專利名稱：冷激蛋白csp一步法金標(biāo)快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及冷激蛋白CSP —步法金標(biāo)快速檢測試劑盒。
技術(shù)背景微生物細(xì)胞在極端條件下，如寒冷、干旱等環(huán)境中會產(chǎn)生冷激反應(yīng)，并形成一 種特殊的蛋白——冷激蛋白(CSP)。冷激蛋白在轉(zhuǎn)錄與翻譯過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。 作為一種分子伴侶與單鏈核酸非特異性結(jié)合，具有穩(wěn)定單鏈核苷酸二級結(jié)構(gòu)的作用，使 細(xì)胞在極端環(huán)境下存活下來。將微生物中的冷激蛋白基因(csp)轉(zhuǎn)入植物，可以快速獲 得具有抗逆性狀的轉(zhuǎn)基因植物。CSP蛋白編碼的冷激蛋白csp基因克隆自一株環(huán)境脅迫 抗性極強(qiáng)的極端微生物Deinococcus gobiensis 1-0,目前，冷激蛋白CSP編碼基因已應(yīng)用 于多種轉(zhuǎn)基因植物的研究。在轉(zhuǎn)基因植物的研制開發(fā)或在對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行篩選或安全性評價時，往往需 要對轉(zhuǎn)入的外源性基因進(jìn)行定性或半定量測定?，F(xiàn)有的檢測裝置，如酶免、放免等方法的裝置，受儀器(酶標(biāo)儀、放免閃爍 儀、離心機(jī)等)、場地等因素的限制，而且檢測時間長(酶免檢測時間需20hr、放免檢測 需30min lhr)，檢測成本較高，很難推廣應(yīng)用。因此，實踐中需要有一種可快速檢測 轉(zhuǎn)基因植物中冷激蛋白CSP，且操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速的裝置
實用新型內(nèi)容
本實用新型的目的是建立一種操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速檢測轉(zhuǎn)基因成分 (CSP蛋白)的免疫檢測試劑盒。本實用新型解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種冷激蛋白CSP —步法金標(biāo)快速檢測試劑盒，包括盒體、測試帶和上蓋，盒 體蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述上蓋設(shè)置有一個觀測窗和一個加樣孔，所述 觀測窗是長方形，試劑盒的形狀是長方形。所述盒體的深度不限，其上表面可以設(shè)置一條可以嵌入所述測試帶的凹槽。所述盒體或上蓋可具有卡槽，以保證盒體與上蓋扣緊。所述觀測窗優(yōu)選是長方形，觀測窗分為測試區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)兩部分，可在 上蓋上用字母C、T標(biāo)示出。所述測試帶形狀為長方形片狀，用于檢測冷激蛋白CSP。所述測試帶是一種具有檢測系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系功能的檢測材料，由高分子纖 維膜、塑料等多層材料制成。測試帶分為質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)，質(zhì)控區(qū)可包被羊抗鼠IgG或 兔抗鼠IgG多克隆抗體；冷激蛋白CSP測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功能性CSP單克隆 抗體或多克隆抗體。通過免疫反應(yīng)可檢測樣品中是否含有該蛋白來確定該基因是否存在。當(dāng)外源 基因轉(zhuǎn)入植物，并在植物中表達(dá)后，將產(chǎn)生目的蛋白(CSP)，其樣品檢測呈陽性，如果外源基因轉(zhuǎn)入植物，發(fā)生基因沉默，無目的蛋白產(chǎn)生，將不能達(dá)到預(yù)期目的(冷激蛋白 CSP)。本實用新型的目的是這樣實現(xiàn)的當(dāng)盒體蓋入上蓋后，觀測窗和加樣孔對應(yīng)測 試帶，通過盒蓋上的加樣孔和觀測窗可進(jìn)行加樣和觀察檢測結(jié)果。觀測窗分為測試區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)兩部分，可在上蓋上用字母C、T標(biāo)示出；檢測時，將送檢物品的提取液滴加在試劑盒的加樣孔中，3-5分鐘后，通過肉眼 就可以通過上蓋的觀測窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。對于每個觀測窗來說，用以下方式判斷檢測結(jié)果1、陰性(-)反應(yīng)狀況觀測窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。檢測結(jié)果待檢樣品中不含待檢基因或其含量在其閾值以下。2、陽性(+)反應(yīng)狀況觀測窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)(T)內(nèi)同時出現(xiàn) 紫紅色條帶。檢測結(jié)果待檢基因含量在閾值以上。3、無效反應(yīng)狀況質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測結(jié)果表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。本實用新型所述試劑盒的優(yōu)點在于經(jīng)濟(jì)高效使用成本低廉，保存方便；簡便快速檢測轉(zhuǎn)基因成份一步法操作，不需任何附加設(shè)備。直接將待測樣品 液滴加在加樣孔中，3-5分鐘可出結(jié)果；結(jié)果直觀不借助任何儀器對抗原進(jìn)行檢測，用肉眼可觀察到結(jié)果；準(zhǔn)確可靠靈敏度高、特異性強(qiáng)；應(yīng)用廣泛可檢測玉米、棉花、煙草、油菜等各類農(nóng)作物的葉片、種子及加工
產(chǎn)品 ο由于本實用新型提供的試劑盒可對植物樣品進(jìn)行CSP分析，檢測快速、特異、 敏感、方便，特別適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研制開發(fā)和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速篩選，可用于實驗 室、田間、邊防、海關(guān)植物檢驗、檢驗檢疫局、食品安全檢測及種子經(jīng)營銷售等部門對 可疑樣本現(xiàn)場、快速篩查。

圖1和圖2是本實用新型一種試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖1是盒體的俯視圖， 圖2是試劑盒上蓋的俯視圖；圖中1是加樣孔，2是觀測窗，3是測試帶，C是質(zhì)控區(qū)，T是檢測區(qū)。
具體實施方式
本實用新型試劑盒中的測試帶的制備說明實施例1制備測試帶1.冷激蛋白CSP單抗腹水的制備[0038]小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL。1周后，將冷激蛋白CSP單抗雜交瘤細(xì)胞注射 于以上預(yù)先處理過的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞1 3X106。10天后 收獲腹水，以上過程皆在無菌條件下完成。2.冷激蛋白CSP單克隆抗體的純化1)以DEAE離子交換層析及Sephacryl S-300分子篩對單抗進(jìn)行純化； SDS-PAGE平板電泳檢測純化單抗的純度；ELISA法測定單抗活性；2)純化過程取小鼠單抗腹水一3,000 Xg離心15分鐘一上清液加50%硫酸銨 沉淀，過夜一3,000 Xg離心20分鐘一沉淀溶于0.0IM磷酸鹽緩沖液(pH 7.2) — S-300凝 膠柱一DEAE Blue層析柱一0-800mMNaCl梯度洗脫一超濾離心，濃縮單抗；3)單抗純度測定常規(guī)SDS-PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在 95%以上；4)蛋白濃度測定紫外分光光度計測定279nm處的OD值，按以下公式計算蛋 白含量OD279/1.4 = mg/mL(純化單抗)。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約lmg/mL ；5)單抗活性測定選用冷激蛋白CSP抗原包被ELISA板(1 μ g/孔)，及羊抗鼠 IgG-HRP復(fù)合物，測定各單抗效價(大于1 5000)。3.羊抗DOAt高效價免疫抗血清的制備和純化1)純化好的上述單抗+完全佐劑一免疫山羊一加強(qiáng)免疫二次，每次間隔一月一 第二次加強(qiáng)后10天左右取血一離心取血清一硫酸銨沉淀一DEAE離子交換層析純化；2)效價測定ELISA夾心法，抗體效價稀釋度應(yīng)大于1 256;3)蛋白濃度測定紫外分光法測定OD279，計算蛋白濃度。4.膠體金及金標(biāo)抗體制備1)膠體金的制備以檸檬酸鹽還原法制備40-60nm的膠體金。將0.01 ^HauCl4 加熱至沸，加入一定量的檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 ·2Η20)，繼續(xù)加熱煮沸5分鐘，待 膠體金溶液顏色由蘭一紫一紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長期 保存，可加入0.02% NaN3O2)將膠體金液500mL用0.1M NaOH調(diào)pH8.4，磁力攪拌下緩慢加入單抗2mL， 攪拌20分鐘。5,500Xg離心30Min，除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體金 標(biāo)記抗體沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用0.45 μ m微孔濾膜過濾。取樣進(jìn)行檢定， 其余置4°C保存。5.膜反應(yīng)體系Ml的制備1)將冷激蛋白CSP抗體及純化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度 為約 0.2-2mg/mL。2)純化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸鹽緩沖液中，濃度為2.0mg/mL ；3)硝酸纖維素膜大小10cmX27cm，每張膜可噴長25cm的檢測及控制帶各4 條；4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機(jī)的二個噴頭儲存瓶中；5)設(shè)置噴速為2 μ L/cm，NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗CPSAD2 (2mg/ mL)在NC膜上包被反應(yīng)檢測線，以l.Omg/mL兔抗鼠IgG包被反應(yīng)對照線，對照線與檢 測線的距離為4-4.5mm;[0058]6)完成包被后，置37°C干燥箱24小時，用BB封閉液封閉處理半小時，用WB 洗液抽洗一次；7) 37 °C干燥箱干燥備用；8)切制備好的硝酸纖維素膜1.8CmX27Cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。
置室溫保存?zhèn)溆谩?.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑
料袋中，室溫保存。l)M2a制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1.2cm/條；2)M2b制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1.8cm/條；3)M3制備將制好的玻璃纖維切27cmX 1.2cm/條。7.膜反應(yīng)體系M4的制備1)取膠體金-單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；2)將溶液加入噴涂機(jī)Biodot的Airjet噴頭儲存瓶中；3)設(shè)定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動速度為50mm/s ；4)噴制規(guī)格為0.5-1.5cmX 25cm/條，每條噴2遍；5)于37°C烘干12小時，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。8.反應(yīng)體組裝1)在M6塑料基板上貼雙面膠帶M7 二條；2)在M7中間貼反應(yīng)膜Ml (18mm)，離M6上緣約22mm ；3)在M7上貼M5 (22mm)，與M6上緣對齊并與Ml上緣交Imm ；4)在M7上貼M2a(12mm)，與Ml下緣相接；5)在 M2 上貼 M4 (IOmm)，壓住 Ml 下緣 0.5mm ；6)在 M7 上貼 M3 (12mm)，上緣壓住 M4 約 2/3 ；7)在M7上貼M2b (18mm)，上緣壓住M4約2/3，下緣與M7的下緣對齊；8)在M4和M7上貼透明保護(hù)膠帶M8，上緣完全壓住M4，并壓住Ml約 1.5mm ；9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9，與Ml上緣交1mm，另一端翻過M6上緣，貼 于M6背面；10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動切條機(jī)切成3.5_規(guī)格。實施例2試劑盒裝配將制備好的檢測冷激蛋白CSP的測試帶3嵌入圖1盒體的凹槽中，然后將上蓋與 盒體扣緊，即成試劑盒。將試劑盒、滴管和使用說明書裝塑料袋封裝后，即可。實施例3試劑盒使用過程1.檢測樣本處理及準(zhǔn)備植物種子、葉子、籽苗等樣本在檢測前需經(jīng)研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋。為 獲得最佳檢測效果，各不同樣品應(yīng)根據(jù)下表中的比例稀釋，在完成研磨和稀釋后，將樣 本混勻，靜置，取上清液作為檢測樣品。
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植物種類葉子及籽苗種子葉子/蒸餾水(g/mL )種子/蒸餾水(g/mL )煙草1 201 2玉米1 101 4其余雙子葉植物1 101 4其余單子葉植物1 201 22.檢測及結(jié)果將檢測盒平放，用所配塑料吸管吸取樣品液，滴加4-5滴于檢測盒的加樣孔 中，吸水材料使待檢樣品緩慢移動，膜反應(yīng)體系被啟動。無論待測基因是否存在于植物 樣品中，一條紫紅色條帶都會出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶 是判定是否有足夠的植物樣品液，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時也作為試劑的內(nèi)控標(biāo) 準(zhǔn)。3.結(jié)果判定觀測窗檢測待檢基因是否存在。1)如若待測植物樣本中不含特定冷激蛋白CSP，或其濃度低于檢測靈敏度，膠 體金抗體在層析過程中不會被固定在膜上檢測帶內(nèi)的單抗免疫，因而測試區(qū)內(nèi)(T)不會 出現(xiàn)一條紫紅色檢測帶，顯示陰性(-)結(jié)果，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。2)如若待植物樣本中冷激蛋白CSP濃度高于其檢測閾值時，抗原免疫金與檢測 帶上的另一單抗結(jié)合，在測試區(qū)內(nèi)(T)還將出現(xiàn)另一紫紅色檢測帶，顯示陽性(+)結(jié)果， 即在質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)內(nèi)各出現(xiàn)一條紫紅色條帶。注意測試區(qū)(T)內(nèi)的紫紅色 條帶可顯現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定的觀察時間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，都 應(yīng)判定為陽性結(jié)果。3)如若試劑盒質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，則檢測結(jié)果無效，表明不正確的 操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。
權(quán)利要求1.一種冷激蛋白CSP —步法金標(biāo)快速檢測試劑盒，包括盒體、測試帶和上蓋，盒體 蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述測試帶置于所述盒體內(nèi)表面，所述上蓋設(shè)置有 一個觀測窗和一個加樣孔；所述觀測窗是長方形，試劑盒的形狀為長方形。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷激蛋白CSP—步法金標(biāo)快速檢測試劑盒，其特征在于所 述盒體內(nèi)表面設(shè)置有可以嵌入所述測試帶的凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的冷激蛋白CSP—步法金標(biāo)快速檢測試劑盒，其特征在 于所述盒體或上蓋具有卡槽。
專利摘要一種冷激蛋白CSP一步法金標(biāo)快速檢測試劑盒，包括盒體、測試帶和上蓋，盒體蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于所述測試帶置于所述盒體內(nèi)表面，所述上蓋設(shè)置有一個觀測窗和一個加樣孔。本試劑盒可為快速檢測植物種子、葉片及加工產(chǎn)品中是否含有冷激蛋白CSP基因成份提供直接證據(jù)，不需其它任何附加儀器設(shè)備。本試劑盒操作簡便、檢測結(jié)果形象、準(zhǔn)確、快速只要將送檢物品的提取液滴加在試劑盒的加樣孔中，3-5分鐘后，不借助任何儀器就可從觀測窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。
文檔編號G01N1/34GK201796037SQ20102010724
公開日2011年4月13日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者劉奇, 張維, 林敏 , 鄭建, 陳明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所