專利名稱：食品和飼料中狐貍成分快速檢測試劑盒的制備和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行動物源性成分快速檢測的方法，具體是一種狐貍成分的實時熒光PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
全球經(jīng)濟(jì)一體化和貿(mào)易國際化的的不斷擴(kuò)大，對于發(fā)展中的中國，是機遇也是挑戰(zhàn)。近年來，我國對外貿(mào)易呈持續(xù)穩(wěn)定增長的態(tài)勢。數(shù)據(jù)顯示，自2009年起我國連續(xù)三年穩(wěn)居全球?qū)ν赓Q(mào)易第二大國的位置，出口量居世界首位，進(jìn)口量居世界第二位。如何加強監(jiān)督監(jiān)管，幫助指導(dǎo)企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量，克服美國、歐盟、日本等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)的技術(shù)壁壘，進(jìn)一步擴(kuò)大我國產(chǎn)品出口 ；同時嚴(yán)格入境監(jiān)管，防止國外的不合格產(chǎn)品流入我國，保護(hù)我國消費者利益，是檢驗檢疫等國家行政主管部門面臨的重要工作任務(wù)。就進(jìn)出口的食品和飼料而言，合格的產(chǎn)品，不僅要無毒無害，滿足安全衛(wèi)生要求；而且要無攙雜攙假，滿足品質(zhì)要求。其中品質(zhì)合格，又主要包含兩方面的含義:1.原料來源與標(biāo)簽一致。2.組分含量與標(biāo)簽一致。歐盟自2006年I月I日起開始實施新的食品衛(wèi)生法規(guī)，新法規(guī)突出了食品生產(chǎn)過程中的可追溯管理與食品的可追溯性，強調(diào)食品的身份鑒定標(biāo)識與健康標(biāo)識。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB7718-94《食品標(biāo)簽通用標(biāo)準(zhǔn)》和國家出入境檢驗檢疫局發(fā)布的《進(jìn)出口食品標(biāo)簽管理辦法》，也明確提出食品標(biāo)簽標(biāo)注內(nèi)容應(yīng)與食品相符。此外，為防止瘋牛病、癢病的傳播，，包括我國在內(nèi)的歐盟、美國等很多國家先后頒布多個法規(guī)，規(guī)定禁止在反芻動物飼料中使用、添加以哺乳類動物為原料的動物性飼料產(chǎn)品，以有效防止哺乳動物的病原體從動物傳染到別的動物和人類。在食品和飼料的生產(chǎn)與銷售中，產(chǎn)品無標(biāo)簽或標(biāo)簽不規(guī)范，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者謀取暴利的事件，國內(nèi)、國外均屢屢發(fā)生。各種原料被加工成食品和飼料成品后，已無法從外觀對其組成進(jìn)行鑒定。生產(chǎn)者受利益驅(qū)動，擅自改變產(chǎn)品組成，或摻入價廉的替代品，或直接減少原料用量，導(dǎo)致產(chǎn)品的真實屬性與標(biāo)簽不符。 這種造假行為不僅僅涉及經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)價值及宗教信仰問題，更可能直接影響著消費者健康。狐貍,哺乳動物，屬哺乳綱，食肉目，犬科(Canidae),狐亞科(Vulpini)。除包括狐屬(Vulpes)動物外，狐貍還包括狐亞科其它屬的動物:倭狐屬(Fennecus)、大耳狐屬(Otocyon)、南美狐屬(Dusicyon)、灰狐屬(Urocyon)、北極狐屬(Alopex)和和食蟹狐屬(Cerdo-cyon)。狐貍分布很廣,北美、歐洲、亞洲均有大量分布。其毛皮較珍貴，色澤艷麗，板質(zhì)柔韌，是制裘工業(yè)的高檔原料，號稱“軟黃金”，被譽為世界三大裘皮支柱之一，在國內(nèi)外市場上非常暢銷。作為一種重要的經(jīng)濟(jì)毛皮動物，狐貍養(yǎng)殖業(yè)十分發(fā)達(dá)，主要養(yǎng)殖品種包括:赤狐、藍(lán)狐和銀黑狐。狐貍養(yǎng)殖主要取其皮毛，狐肉有異味，故價格便宜，很少有人食用。近年來，狐貍?cè)饨?jīng)加工冒充狗肉、羊肉，甚至制成肉串、香腸流入市場的新聞時有報道。鑒于此，盡快建立可靠有效的狐貍成分檢測方法，對于確保食品和飼料標(biāo)簽真實準(zhǔn)確，加強食品和飼料標(biāo)識管理，改進(jìn)食品安全，保護(hù)消費者利益具有重要意義。食品和飼料中動物源性成分檢測，常采用DNA檢測的方法。以DNA為測試對象的方法與以蛋白為測試對象的方法相比，在成分復(fù)雜的情況下，目標(biāo)DNA可以有效提取，受基質(zhì)的影響較??；此外，DNA比較穩(wěn)定，不象蛋白質(zhì)組成那樣容易受到外界環(huán)境因素和加工工藝的影響。當(dāng)前，基于DNA的檢測方法中，實時熒光PCR法以其操作簡便、靈敏、特異、快速、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，得到研究者的普遍認(rèn)可，成為檢測的重要工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種狐貍成分快速檢測試劑盒的制備和檢測方法，克服基于蛋白的檢測方法在某些食品和飼料檢測中的局限性，為狐貍成分檢測提供有效工具，從而確保食品和飼料標(biāo)簽的一致性，保護(hù)消費者利益。本發(fā)明的主要原理為:針對保守序列設(shè)計一組特異性引物和一條特異性Taqman探針，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，最終建立待測樣品的實時熒光PCR檢測方法。進(jìn)行核酸檢測時，模板DNA經(jīng)加熱至94_95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模板特異性結(jié)合。探針的5端標(biāo)記有報告熒光集團(tuán)，3端有淬滅熒光集團(tuán)。當(dāng)探針完整的時候，報告集團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅集團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結(jié)合的探針時，其3' —5'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告集團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅集團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。隨著PCR循環(huán)的增加，目的片段成指數(shù)增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反映模板數(shù)量。本發(fā)明涉及的狐貍成分快速檢測試劑盒，其中的試劑包括如下:(I) 2 X PCRMasterMix包括0.05u/μ L Taq DNA聚合酶，反應(yīng)緩沖液,4mmol/L氯化鎂,0.4mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物);其中反應(yīng)緩沖液含有20mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀和2%曲拉通X-100 ； (2)上游引物:10ymol/L，序列為:5' -TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3'；⑶下游引物:10ymol/L，序列為:5'-GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3;；(4)丁&9!1^11探針:1(^11101/1，序列為:5/ -CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'，其 5'端標(biāo)記FAM報告熒光集團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光集團(tuán)。使用上述試劑盒檢測食品和飼料中狐貍成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3):(I)待檢樣品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。(2)狐貍成分的實時熒光PCR擴(kuò)增A.在反應(yīng)管中加入2XPCR Master Mixl2.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5-1 μ L，Taqman 探針 0.5-1 μ L，IOOng/ μ L 待測樣品的 DNA1-2 μ L，補充雙蒸水至 25 μ L，混勻；B.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增:94-95°C 5min, I 個循環(huán)，預(yù)變性；94-950C 10_20sec ；60°C 20_40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增時，應(yīng)設(shè)立三個對照:陽性對照(取狐貍?cè)馓崛〉幕蚪MDNA)、陰性對照(非狐貍基因組DNA)、空白對照(不含DNA模板，可以水代替)。(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果。如待測樣品出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，且Ct值小于或等于41，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立(即陽性樣品出現(xiàn)典型陽性擴(kuò)增曲線，陰性樣品和空白對照無擴(kuò)增)，則可判定該樣品檢出狐貍成分。如待測樣品未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，無Ct值，陰性對照、陽性對照和空白對照都成立，則可判定該樣品未檢出狐貍成分。如待測樣品Ct值在41-45之間，應(yīng)重作實時熒光PCR擴(kuò)增。再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立，則可判定該樣品檢出狐貍成分；再次擴(kuò)增后的結(jié)果為無擴(kuò)增曲線無Ct值，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果都成立，則可判定該樣品未檢出狐貍成分。線粒體DNA是動物體內(nèi)唯一存在核外遺傳信息載體，為共價閉合的雙鏈環(huán)狀分子，具有母系遺傳、進(jìn)化速度快、種屬特異性等特點。對同一個體的腎臟、心臟、肝臟、皮膚等不同組織的研究、比較表明，線粒體DNA的結(jié)構(gòu)沒有組織特異性。而且線粒體DNA拷貝數(shù)多，可達(dá)數(shù)千到上萬個，遠(yuǎn)高于核DNA，即使樣品經(jīng)過深度加工，核DNA降解嚴(yán)重或DNA含量極少時，仍可通過PCR擴(kuò)增檢出線粒體DNA，因此線粒體DNA基因序列被廣泛用于物種鑒定。細(xì)胞色素C氧化酶是由多個亞基組成的、在生物體代謝過程中起重要作用的復(fù)雜酶分子，其諸多亞基中最大最保守的亞基為細(xì)胞色素C氧化還原酶I亞單位，由線粒體DNA編碼。本發(fā)明根據(jù)狐貍線粒體細(xì)胞色素C氧化還原酶I亞單位基因序列，使用Biodet軟件和Primer Express3.0軟件進(jìn)行了序列分析和引物、探針設(shè)計。該基因序列通過對Genebank登錄的犬科其他動物核酸序列的比對獲得，并對設(shè)計出的引物和探針進(jìn)行了在線Blast比對查詢，可保證狐貍成分的檢出。本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)，該技術(shù)特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用于一些成分復(fù)雜的加工食品和飼料中狐貍成分的檢測。


圖1為用實時熒光PCR技術(shù)檢測某待測肉糜樣品DNA，樣品的擴(kuò)增圖譜；圖2為陰性對照(京巴犬DNA)的擴(kuò) 增圖譜；圖3為空白對照(水)的擴(kuò)增圖譜；圖4為陽性對照(狐貍DNA)擴(kuò)增圖譜。圖5為用實時熒光PCR技術(shù)檢測某待測飼料樣品DNA，樣品的擴(kuò)增圖譜；圖6為陰性對照(京巴犬DNA)的擴(kuò)增圖譜；圖7為空白對照(水)的擴(kuò)增圖譜；圖8為陽性對照(狐貍DNA)擴(kuò)增圖譜。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實施例1按下列配方制作狐貍成分的實時熒光PCR檢測試劑盒，其中的試劑包括如下:(I) 2 X PCR MasterMix包括0.05u/ μ L Taq DNA聚合酶，反應(yīng)緩沖液，4mmol/L氯化鎂,0.4mmol/LdNTP(dATP, dCTP, dGTP,dTTP)；
其中反應(yīng)緩沖液含有20mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀和2%曲拉通X-100 ；(2)上游引物:10ymol/L，序列為:5' -TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3'；(3)下游引物:10ymol/L，序列為:5' -GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3'；(4)丁&9!1^11探針:1(^11101/1，序列為:5/ -CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'，其 5'端標(biāo)記FAM報告熒光集團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光集團(tuán)。按照以下程序進(jìn)行檢測:(I)待測肉糜樣品DNA的提取A.稱取0.3g肉糜樣品，加至2mL離心管中。加入600 μ L預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液和40 μ L蛋白酶K，輕輕混勻后，65°C水浴保溫90min ；B.2000g離心5min，取上清于另一干凈的2mL離心管中，加入等體積的酚、三氯甲烷和異戊醇的混合液(25: 24: I)，震蕩混勻；C.12000g離心lOmin，取上清至干凈的2mL離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻；D.12000g離心lOmin，棄去上清液，用預(yù)熱至65°C的TE緩沖液溶解沉淀；E.加入 5 μ L RNA 酶溶液，37°C 30min ；F.加入200 μ L三氯甲烷:異戊醇(24: I)，強烈振蕩；

G.12000g離心lOmin，取上清至干凈的2mL離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻；H.12000g離心lOmin，棄去上清液，用4°C預(yù)冷的70 %乙醇500 μ L，渦旋清洗沉淀；1.12000g離心lOmin，棄去上清液，倒置晾干后加100 μ L TE緩沖液溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?(2)待測肉糜樣品DNA的實時熒光PCR擴(kuò)增A.在PCR反應(yīng)管中加入如權(quán)利要求1所述的2 XPCR Master Mixl2.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5 μ L，Taqman探針0.5 μ L，IOOng/ μ L待測樣品的DNAl μ L，補充雙蒸水至25 μ L，混勻；B.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增:95°C 2min, I個循環(huán)，預(yù)變性；950C 15sec ；60°C 40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴(kuò)增。(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果。樣品出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線，Ct值為17.8，陰性對照(京巴犬DNA)和空白對照(水)無擴(kuò)增，陽性對照(狐貍DNA)產(chǎn)生典型陽性擴(kuò)增曲線，見圖1、圖2、圖3、圖4，據(jù)此可判定該樣品檢出狐貍成分。實施例2按下列配方制作狐貍成分的實時熒光PCR檢測試劑盒，其中的試劑包括如下:(I) 2 X PCRMasterMix包括0.05u/yL Taq DNA 聚合酶 Polymerase,反應(yīng)緩沖液,4mmol/L 氯化鎂，0.4mmol/L dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)；
其中反應(yīng)緩沖液含有20mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀和2%曲拉通X-100 ；(2)上游引物:10ymol/L，序列為:5' -TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3'；(3)下游引物:10ymol/L，序列為:5' -GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3'；(4)丁&9!1^11探針:1(^11101/1，序列為:5/ -CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'，其 5'端標(biāo)記FAM報告熒光集團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光集團(tuán)。按照以下程序進(jìn)行檢測:(I)待測飼料樣品DNA的提取A.稱取0.3g飼料樣品，加至2mL離心管中，加至2mL離心管中。加入600 μ L預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液和40 μ L蛋白酶K，輕輕混勻后，65°C水浴保溫90min ；B.2000g離心5min，取上清于另一干凈的2mL離心管中，加入等體積的酚、三氯甲烷和異戊醇的混合液(25: 24: I)，震蕩混勻；C.12000g離心lOmin，取上清至干凈的2mL離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻；D.12000g離心lOmin，棄去上清液，用預(yù)熱至65°C的TE緩沖液溶解沉淀；E.加入 5 μ LRNA 酶溶液，37°C 30min ；
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F.加入200 μ L三氯甲烷:異戊醇(24: I)，強烈振蕩；G.12000g離心lOmin，取上清至干凈的2mL離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻；H.12000g離心lOmin，棄去上清液，用4°C預(yù)冷的70 %乙醇500 μ L，渦旋清洗沉淀；1.12000g離心lOmin，棄去上清液，倒置晾干后加100 μ LTE緩沖液溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆谩?2)待測飼料樣品DNA的實時熒光PCR擴(kuò)增A.在PCR反應(yīng)管中加入如權(quán)利要求1所述的2 XPCR Master Mixl2.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5 μ L，Taqman探針0.5 μ L，IOOng/ μ L待測樣品的DNAl μ L，補充雙蒸水至25 μ L，混勻；B.將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增:95°C 2min, I個循環(huán),預(yù)變性；950C 15sec ；60°C 40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴(kuò)增。(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果樣品未出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線，陰性對照(京巴犬DNA)和空白對照(水)無擴(kuò)增，陽性對照(狐貍DNA)產(chǎn)生典型陽性擴(kuò)增曲線，見圖5、圖6、圖7、圖8，據(jù)此可判定該樣品未檢出狐貍成分。
權(quán)利要求
1.一種狐貍成分快速檢測試劑盒，其特征在于其中的試劑包括(1)-(4):(1)2XPCRMaster Mix 包括0.05u/yL Taq DNA聚合酶，反應(yīng)緩沖液，4mmol/L氯化鎂，0.4mmol/L dNTP(dATP,dCTP, dGTP, dTTP)； 其中反應(yīng)緩沖液含有20mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀和2%曲拉通X-100 ； (2)上游引物:10ymol/L，序列為:5'-TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3'； (3)下游引物:10ymol/L，序列為:5'-GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3'； (4)Taqman 探針:10 μ mol/L,序列為:5' -CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'，其 5'端標(biāo)記FAM報告熒光集團(tuán)，3'端標(biāo)記TAMRA淬滅熒光集團(tuán)。
2.一種使用如權(quán)利要求1所述的試劑盒快速檢測狐貍成分的方法，其特征是依次包括下列步驟: (1)待檢樣品DNA的提取； (2)狐貍成分的實時熒光PCR擴(kuò)增: A.在PCR反應(yīng)管中 加入如權(quán)利要求1所述的2XPCRMaster Mixl2.5 μ tL，上游引物和下游引物各0.5-1 μ L，Taqman探針0.5-1 μ L，lOOng/μ L待測樣品的DNA1-2 μ L，補充雙蒸水至25 μ L,混勻； B.將PCR反應(yīng)管放入熒光PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增: 94-950C 5min, I個循環(huán)，預(yù)變性； 94-950C 10-20sec ；60°C 20_40sec，45 個循環(huán)，PCR 擴(kuò)增； (3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴(kuò)增結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品和飼料中動物源性成分的定性檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測食品和飼料中狐貍成分的試劑盒及方法。試劑盒包括2×PCRMaster Mix、上游引物、下游引物、Taqman探針；其中2×PCR Master Mix中含有Taq DNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液、氯化鎂、dNTP，上游引物序列為5′-TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3′、下游引物序列為5′-GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3′、TaqMan探針序列為5′-FAM-CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-TRAMA-3′；狐貍成分的快速檢測方法包括食品和飼料DNA的提取、狐貍成分的實時熒光PCR擴(kuò)增和結(jié)果判定。其優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好。
文檔編號G01N21/64GK103088116SQ20121040853
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月14日
發(fā)明者孫敏, 高宏偉, 劉彩霞, 龔方 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心