏的優(yōu)勢，但是有不能對細菌數(shù)量進 行定量和PCR后處理產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽性等問題；因此亟待開發(fā)精確、靈敏、 快速、無污染的臨床檢測方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種快速檢測尿液 中糞腸球菌的熒光定量PCR試劑盒(簡稱本試劑盒)。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的 一、本試劑盒的結(jié)構(gòu)本試劑盒包括a)熒光定量PCR反應(yīng)液，b)標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，c)陰性質(zhì)控標(biāo) 準(zhǔn)品；熒光定量PCR反應(yīng)液含有引物和熒光探針，引物分為正向引物和反向引物； 正向引物為5'-TTCAGCGATTTGACGGATTG -3'; 反向引物為5'-TGTGGCAACAGGGATCAAGA -3';標(biāo)準(zhǔn)陽性模板是從糞腸球菌細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC29212)中提取的糞腸球細 菌基因組DNA，糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株先用無菌TE緩沖液配制成細菌懸液，經(jīng)過平板 計數(shù)法及用定量接種環(huán)確定所配制的菌液濃度為108cFU/ml，經(jīng)過堿裂解提取細菌基因組DNA，再對其進行10倍的倍比稀釋。 具體地說
a) 熒光定量PCR反應(yīng)液
熒光定量PCR反應(yīng)液是由正向引物和反向引物，SYBR PremixEx Taq (內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+, SYBR* Green I)和無菌雙蒸水組成 在本發(fā)明的一個具體方案中，熒光定量反應(yīng)液由10Mmol/L正向引物和反向的引物 各O. 5W， SYBR* Premix Ex Taq (2X)麵，無菌雙蒸水8l4組成，反應(yīng)液總 體積19W。其中引物為所示的核苷酸序列。
b) 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板
標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為從糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC29212)提取的細菌基因組DNA。 挑取糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC29212)菌落，溶于2ml的無菌TE緩沖液中配成細 菌懸液，經(jīng)平板計數(shù)法以及用定量接種環(huán)確定所配制的菌液濃度為l08CFU/ml， 取200 經(jīng)過堿裂解提取細菌基因組DNA，再連續(xù)10倍稀釋成梯度濃度的細菌 基因組DNA溶液，分別對應(yīng)于細菌濃度為10° 108CFU/ml, -20。C保存?zhèn)溆茫?其中的103 108CFU/ml濃度的DNA溶液做為陽性模板。
c) 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品
陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。
本試劑盒的工作原理
在本發(fā)明提供的快速定量檢測糞腸球菌熒光定量PCR試劑盒中，有一種熒光 染料SYBR Green I (包含于試劑SYBR PremixEx Taq中，后者為市售商品試劑)， 這是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增 強，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green I熒光染料，染料分子特異性地 摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信 號，因此其熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR 體系存在的雙鏈DNA數(shù)量，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
對糞腸球菌的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct， Threshold Cycle)相比 較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)個數(shù)，Ct值 與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大， 起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣 品的Ct值可準(zhǔn)確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。
5在本發(fā)明提供的檢測糞腸球菌熒光定量PCR試劑盒中，針對糞腸球菌檢測中 的特殊性，對不同的耙片段進行反應(yīng)體系，如引物濃度、退火溫度等的優(yōu)化，并 將FQ-PCR技術(shù)(熒光定量PCR技術(shù))和定量檢測系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于糞腸球菌 定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實驗，建立了檢測糞腸球菌熒光定量PCR方法， 并研制出檢測糞腸球菌熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應(yīng)體 系中檢出1000CFU/ml，可以滿足快速診斷糞腸球菌的要求。二、本試劑盒的使用方法本試劑盒的使用方法包括下列步驟a) 將標(biāo)準(zhǔn)陽性模板從-2(TC冰箱取出，平衡至室溫待用；b) 取無菌收集的中段尿液lml于EP管，400 g離心5min，取上清600 P 1 轉(zhuǎn)至另一EP管，5000 g離心15min，棄去400 u 1上清液，余下200 ul用于提 取細菌組DNA;c) 對200 u 1尿沉渣加入等體積的含2%SDS的100腿ol/LNaOH進行100。C金 屬浴10分鐘以裂解細菌，獲取游離DNA用于熒光定量PCR反應(yīng)；d) 分別取等量的a)步中的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板和b)步中的尿液標(biāo)本中的細菌組 DNA加入到熒光定量PCR反應(yīng)液(內(nèi)含正向引物和反向引物，SYBR PremixEx Taq 和無菌雙蒸水)中，用熒光定量PCR儀進行檢測；e) 通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值Ct值，對待測樣品的起始拷貝數(shù) 進行定量。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果1、 定量準(zhǔn)確；2、 檢測速度快，加上樣品DNA的提取制備，共僅需2小時；3、 特異性好，靈敏度高；4、 步驟簡單，可重復(fù)性高；5、 可同時進行高通量的樣品檢測。在本發(fā)明中提供的快速定量檢測尿液中熒光定量PCR試劑盒不僅可對尿液 中糞腸球菌菌進行定量檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法的診斷方法。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施實例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實 驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992， 分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細胞實驗 指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。 實施例l:本試劑盒的組成與配制
a、 熒光定量PCR反應(yīng)液正向引物和反向引物各0.5 W (1O她ol/L)， SYBR PremixEx Taq (內(nèi)含TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+， SYBR* Green I) 10W (2X)，無菌雙蒸水8Pl。
b、 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為從糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC29212)提取的細菌基因組 DNA，對應(yīng)的細菌濃度為10° 108CFU/ml。
c、 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。 實施實例2:用本試劑盒檢測尿液中糞腸球菌
a、 取無菌收集中段尿液l ml于EP管，400 g離心5 min，取上清600 ul 轉(zhuǎn)至另一EP管，5000 g離心15min，棄去400 u 1上清液，對余下200 " 1溶液 對200 P 1尿沉渣加入等體積的含2%SDS的lOOmraol/LNaOH進行IO(TC金屬浴10 min，以裂解細菌獲取游離DNA， 4°C， 7000g離心5min，取1 u 1上清液用于熒 光定量PCR反應(yīng)。
b、 將陽性標(biāo)準(zhǔn)模板(試劑b)解凍，回復(fù)室溫。
c、 分別取熒光定量PCR反應(yīng)液(試劑a)各19ul，取第a)步所得DNA、第 b)步的陽性標(biāo)準(zhǔn)模板和無菌雙蒸水(陰性對照)各lPl，分別加入不同的PCR 反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上同步做PCR檢測。擴增條件為94'C預(yù)變性10s; 然后94'C 5 s， 60°C 45 s共40個循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個循環(huán)的 第二步結(jié)束時進行，檢測波長為520nm。反應(yīng)結(jié)束后對產(chǎn)物做瑢鏈曲線分析，條 件如下94 °C 0 s， 20 °C/s; 65 °C 15 s， 20 °C/s; 20 °C 0 s， 0. 1 °C/s。
循環(huán)結(jié)束后，運用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)陽性
模板108CFU/ml、 107CFU/ml、 106CFU/ml、 105CFU/ml、 104CFU/ml、 103CFU/ml、 的Ct值分別為16.85、 19.77、 23.58、 27.77、 33.29、 >36，陰性對照為0;熔 鏈曲線分析顯示Tm=79. 98°C。
回歸曲線方程是Y"4.088X+48.78，相關(guān)系數(shù)『=-0.99，標(biāo)準(zhǔn)差為0. 303。反復(fù)重復(fù)試驗3次，得到Ct值和Tm值進行統(tǒng)計學(xué)分析尸> 0. 05，數(shù)據(jù)差 異無顯著性，說明不同批次之間的檢測結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。從上述實例可以說明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且， 熒光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2小時就能完成，而傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng) 法約需3天左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間。該試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程， 一次可檢測1 377 個(由定量檢測儀的型號決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。按上述方法對100多例臨床標(biāo)本進行了檢測，并與常規(guī)培養(yǎng)方法的結(jié)果進行 對比，驗證本方法的效果優(yōu)于培養(yǎng)方法，檢出率高，操作簡單，省時省力。相關(guān) 實驗結(jié)果己寫成論文，將發(fā)表于有關(guān)的學(xué)術(shù)期刊。
權(quán)利要求
1、一種快速檢測尿液中糞腸球菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于由熒光定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；熒光定量PCR反應(yīng)液含有正向引物、反向引物和SYBR Green I熒光染料；正向引物為5′-TTCAGCGATTTGACGGATTG-3′；反向引物為5′-TGTGGCAACAGGGATCAAGA-3′；標(biāo)準(zhǔn)陽性模板是從糞腸球菌細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中提取的糞腸球菌細菌組DNA；所述的PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒，其特征是熒光定量PCR反應(yīng)液是由正向引物、反向引物，SYBR PremixEx Taq和無菌雙 蒸水組成；所述的SYBR PremixEx T叫內(nèi)含TaKaRa Ex TaqTM HS， dNTP Mixture, Mg2+ 和SYBR Green I。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒，其特征是標(biāo)準(zhǔn)陽性模板從糞腸球菌細菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中提取的糞腸球菌細菌組DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測尿液中糞腸球菌的熒光定量PCR試劑盒，涉及一種泌尿道感染病原體基因檢測技術(shù)，適用于尿液中糞腸球菌定性定量檢測。本發(fā)明由熒光定量PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；熒光定量PCR反應(yīng)液含有正向引物、反向引物和熒光染料。本發(fā)明定量準(zhǔn)確；檢測速度快；特異性好，靈敏度高；步驟簡單，可重復(fù)性高；可同時進行高通量的樣品檢測；不僅可對尿液中糞腸球菌菌進行定量檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法的診斷方法。
文檔編號C12Q1/68GK101629208SQ20081023679
公開日2010年1月20日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者艷 李, 湯永飛, 明 汪 申請人:武漢大學(xué)