本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域,涉及視網(wǎng)膜細胞方面,具體涉及一種視網(wǎng)膜感光細胞特異性表面蛋白的篩選方法。
背景技術(shù):
::視網(wǎng)膜是組成視覺系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。臨床上,針對屈光性視覺功能障礙,已有有效的治療方法,但對視網(wǎng)膜病變,尤其是外傷、變性等原因引起的視覺障礙或失明,目前仍束手無策。由于視網(wǎng)膜來源于神經(jīng)外胚層,具有典型的中樞神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)特點,對損傷敏感,且難以再生,使其成為難治性眼病的癥結(jié)所在,也是眼科研究的重點、難點和亟待攻克的領(lǐng)域。多年來,國內(nèi)外眾多的研究人員為此開展了廣泛的探索,國家科技部也分別于2005年、2007年和2012年分別設(shè)立了三個“973”項目予以攻關(guān)。此外,因結(jié)構(gòu)明晰、功能清楚,且便于操作和觀察,視網(wǎng)膜也是研究中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)、功能,乃至再生的重要窗口。盡管一些低等動物的視網(wǎng)膜具有一定的再生能力,但一般認為哺乳類動物,尤其是靈長類動物的視網(wǎng)膜是不具有這種能力。因此,如何激發(fā)視網(wǎng)膜內(nèi)在的再生潛能或通過外源性細胞的植入,以達到修復視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)甚至功能,成為近10多年來的研究熱點。縱觀近十年來的視網(wǎng)膜再生研究,在干細胞來源、干細胞誘導分化、動物模型制備及干細胞移植方式上已經(jīng)取得了一定的進展,但仍存在諸多問題有待解決。目前通過干細胞誘導分化所獲得的視網(wǎng)膜細胞通常是多種細胞的混合,而視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病早期多數(shù)僅累及一種細胞,因此,如果能夠獲得某種純化的細胞,且在視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病早期將純化的細胞移植到體內(nèi),則可以從兩個方面對患者的視覺功能進行改善:首先,移植的純化細胞可以改善患者局部的微環(huán)境,從而有利于患者自身殘存細胞的生存;其次,移植的純化細胞可以部分替代受損細胞,從而改善患者的視覺功能。細胞替代療法治療神經(jīng)元退行性疾病首要解決的問題是細胞純度的問題。其原因顯而易見,首先,將誘導分化的細胞在體外進行藥物篩選或功能鑒定時,混 雜的其它細胞將會影響結(jié)果的可靠性;其次,如果將混雜的細胞移植到模型動物體內(nèi),將會產(chǎn)生異常增生甚至致瘤的風險。雖然目前已經(jīng)有很多研究致力于提高節(jié)細胞的誘導分化率,例如:將math5轉(zhuǎn)染到干細胞,然后通過facs篩選來獲得純化的節(jié)細胞,然而,這些方法存在致命缺陷,即:將報告載體轉(zhuǎn)染到干細胞內(nèi)會導致干細胞基因組的改變,從而限制了其臨床應用。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于提供一種視網(wǎng)膜感光細胞特異性表面蛋白的篩選方法,從而找到感光細胞特異性表面蛋白,用于人胚胎干細胞/人多能干細胞來源的視網(wǎng)膜感光細胞的純化,從而加快臨床利用細胞移植替代療法治療人類視網(wǎng)膜相關(guān)疾病(如青光眼、黃斑性眼病等)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:一種視網(wǎng)膜感光細胞特異性表面蛋白的篩選方法,包括如下步驟:(1)利用talen技術(shù),建立crx-gfp的人胚胎干細胞系,將這種crx-gfp的人胚胎干細胞系誘導分化至第6周,將誘導分化至第6周的視網(wǎng)膜細胞球在含有ⅱ型膠原酶的hanks溶液中消化過夜,得到細胞懸液;(2)第二天,在細胞懸液中加入等體積的含有ⅱ型膠原酶、?;撬?、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的hanks溶液進一步消化,獲得單細胞;(3)應用bd公司的表面蛋白篩選試劑盒對消化的單細胞進行篩選,篩選出感光細胞特異性表面蛋白。如果細胞球過硬,不容易消化,為了充分分散細胞球,將步驟(2)得到的單細胞用0.25%胰酶/edta進一步消化,然后進行步驟(3)的操作。步驟(1)中,hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml。步驟(1)中,所述消化是在25℃的條件下進行消化。步驟(2)中,hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml、牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為1mg/ml,?;撬岬奈镔|(zhì)的量濃度為10mm/ml、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸的物質(zhì)的量濃度為0.1mm/ml。所述步驟(3)中具體篩選方法如下:a、對單細胞表面蛋白進行染色,然后用lsrii流式細胞儀進行分析,單細胞表面蛋白的染色在含有10%胎牛血清和0.5%皂苷的pbs溶液中進行;b、選用bd公司的facsariatmii細胞分選儀對 106/ml的單細胞進行分選,分選過程中單細胞重懸液為含有6%胎牛血清的pbs溶液;c、選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進行磁珠分選、分選出cd抗體,選用bd公司針對lsrii的高通量樣品分析對于cd抗體的高通量細胞流式分析;d、所得到的數(shù)據(jù)應用流式分析軟件treestar進行分析,確定感光細胞特異性表面蛋白。利用本發(fā)明所述方法可以對純化的感光細胞前體細胞進行進行篩選,篩選出一種感光細胞所特異的表面蛋白,其特異性表達在人胚胎干細胞以及人多能干細胞來源的視網(wǎng)膜感光細胞膜表面;從而利用該特異性表面蛋白對誘導的人胚胎干細胞或人多能干細胞來源的感光細胞進行純化。通過表面蛋白篩選獲得的純化感光細胞,可以避免轉(zhuǎn)基因或者應用多種小分子化合物為誘導劑所帶來的潛在危險。這一關(guān)鍵科學問題的解決,將加快干細胞向臨床轉(zhuǎn)化的過程,符合醫(yī)學研究的需要,為人類視網(wǎng)膜相關(guān)疾病(如青光眼、黃斑性眼病等)的細胞替代治療奠定了基礎(chǔ)。具體實施方式本發(fā)明所述的“人胚胎干細胞誘導分化”采用申請?zhí)枮?01210301765.x,名稱為“一種誘導人多能干細胞分化為視網(wǎng)膜前體細胞的方法”中提到的方法。本發(fā)明其他未提及部分均為現(xiàn)有技術(shù)。報告細胞系構(gòu)建技術(shù):目前已有的報告細胞系構(gòu)建技術(shù)包括傳統(tǒng)的鋅指蛋白技術(shù)、talen技術(shù)和cas9技術(shù),我們采用talen技術(shù)進行報告細胞系的構(gòu)建。一種視網(wǎng)膜感光細胞特異性表面蛋白的篩選方法,包括如下步驟:(1)利用talen技術(shù),建立crx-gfp的人胚胎干細胞系,將這種crx-gfp的人胚胎干細胞系誘導分化至第6周,將誘導分化至第6周的視網(wǎng)膜細胞球在含有ⅱ型膠原酶的hanks溶液中于25℃的條件下消化過夜,消化時在搖床輕搖,得到細胞懸液;hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml;(2)第二天,在細胞懸液中加入等體積的含有ⅱ型膠原酶、?;撬?、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的hanks溶液進一步消化,輕輕吹打以分散細胞,細胞分散后,1000r/m離心5min,篩網(wǎng)過濾后備用;如果細胞球過硬,不容易消化,則需要用0.25%胰酶/edta進一步消化,以充分分散細胞球,獲得單細胞;hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml、牛血清白蛋白的質(zhì)量 濃度為1mg/ml,?;撬岬奈镔|(zhì)的量濃度為10mm/ml、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸的物質(zhì)的量濃度為0.1mm/ml;(3)應用bd公司的表面蛋白篩選試劑盒對消化的單細胞進行篩選,篩選出感光細胞特異性表面蛋白。步驟(3)中具體篩選方法如下:a、對單細胞表面蛋白進行染色,然后用lsrii流式細胞儀進行分析,單細胞表面蛋白的染色在含有10%胎牛血清和0.5%皂苷的pbs溶液中進行;b、選用bd公司的facsariatmii細胞分選儀對106/ml的單細胞進行分選,分選過程中單細胞重懸液為含有6%胎牛血清的pbs溶液;c、選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進行磁珠分選、分選出cd抗體,選用bd公司針對lsrii的高通量樣品分析對于cd抗體的高通量細胞流式分析;d、所得到的數(shù)據(jù)應用流式分析軟件treestar進行分析,確定感光細胞特異性表面蛋白。人胚胎干細胞的培養(yǎng)和誘導分化ⅰ.人胚胎干細胞的培養(yǎng):將人胚胎干細胞接種在鋪有0.65×105/mlmefs的六孔板內(nèi);干細胞培液內(nèi)含:dmem/f12(1:1)、20%血清替代物、1mml-谷氨酰胺、1%非必須氨基酸(memnon-essentialaminoacids)、0.1mmβ-巰基乙醇、4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bfgf);每5至7天傳代一次,傳代時將形態(tài)上已明顯分化的細胞刮除。ⅱ.人胚胎干細胞的誘導:dispase酶(1mg/ml)消化人多能干細胞約2min后,吸除dispase酶,用干細胞培液(1ml/孔)漂洗一次,再次加入干細胞培液,用吸管將干細胞克隆吹下成小片狀移入離心管中,800r/min離心1min后,用干細胞培液重懸細胞,將細胞重懸液移入非粘附的培養(yǎng)皿中,用干細胞培液培養(yǎng)4天,隔天換液,得到細胞球。將細胞球移入神經(jīng)誘導培養(yǎng)基中(hnm),hnm包含:dmem/f12,1%n2復合物,1%非必須氨基酸(memnon-essentialaminoacids),2ug/ml肝素(heparin),1%l-谷氨酰胺,2天后,將細胞球移入粘附性培養(yǎng)皿中,為了促使細胞球貼壁,可以在hnm中加入10%的胎牛血清(fbs),12h后更換新鮮的不含fbs的hnm。幾天后,貼壁的細胞球會形成許多神經(jīng)管樣的結(jié)構(gòu),大約在貼壁的第9天,將貼壁后形成的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)吹下,移入視網(wǎng)膜誘導培養(yǎng)基中(rdm),rdm包含:dmem/f12、15%血清替代物、1%l-谷氨酰胺、1%非必須氨基酸(neaa)、10mm煙酰胺(nicotinamide,nic)。將形成的 神經(jīng)球懸浮培養(yǎng),每2~3天換液。ⅲ.報告細胞系的建立:利用talen的同源重組技術(shù),將編碼gfp的序列插入到h9人胚胎干細胞系的crx基因位點,從而建立報告細胞系。上述crx-gfp的人胚胎干細胞系中的crx可以根據(jù)不同的視網(wǎng)膜疾病(如青光眼、黃斑性眼病等)進行確定,如:brn3、math5或者tuj-1等。以brn3報告細胞系的建立為例,利用talen的同源重組技術(shù),將編碼gfp的序列插入到h9人胚胎干細胞系的brn3基因位點,從而建立報告細胞系。人胚胎以及成年人視網(wǎng)膜組織的收集研究用經(jīng)藥物流產(chǎn)的4周至12周人胚胎共18例(table2.2)。胎齡的計算是根據(jù)當事人末次月經(jīng)的日期減去2周的時間,即受孕時作為第0天。成年人視網(wǎng)膜取自捐獻角膜后的眼球組織。人組織的獲取及相關(guān)研究經(jīng)相關(guān)倫理委員會批準,并在捐贈者簽署知情同意書的情況下進行。細胞流式及細胞分選將誘導分化至第6周的視網(wǎng)膜細胞球在含有ⅱ型膠原酶(1mg/ml;worthington)的hanks溶液(nacl:136mm,nahco3:4.16mm,napo4:0.34mm,kcl:5.36mm,kh2po4:0.44mm,dextrose:5.55mm,hepes:5mm)中25℃消化過夜,消化時在搖床輕搖。第二天,在細胞懸液中加入等量的含有ⅱ型膠原酶(1mg/ml;worthington)、?;撬?0mm、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸0.1mm、牛血清白蛋白1mg/ml的hanks溶液進一步消化,輕輕吹打以分散細胞。細胞分散后,1000r/m離心5min,篩網(wǎng)過濾后備用。如果細胞球過硬,不容易消化,則需要用0.25%胰酶/edta進一步消化,以充分分散細胞球,獲得單細胞。應用bd公司的表面蛋白篩選試劑盒,對消化的單細胞進行分析。單細胞表面蛋白的染色在含有10%胎牛血清和0.5%saponin(sigma)的pbs溶液中進行,細胞染色后用lsrii流式細胞儀(bd公司)進行分析。對于細胞分選,我們選用facsariatmii(bd公司)細胞分選儀(sickkids-uhnflowcytometryfacility)對106/ml的細胞進行分選,細胞重懸液為含有6%胎牛血清的pbs溶液。為了防止細胞分選過程中由于壓力和剪切力所導致的細胞死亡,我們選用100um的吹管進行分選。另外,我們選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進行磁珠分選,分選出cd抗體;操作步驟和分選條件按照說明書進行。對于cd抗體的高通量細胞流式 分析,我們選用bd公司針對lsrii的高通量樣品分析(high-throughputsampler,hts)進行操作,操作步驟參照說明書。所有數(shù)據(jù)應用流式分析軟件treestar進行分析。免疫染色免疫熒光染色的步驟按照常規(guī)進行,對于細胞球切片或組織切片,過程如下:取出-80℃冰箱內(nèi)保存的冰凍切片,室溫復溫30分鐘。0.01mpbs洗3次,每次10分鐘。含有0.25%tritonx-100和10%驢血清的0.01mpbs孵育1小時。加一抗,濕盒內(nèi)4℃冰箱孵育過夜。0.01mpbs洗3次,每次10分鐘。加二抗,避光室溫孵育1小時。0.01mpbs洗3次,每次10分鐘。用抗熒光淬滅的封片液進行封片,避光晾干后,于熒光顯微鏡下進行觀察和拍照。對于細胞爬片,所不同的是前面的固定過程,即:4%多聚甲醛固定30min,0.01mpbs洗3次,每次10分鐘,-20℃甲醇固定10min,0.01mpbs洗3次,每次10分鐘,后續(xù)封閉以及抗體孵育的步驟同前。如果染色的是細胞膜抗原,則封閉時不加tritonx-100。rt-qpcr用rna提取試劑盒(ambion)進行細胞rna的抽提。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen)對50ng~1ug的rna進行逆轉(zhuǎn)錄。qpcr使用quantifastsybrgreenpcr試劑盒(qiagen)。表達量以管家基因tata盒子(tbp)為標準參照,除此之外,基因組dna作為dna的參考標準?;蚪Mdna的靶基因拷貝數(shù)按照如下計算方式:人基因組大小2.7×109bp,對應于6.022×1023個單基因拷貝,1ug的基因組dna對應于3.4×105個單基因拷貝。rt-qpcr圖的y軸代表被tbp拷貝數(shù)分隔開的目的基因的拷貝數(shù),因此是一個隨機的獨立單位,可用于不同實驗組之間的對比。當前第1頁12當前第1頁12