本發(fā)明涉及化合物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針及其合成方法以及所述熒光探針在檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

碳青霉烯類抗生素是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，是由β-內(nèi)酰胺環(huán)并五元環(huán)組成抗生素母核，其四元環(huán)上的取代基為反式結(jié)構(gòu)。碳青霉烯類抗生素與其它類的β-內(nèi)酰胺抗生素的構(gòu)型相反，主要包括亞胺培南、美羅培南、多利培南及厄他培南等。因碳青霉烯類抗生素?fù)碛袕V泛的抗菌活性且具有強(qiáng)烈抑制或殺滅不同類型細(xì)菌的能力(J.Antimicrob.Agents.1999,11,93；Antimicrob.Agents Chemother.2011,55,4943)，使該類抗生素成為治療細(xì)菌性嚴(yán)重感染的最后一道防線(Emerg.Infect.Dis.2011,17,1791-1798)。碳青霉烯類抗生素對(duì)革蘭氏陰性與陽(yáng)性菌引起的感染具有很好的療效，對(duì)含有青霉素酶、頭孢菌素酶的耐藥菌亦具有很好的療效。但是，隨著此類抗生素的廣泛使用，近年來(lái)在世界范圍內(nèi)逐漸出現(xiàn)了對(duì)之具有耐藥性的細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)，致病細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因很多，如β-內(nèi)酰胺抗生素的靶標(biāo)青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生了突變；另一個(gè)主要原因是細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生了一種叫β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)的抗生素滅活酶，這種酶能迅速水解常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺鍵，使抗生素失去藥效。這類能使青霉烯類抗生素失效的β-內(nèi)酰胺酶被稱為碳青霉烯酶(carbapenemase)。所述碳青霉烯酶一般能水解碳青霉烯抗生素甚至幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素，使之對(duì)碳青霉烯抗生素(亞胺培南、美羅培南等)的敏感性降低，治療效果變差。

按Ambler分類法，所述β-內(nèi)酰胺酶(碳青霉烯酶)可分為A、B、C、D四個(gè)類型(Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1980；289:321–31)，其中A、C、D三個(gè)類型為含有絲氨酸的β-內(nèi)酰胺酶；B類為含有金屬鋅離子的β-內(nèi)酰胺酶。所述A類β-內(nèi)酰胺酶包括KPC、GES類型的β-內(nèi)酰胺酶等，能夠在許多致病菌里檢測(cè)到，例如腸桿菌屬、粘質(zhì)沙雷氏菌、克雷伯菌屬等等。早在1996年，美國(guó)就從北卡羅來(lái)納州一臨床病例中分離出了含KPC酶的克雷伯菌，研究發(fā)現(xiàn)，這一菌株能夠耐所有抗生素藥。之后，在新德里的醫(yī)療機(jī)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了屬于B類β-內(nèi)酰胺酶的新德里含金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)，這些酶的活性中心鋅離子能與酰胺鍵結(jié)合，使抗生素水解失去藥效。所述新德里含金屬β-內(nèi)酰胺酶的致病菌又被稱為“超級(jí)細(xì)菌”，這類“超級(jí)細(xì)菌”在被發(fā)現(xiàn)后曾很快通過(guò)病人和游客向世界各地傳播，引起世界范圍內(nèi)的擔(dān)憂。在中國(guó)，2005～2014年間對(duì)碳青霉烯抗生素具有耐藥性的克雷伯肺炎菌的比例由2.4％上升為13.4％(Clin Microbiol Infect 2016；22:S9–S14)。

目前，檢測(cè)有碳青霉烯酶表達(dá)的細(xì)菌的方法主要有三種：表型檢測(cè)法、基因檢測(cè)法和基于碳青霉烯酶的檢測(cè)法。所述表型檢測(cè)法通常是通過(guò)測(cè)定細(xì)菌對(duì)碳青霉烯抗生素的敏感性來(lái)檢測(cè)的，它又包括瓊脂擴(kuò)散測(cè)試法、最小抑菌濃度測(cè)定(MIC)法、雙紙片協(xié)同測(cè)試法(DDST)、修飾的霍奇檢測(cè)法(MHT)等。美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所基于這些方法制定了標(biāo)準(zhǔn)的抗生素藥敏試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)致病菌的藥敏性，它在一定程度上反映了細(xì)菌的耐藥性，也給細(xì)菌性嚴(yán)重感染病人的治療帶來(lái)極大的幫助。但是，這些方法缺乏良好的專一性和靈敏性，且檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，通常需要24～48小時(shí)，此外，這類方法無(wú)法及時(shí)提供選擇抗生素的必要信息。所述基因檢測(cè)法主要是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(rt qRT-PCR)能檢測(cè)碳青霉烯酶編碼基因的mRNA表達(dá)。所述基因檢測(cè)法具有很高的精確性和靈敏度，但是，它使用的儀器昂貴、花費(fèi)高且不能檢測(cè)到新的碳青霉烯酶基因。所述基于碳青霉烯酶的檢測(cè)法，它通過(guò)檢測(cè)碳青霉烯酶的活性能提供細(xì)菌抗生素耐力的重要信息。通過(guò)比色原理用頭孢硝基噻吩(Nitrocefin)能成功地檢測(cè)碳青霉烯酶，其檢測(cè)原理為：頭孢硝基噻吩的β-內(nèi)酰胺環(huán)能被β-內(nèi)酰胺酶快速水解而開(kāi)環(huán)，由于底物分子共軛結(jié)構(gòu)的變化從而使其顏色由黃色變成紅色，通過(guò)顏色的變化來(lái)檢測(cè)其耐藥菌，操作簡(jiǎn)單，使用方便，但是，由于顏色變化比較緩慢、靈敏度不高等原因在很大程度制約了該檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用。

近年來(lái)，熒光探針受到了人們廣泛的關(guān)注。所述熒光探針具有背景信號(hào)低、靈敏度高、儀器成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用廣受關(guān)注，目前，已有較多的熒光探針化合物應(yīng)用于高靈敏度和實(shí)時(shí)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。1998年，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者錢永健教授在《科學(xué)》雜志上撰文(Science 1998,279,84-88)，首次報(bào)道了基于β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的分子熒光探針，利用熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)機(jī)理，用于監(jiān)測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的活性。之后，陸陸續(xù)續(xù)報(bào)道了一些檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶活性的熒光探針化合物。但是，這些熒光探針化合物是基于頭孢菌素母核設(shè)計(jì)的，它們不能區(qū)分普通β-內(nèi)酰胺酶和碳青烯酶。國(guó)際專利申請(qǐng)WO2012/003955A1公開(kāi)了一種“基于碳青霉烯母核結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的具有一定熒光性能的碳青霉烯酶熒光探針”，但該專利申請(qǐng)所述的熒光探針沒(méi)有說(shuō)明具體的光學(xué)性質(zhì)，沒(méi)有引入典型的熒光報(bào)告基團(tuán)，故而其檢測(cè)性能是不清楚的。2014年，Rao等人報(bào)道了用于檢測(cè)對(duì)碳青霉烯具有耐藥性的腸科桿菌的熒光探針(Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,8113–8116)，所述熒光探針是基于常見(jiàn)的頭孢菌素母核設(shè)計(jì)的，它通過(guò)結(jié)構(gòu)調(diào)整，引入香豆素作為熒光報(bào)告基團(tuán)后，將6,7-位的構(gòu)象由順式轉(zhuǎn)變?yōu)榉词綐?gòu)象，合成一系列的熒光探針化合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)β-碳青霉烯酶及表達(dá)有碳青霉烯酶細(xì)菌的選擇性檢測(cè)，但是，其不同的熒光探針對(duì)不同的碳青霉烯酶的選擇性和檢測(cè)靈敏度有很大的不同。此外，華東理工大學(xué)在2016年的一項(xiàng)專利申請(qǐng)也提出了一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，所述熒光探針以碳青霉烯抗生素的母核結(jié)構(gòu)為酶特異性識(shí)別基團(tuán)，在碳青霉烯抗生素母核的3'-位引入具有離去功能的染料，在碳青霉烯酶的作用下使β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)碳青霉烯酶的選擇性檢測(cè)。但是，這一熒光探針主要是基于香豆素為報(bào)告基團(tuán)(fluorophore)的，其激發(fā)光位于紫外區(qū)域，發(fā)色光位于藍(lán)色光區(qū)域，易于被病菌樣本可能存在的自身熒光信號(hào)所干擾，從而降低熒光探針檢測(cè)的靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一類耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，它們是基于青霉烯類抗生素設(shè)計(jì)的用于檢測(cè)產(chǎn)生碳青霉烯酶致病菌的熒光探針，具有高靈敏度、高選擇性、且使用費(fèi)用低。本發(fā)明的第二目的是，提供所述熒光探針的合成方法。本發(fā)明的第三目的是，提供所述熒光探針在檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌中的具體應(yīng)用方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。

一類耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的結(jié)構(gòu)通式為：

式中：

X為碳原子或硫原子；當(dāng)X為CH時(shí)，R¹為甲基，能夠?yàn)镽或S構(gòu)型；或者X為CH₂或S；

染料(dye)為氟硼二吡咯(BODIPY)、萘酰亞胺、香豆素、熒光素或羅丹明的任意一種。

進(jìn)一步，所述氟硼二吡咯(BODIPY)的通式結(jié)構(gòu)為：

式中：

R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶獨(dú)自選自氫、甲基、乙基；

R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹獨(dú)自選自氫、甲基、乙基、鹵素、烷氧基、羥基、羧基、磺酸基、氰基、醛基、酯基或聚乙二醇基，其中的含酸基團(tuán)(如羧基、磺酸基)，包括其鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽類。

進(jìn)一步，含有氟硼二吡咯(BODIPY)通式結(jié)構(gòu)中熒光探針的優(yōu)先結(jié)構(gòu)(CVB-1)為：

進(jìn)一步，所述優(yōu)先熒光探針能與生物標(biāo)記物碳青霉烯酶選擇性識(shí)別，從而起到檢測(cè)碳青霉烯酶的作用。

進(jìn)一步，所述萘酰亞胺的通式結(jié)構(gòu)為：

式中：

R選自1至6碳的烷基、飽和羧基、飽和酯基或聚乙二醇基。

一類耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針是在培南類(penem)抗生素母核的3-位引入雙鍵后，再與BODIPY(氟硼二吡咯)的2-位相連得到熒光探針，在碳青霉烯酶(carbapenemase)的作用下使β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)，使整個(gè)熒光探針發(fā)生一定的結(jié)構(gòu)變化，從而產(chǎn)生光學(xué)性質(zhì)的變化，使所述熒光探針具有用于檢測(cè)青霉烯酶及其耐藥菌的性質(zhì)，其檢測(cè)原理表示為：

為實(shí)現(xiàn)上述第二目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)化合物3的制備

將將化合物1、化合物2置于反應(yīng)瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)及三乙胺(TEA)，將所得混合物經(jīng)冷凍-真空-溶解三個(gè)循環(huán)脫氣后，加入醋酸鈀(PdOAc₂)和三(鄰甲基苯基)膦(P(o-Tol)₃，再脫氣兩次；

將反應(yīng)體系在氮?dú)夥諊?0℃反應(yīng)16小時(shí)，冷卻后，加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng)體系，將乙酸乙酯相用水洗，再用飽和食鹽水洗，用無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮；

將所得混合物用石油醚與乙酸乙酯作為流動(dòng)相經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到化合物3；

(2)化合物4的制備

將步驟(1)得到的化合物3溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)與N,N-二甲基甲酰胺的混合液中，N-甲基吡咯烷酮與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:3；

加入二氟化氫銨(NH₄·HF₂)，在室溫下反應(yīng)；

反應(yīng)結(jié)束后加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng)體系，將乙酸乙酯相用水洗，再用飽和食鹽水洗，用無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮；

將所得混合物用石油醚與乙酸乙酯作為流動(dòng)相經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到化合物4；

(3)熒光探針(CVB-1)的制備

將步驟(2)得到的化合物4溶解于四氫呋喃(THF)中，加入pH為6.0的0.35M磷酸鹽緩沖液(PB)以及活化鋅粉(Zn)，在20℃下反應(yīng)1小時(shí)；

將反應(yīng)液過(guò)濾，用色譜乙腈洗滌，用反相C18制備柱純化，冷凍干燥，得到黑紫色的化合物，即所述的熒光探針(CVB-1)；

所述熒光探針(CVB-1)的合成路徑為：

(該合成路徑的主要特征在于：將化合物1通過(guò)與碘、溴或三氟甲磺酸酯取代的染料〈以碘取代的氟硼二吡咯2為例〉通過(guò)Heck偶聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)母核與熒光報(bào)告基團(tuán)的共軛偶聯(lián)；再經(jīng)過(guò)兩步脫保護(hù)，得到優(yōu)選熒光探針CVB-1)。

進(jìn)一步，所述化合物1為關(guān)鍵中間體，以此為衍生物能夠合成其他的熒光探針化合物。

為實(shí)現(xiàn)上述第三目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。

將所述耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針制成試紙、試劑盒或者檢測(cè)芯片在檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述應(yīng)用包括以下步驟：

(1)將耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針與待測(cè)樣品在一定條件下混合，形成具有光學(xué)性質(zhì)的化合物；

(2)測(cè)量具有光學(xué)性質(zhì)的化合物的光學(xué)信號(hào)變化，包括熒光、紫外吸收或顏色的變化，從而確定待測(cè)樣品中碳青霉烯酶或者含有碳青霉烯耐藥菌的含量或濃度。

本發(fā)明的積極效果：

(1)本發(fā)明對(duì)原有的碳青霉烯酶熒光探針重新進(jìn)行了設(shè)計(jì)，利用自己研究的熒光增強(qiáng)機(jī)理，克服了原先研究的熒光探針的缺點(diǎn)，發(fā)展了新的、檢測(cè)靈敏度更高、檢測(cè)范圍更廣的熒光探針。

(2)基于碳青霉烯抗生素為母核，保證了熒光探針對(duì)碳青霉烯酶的專一性響應(yīng)，對(duì)非碳青霉烯酶不產(chǎn)生響應(yīng)。

(3)本發(fā)明的熒光探針(CVB-1)是在3-位引入與母核共軛的氟硼二吡咯作為熒光報(bào)告基團(tuán)，在碳青霉烯酶水解觸發(fā)后，經(jīng)自動(dòng)結(jié)構(gòu)變化后產(chǎn)生熒光響應(yīng)。

(4)以氟硼二吡咯作為熒光報(bào)告基團(tuán)，其激發(fā)波長(zhǎng)為503nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)在512nm，激發(fā)發(fā)射光波長(zhǎng)且在綠色光范圍內(nèi)，能大大提高對(duì)碳青霉烯酶、耐藥致病菌或包含有前兩者的血樣、尿樣的檢測(cè)的靈敏度。

(5)熒光探針(CVB-1)在碳青霉烯酶的作用下不僅能產(chǎn)生熒光變化，還能發(fā)生顏色變化，因此，可通過(guò)顏色變化來(lái)檢測(cè)樣品，不需要借助儀器，使其應(yīng)用更簡(jiǎn)單方便。

(6)本發(fā)明提供的熒光探針可應(yīng)用于臨床耐藥菌檢測(cè)，可快速檢測(cè)有碳青霉烯酶表達(dá)的細(xì)菌及其耐藥菌并具有高選擇性、高精確性和高靈敏度，且使用費(fèi)用低、簡(jiǎn)便易行，對(duì)在醫(yī)療中不用或者少用抗生素藥物具有非常重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法的流程框圖。

圖2為應(yīng)用實(shí)施例1熒光探針在碳青霉烯酶IMP-1下吸收光譜變化圖。

圖3為應(yīng)用實(shí)施例1熒光探針(100μM)在有碳青霉烯酶IMP-1(100nM)與無(wú)碳青霉烯酶IMP-1(0nM)情況下的顏色變化。

圖4為應(yīng)用實(shí)施例1熒光探針在一定濃度的碳青霉烯酶下隨時(shí)間的熒光光譜變化圖。

圖5為應(yīng)用實(shí)施例2不同β-內(nèi)酰胺酶與熒光探針混合培養(yǎng)1小時(shí)的熒光變化圖。

圖6為應(yīng)用實(shí)施例3含不同重組β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌與熒光探針混合培養(yǎng)2小時(shí)的熒光變化圖。

圖7為應(yīng)用實(shí)施例3含不同臨床耐藥菌及野生大腸桿菌酶與熒光探針混合培養(yǎng)2小時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖具體介紹本發(fā)明的具體實(shí)施方式和相關(guān)檢測(cè)效果。但是需要指出，本發(fā)明的實(shí)施不限于以下的實(shí)施方式，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常是按照常規(guī)條件或者是按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

本發(fā)明的耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，是在培南類(penem)抗生素母核的3-位引入雙鍵后再與氟硼二吡咯的2-位相連得到熒光探針，在碳青霉烯酶(carbapenemase)的作用下使β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)，使整個(gè)熒光探針發(fā)生一定的結(jié)構(gòu)變化，從而產(chǎn)生光學(xué)性質(zhì)的變化，使所述熒光探針具有用于檢測(cè)青霉烯酶及其耐藥菌的性質(zhì)，其結(jié)構(gòu)通式的表示為：

式中：

X為碳原子或硫原子；當(dāng)X為CH時(shí)，R¹為甲基，能夠?yàn)镽或S構(gòu)型；或者X為CH₂或S；

R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶獨(dú)自選自氫、甲基、乙基，其中，R^2-5優(yōu)選為甲基，R⁶優(yōu)選為氫；

R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰和R¹¹獨(dú)自選自氫、甲基、乙基、鹵素、烷氧基、羥基、羧基、磺酸基、氰基、醛基、酯基或聚乙二醇基，其中，R^7-11優(yōu)選為氫；其中的含酸基團(tuán)(如羧基、磺酸基)包括其鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽類。

以下介紹本發(fā)明耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法的具體實(shí)施方式。說(shuō)明：在本發(fā)明的實(shí)施中，¹H-NMR用Bruker 400Mz型儀器測(cè)定，測(cè)定溶劑為氘代三氯甲烷(CDCl₃),內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(TMS)；所有溶劑均為色譜純、分析純或化學(xué)純，所使用的無(wú)水溶劑均是按標(biāo)準(zhǔn)方法干燥處理獲得的。產(chǎn)品的純化除另有說(shuō)明以外均使用硅膠柱色譜法，所使用的硅膠為200～300目。

實(shí)施例1(參見(jiàn)圖1)

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物3的制備方法為：

將化合物1〔0.39mmol(毫摩爾),189mg(毫克)〕、化合物2(0.3mmol,135mg)置于反應(yīng)瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺1.2mL以及三乙胺0.3mL；將所得混合物經(jīng)過(guò)冷凍-真-溶解三個(gè)循環(huán)脫氣后，加入醋酸鈀0.03mmol(6.7mg)和三(鄰甲基苯基)膦0.045mmol(13.7mg)，再脫氣兩次。

將反應(yīng)體系在氮?dú)夥諊?0℃反應(yīng)16h，冷卻后加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng)體系，將乙酸乙酯相用水洗，再用飽和食鹽水洗，用無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮。

將所得混合物用石油醚與乙酸乙酯作為流動(dòng)相經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到化合物3(57mg)產(chǎn)率為24％。

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

譜圖特征為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.20(d,J＝8.7Hz,2H),7.66(d,J＝8.7Hz,2H),7.49(m,4H),7.30–7.27(m,2H),6.71(d,J＝16.7Hz,1H),6.04(s,1H),5.44(d,J＝14.0Hz,1H),5.25(d,J＝14.0Hz,1H),4.31–4.24(m,1H),4.22(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),3.54–3.44(m,H),3.24(dd,J＝5.5,2.6Hz,1H),2.68(s,3H),2.58(s,3H),1.46(s,3H),1.38(s,3H),1.27(d,J＝3.3Hz,3H),1.26(d,J＝3.2Hz,3H),0.86(s,9H),0.09(s,3H),0.08(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ172.75,161.20,157.60,154.57,150.50,147.64,144.75,143.16,142.07,138.71,134.92,132.47,131.08,129.38,129.29,128.13,128.11,127.67,127.34,124.27,123.79,122.39,121.89,66.02,65.14,59.10,56.23,38.93,25.80,22.58,18.04,17.20,14.86,14.71,13.87,13.17,-4.13,-4.85.HRMS(ESI)m/z calcd for C₄₄H₅₁BF₂N₄NaO₆Si(M+Na)⁺831.3537,found 831.3547.

實(shí)施例2(參見(jiàn)圖1)

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物4的制備方法為：

將實(shí)施例1制備的化合物3共57mg(0.07mmol)溶解于0.7毫升的N-甲基吡咯烷酮/N,N-二甲基甲酰胺中，N-甲基吡咯烷酮與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:3；

之后加入二氟化氫銨15.9mg(0.28mmol)，在室溫(25℃)下反應(yīng)36h；

反應(yīng)結(jié)束后加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng)體系，將乙酸乙酯相分別用水和飽和食鹽水洗，再用無(wú)水硫酸鈉干燥后濃縮；

將得到的混合物用石油醚與乙酸乙酯作為流動(dòng)相經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到化合物4共39.6毫克，產(chǎn)率為79％。

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

譜圖特征為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.22(d,J＝8.8Hz,2H),7.66(d,J＝8.8Hz,2H),7.54–7.48(m,3H),7.45(d,J＝16.8Hz,1H),7.29–7.26(m,2H),6.72(d,J＝16.7Hz,1H),6.05(s,1H),5.49(d,J＝13.8Hz,1H),5.23(d,J＝13.9Hz,1H),4.31–4.25(m,1H),4.23(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H),3.61–3.51(m,1H),3.28(dd,J＝6.7,2.5Hz,1H),2.66(s,3H),2.58(s,3H),1.44(s,3H),1.38(s,3H),1.28(s,3H),1.27(s,3H).

實(shí)施例3(參見(jiàn)圖1)

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其熒光探針(CVB-1)的制備方法為：

將實(shí)施例2得到的化合物4共13.9mg(0.02mmol)溶解于0.5毫升的四氫呋喃中，加入pH為6.0的0.35M磷酸鹽緩沖液(PB)0.3mL以及活化鋅粉26.2mg(0.02mmol)，在20℃下反應(yīng)1h；

將反應(yīng)液過(guò)濾，用色譜乙腈洗滌，用反相C18制備柱純化，冷凍干燥，得到黑紫色的化合物，即所述的熒光探針(CVB-1)。

所述熒光探針(CVB-1)的合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

譜圖特征為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.63(d,J＝16.9Hz,1H),7.50–7.44(m,2H),7.32–7.26(m,2H),6.46(d,J＝16.9Hz,1H),6.00(s,1H),4.30–4.19(m,1H),4.15(d,J＝8.9Hz,1H),3.47–3.37(m,1H),3.20(d,J＝4.7Hz,1H),2.70(s,3H),2.56(s,3H),1.42(s,3H),1.37(s,3H),1.33(d,J＝6.0Hz,3H),1.22(d,J＝7.1Hz,3H).HRMS(ESI)m/z calcd for C₃₁H₃₁BF₂N₃O₄(M-1)^-558.2376,found 558.2377.

用本發(fā)明的合成方法制備的熒光探針制成試紙、試劑盒或者檢測(cè)芯片可在生物、預(yù)防保健、臨床診斷各領(lǐng)域檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌中的進(jìn)行應(yīng)用。以下提供3個(gè)應(yīng)用實(shí)施例以對(duì)本發(fā)明所述的應(yīng)用進(jìn)行說(shuō)明。

應(yīng)用實(shí)施例1

本發(fā)明制備的熒光探針在檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌中的應(yīng)用，包括以下步驟：

(1)將本發(fā)明的耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針與待測(cè)樣品在一定條件下混合，形成具有光學(xué)性質(zhì)或顏色變化的化合物(參見(jiàn)圖2、3、4)。

從圖2可知：熒光探針CVB-1在IMP-1的作用下吸收發(fā)生明顯變化，最終產(chǎn)生典型的氟硼二吡咯的吸收譜圖。

從圖3可知：熒光探針CVB-1在IMP-1的作用下吸收發(fā)生明顯顏色變化，由紫色變?yōu)榉凵?/p>

從圖4可知：熒光探針CVB-1在碳青霉烯酶作用下吸收熒光顯著增強(qiáng)。

(2)測(cè)量具有光學(xué)性質(zhì)的化合物的光學(xué)信號(hào)變化或觀察熒光探針的顏色變化，從而確定待測(cè)樣品中碳青霉烯酶或者含有碳青霉烯耐藥菌的含量或濃度。

應(yīng)用實(shí)施例2

測(cè)試碳青霉烯酶為A類重組表達(dá)的碳青霉烯酶KPC-3；含有鋅離子的B類重組表達(dá)的碳青霉烯酶VIM-27、IMP-1、NDM-1；D類碳青霉烯酶OXA-48以及非碳青霉烯酶TEM-1、TEM-3、CTX-M-9。

測(cè)定熒光探針在β-內(nèi)酰胺酶作用下的熒光變化：

將檢測(cè)樣品(β-內(nèi)酰胺酶酶或耐藥菌)混在磷酸鹽緩沖液{1X PBS，pH＝7.4,0.1％表面活性劑〔CHAPS，3-[3-(膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸內(nèi)鹽〕}中置于酶標(biāo)微板內(nèi)，在室溫(25℃)下通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化，激發(fā)波長(zhǎng)為500nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm，監(jiān)測(cè)1h左右。

測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖5，不同β-內(nèi)酰胺酶(碳青霉烯酶VIM-27、IMP-1、KPC-3、NDM-1、OXA-48及非碳青霉烯酶TEM-1、TEM-3、CTX-M-9及沒(méi)有酶)與熒光探針混合培養(yǎng)1小時(shí)的熒光變化。從圖5可以看出：熒光探針CVB-1在低濃度的碳青霉烯酶(IM-27、IMP-1、KPC-3、NDM-1、OXA-48)的作用下即可發(fā)生明顯的熒光強(qiáng)度的變化，而在沒(méi)有酶或高濃度非碳青霉烯酶的作用下，熒光探針CVB-1的熒光強(qiáng)度并不發(fā)生明顯的變化；這一熒光強(qiáng)度變化與否的現(xiàn)象說(shuō)明：本發(fā)明制備的熒光探針CVB-1能用于檢測(cè)或區(qū)分碳青霉烯酶。

應(yīng)用實(shí)施例2只是檢測(cè)樣品的通用條件。需要指出的是：應(yīng)用實(shí)施例2中使用的檢測(cè)樣品(酶樣、菌樣、血液樣品、尿液樣品等)、各種試劑(緩沖體系、酶穩(wěn)定劑等)、檢測(cè)條件(酸堿度、溫度等)并不局限于上述待檢測(cè)樣品和通用條件。

應(yīng)用實(shí)施例3

本發(fā)明制備的熒光探針在檢測(cè)表達(dá)有重組碳青霉烯酶的大腸埃希菌和臨床菌中的應(yīng)用

將表達(dá)有不同β-內(nèi)酰胺酶的臨床大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)測(cè)量600nm處的吸光度得到相應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量并用CFU/mL(每毫升的菌落形成單位)進(jìn)行表示。對(duì)于每個(gè)用于研究的菌株按照1︰10的四個(gè)梯度進(jìn)行一系列的稀釋；將細(xì)菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在黑色的384孔板上進(jìn)行(總體積為15μL)。在所述384孔板上的每個(gè)孔內(nèi)同時(shí)加入5μL的梯度稀釋的細(xì)菌，然后加入10μL的7.5μM熒光探針CVB-1，將得到的待檢測(cè)樣品在25℃室溫下通過(guò)酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6——含不同重組β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌與熒光探針CVB-1混合培養(yǎng)2小時(shí)的熒光變化圖。圖7——含不同臨床耐藥菌(VIM-27、IMP-1、KPC-3、TEM-1)及野生大腸桿菌酶與熒光探針混合培養(yǎng)2小時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度圖。

在圖7中：

NDM-1-Kp為NDM-1克雷伯肺炎菌(ATCC BAA2146)。

VIM-1-Kp為VIM-1克雷伯肺炎菌(NCTC 13440)。

MDR-Ab為多耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌(ATCC BAA1605)。

OXA-48-Kp為OXA-48克雷伯肺炎菌(NCTC 13442)。

TEM-3-E.coli為TEM-3大腸桿菌(NCTC 13351)。

CTX-M-9-Ec為CTXM-9陰溝腸桿菌(NCTC 13464)。

SHV-18-Kp為SHV-18克雷伯肺炎菌(ATCC 700603)。

TEM-1-E.coli為EM-1大腸桿菌(ATCC 35218)。

E.coli為不含內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌(LMG194)。

從圖6、圖7可以看到：在直接熒光成像后，只有表達(dá)有碳青霉烯酶的臨床耐藥菌能對(duì)熒光探針CVB-1產(chǎn)生響應(yīng)，而且產(chǎn)生的熒光信號(hào)明顯。而對(duì)照組非碳青霉烯酶的臨床耐藥菌以及野生型大腸桿菌都不能對(duì)熒光探針CVB-1產(chǎn)生響應(yīng)，它們幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生。

應(yīng)用實(shí)施例1～3的結(jié)果證明：

本發(fā)明的耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針能夠應(yīng)用于對(duì)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌的檢測(cè)，可通過(guò)所述熒光探針在熒光強(qiáng)度或顏色變化與否的現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)或者區(qū)分碳青霉烯酶，進(jìn)而可快速檢測(cè)有碳青霉烯酶表達(dá)的致病耐藥菌，指導(dǎo)在醫(yī)療臨床上合理使用抗生素藥物。此外，本發(fā)明的耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針在生物、預(yù)防保健、臨床診斷各領(lǐng)域也具有潛在的、積極的應(yīng)用價(jià)值。