本發(fā)明提供了一種基于烯烴與臭氧反應(yīng)的熒光探針及其在檢測臭氧中的應(yīng)用。所述熒光探針的結(jié)構(gòu)為：

這類化合物用作檢測臭氧的熒光探針，其本身熒光在450nm左右，與臭氧作用后450nm左右熒光降低，同時(shí)由于臭氧化產(chǎn)物的生成560nm左右的熒光增強(qiáng)，且560nm處的熒光強(qiáng)度正比于臭氧的濃度，從而指示臭氧的存在或定量檢測臭氧的濃度。

背景技術(shù)：

臭氧是已知可利用最強(qiáng)的氧化劑之一。1840年德國化學(xué)家發(fā)明了這一技術(shù)，1856年被用于水處理消毒行業(yè)。目前，臭氧已廣泛用于水處理、空氣凈化、食品加工、醫(yī)療、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，對(duì)這些行業(yè)的發(fā)展起到了極大的推動(dòng)作用。在大氣中，臭氧主要存在于距地球表面20～35公里的臭氧層中，其主要作用是吸收太陽釋放出來的絕大部分紫外線，使動(dòng)植物免遭這種射線的危害。另一方面，環(huán)境中的臭氧具有一定毒性，吸入會(huì)刺激和損害眼睛、呼吸系統(tǒng)等黏膜組織，并可導(dǎo)致永久性心臟障礙?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，臭氧也存在于中性粒細(xì)胞的免疫響應(yīng)中，具有重要的生理和病理意義。

正是因?yàn)槌粞蹙哂腥绱酥匾囊饬x，對(duì)臭氧的檢測引起了人們廣泛的重視。碘量法、鄰聯(lián)甲胺法以及靛藍(lán)法是目前常用的檢測臭氧的方法。這些方法基于碘化鉀、鄰聯(lián)甲胺以及靛藍(lán)等物質(zhì)與臭氧之間的氧化還原反應(yīng)，通過測定生成 的有色物質(zhì)的吸收或直接比色而實(shí)現(xiàn)對(duì)臭氧的定性以及定量檢測。但是，由于上述物質(zhì)與臭氧的反應(yīng)不具有專一性，易受樣品中其他氧化劑的干擾，檢測結(jié)果往往與實(shí)際情況偏差較大。因此，開發(fā)新的、專一性的臭氧檢測方法勢(shì)在必行。

熒光探針是檢測活性小分子的有效手段之一?；陔p鍵臭氧化反應(yīng)，K.Koide等人發(fā)展了一種基于熒光素?zé)晒庾兓臒晒馓结?nature chemistry,2009,1,316-321)，H.Ma等人則發(fā)展了一種基于試鹵靈熒光變化的熒光探針(scitific reports,2013,3,2830)。雖然這些探針對(duì)臭氧具有很好的專一性，但由于臭氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，即3-取代丙醛的消除反應(yīng)較慢，所以這些探針用于檢測臭氧時(shí)其熒光變化比較緩慢(chemical communications,2015,51,1579-1582)，不適于臭氧的快速、實(shí)時(shí)檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述問題，提供了一種專一性好，并可以用于快速、實(shí)時(shí)響應(yīng)臭氧的熒光探針。這類化合物用作檢測臭氧的熒光探針，其本身熒光在450nm左右，與臭氧作用后450nm左右熒光降低，同時(shí)由于臭氧化產(chǎn)物的生成560nm左右的熒光增強(qiáng)，且560nm處的熒光強(qiáng)度正比于臭氧的濃度，從而指示臭氧的存在或定量檢測臭氧的濃度，尤其適用于臭氧的快速、實(shí)時(shí)檢測。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：采用1，8-萘二甲酰胺作為熒光母體，在其4-位引入4-丁烯-1-氧基取代基作為識(shí)別臭氧和誘導(dǎo)熒光變化的基團(tuán)。當(dāng)丁烯基雙鍵與臭氧反應(yīng)時(shí)，雙鍵被臭氧氧化為醛，進(jìn)一步發(fā)生β-消除生成熒光性物種，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)臭氧的檢測。由于1，8-萘二甲酰胺母體屬于強(qiáng)缺電子體系，對(duì)β-消除反應(yīng)生成的氧負(fù)離子具有很好的穩(wěn)定作用，所以消除反應(yīng)較文獻(xiàn)報(bào)道的探針更加容易，熒光變化更加快速，可實(shí)現(xiàn)臭氧的快速、實(shí)時(shí)檢測。

所述熒光探針的結(jié)構(gòu)如下：

具有結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物，其特征在于，R可以為氫原子，也可以為具有1-10個(gè)碳原子的取代基。

具有結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物，其特征在于，其合成包括以下步驟：

(1)利用4-溴-1，8-萘二甲酸酐與有機(jī)胺反應(yīng)制備相應(yīng)的4-溴-1，8-萘二甲酰胺；

(2)利用上述4-溴-1，8-萘二甲酰胺與4-丁烯-1-醇反應(yīng)制備權(quán)利要求1所述的熒光探針。

具有結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物其特征在于，其可以通過以下步驟合成：

(1)利用4-溴-1，8-萘二甲酸酐與4-丁烯-1-醇反應(yīng)制備4-丁烯氧基取代的1，8-萘二甲酸酐；

(2)利用上述步驟(1)的產(chǎn)物與有機(jī)胺反應(yīng)制備所述的熒光探針。

具有結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物，其特征在于，結(jié)構(gòu)Ⅰ所表示的化合物可用于臭氧的檢測。

具有結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物，其特征在于，將結(jié)構(gòu)Ⅰ表示的化合物用于臭氧檢測時(shí)，其是生成具有結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)II的化合物，從而導(dǎo)致熒光變化：

具有結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物，其特征在于，結(jié)構(gòu)Ⅰ表示的化合物可用于臭氧的定量檢測。

具有結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物，其特征在于，結(jié)構(gòu)Ⅰ表示的化合物與臭氧作用后，所生成的具有結(jié)構(gòu)II的化合物，其熒光強(qiáng)度正比于臭氧的濃度。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明所述的熒光探針用于臭氧檢測，具有專一性好，對(duì)臭氧響應(yīng)快速的優(yōu)點(diǎn)。專一性源于在液相或氣相體系中4-丁烯-1-氧基基團(tuán)識(shí)別臭氧并與臭氧反應(yīng)的選擇性；快的響應(yīng)速度則源于1，8-萘二甲酰胺母體的缺電子性質(zhì)及其對(duì)β-消除反應(yīng)的促進(jìn)作用。因?yàn)槌粞踉谂c雙鍵作用并將雙鍵氧化成醛后，只有接下來再發(fā)生醛的β-消除反應(yīng)才能誘導(dǎo)熒光變化。因此，本發(fā)明所述探針的優(yōu)勢(shì)是由于所述探針的特殊結(jié)構(gòu)決定的。由于臭氧本身是不穩(wěn)定的分子，對(duì)臭氧的快速檢測將有利于人們實(shí)時(shí)跟蹤待測對(duì)象中的臭氧濃度，在環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域都具有重要的意義。

附圖說明

圖1：本發(fā)明提供的熒光探針檢測臭氧的原理示意圖；

圖2(a)：本發(fā)明提供的探針在臭氧存在下熒光變化示意圖；

圖2(b)：本發(fā)明提供的探針用于臭氧定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3：本發(fā)明提供的探針對(duì)臭氧的選擇性示意圖；

圖4：本發(fā)明提供的探針響應(yīng)臭氧的動(dòng)力學(xué)示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。

實(shí)施例1，下述化合物的合成：

方法1：向反應(yīng)瓶內(nèi)加入28g 4-溴-1，8-萘二甲酸酐，2.4g氫化鈉，7.2g4-丁烯-1-醇以及150ml無水四氫呋喃，回流反應(yīng)2-3h后旋干，粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析(淋洗劑：石油醚/乙酸乙酯，體積比5/1)得白色固體18.6g。

取上述白色固體產(chǎn)品13.5g，正丁胺3.6g溶于60ml無水乙醇，加熱至回流，反應(yīng)6-7小時(shí)后旋干。粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析(淋洗劑：石油醚/乙酸乙酯，體積比5/1)得白色固體13.2g，即為具有結(jié)構(gòu)III的目標(biāo)產(chǎn)物。

方法2：取4-溴-1，8-萘二甲酸酐28g，正丁胺7.3g溶于60ml無水乙醇，加熱至回流，反應(yīng)6-7小時(shí)后旋干。粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析(淋洗劑石油醚/乙酸乙酯，5/1)得白色固體21.3g。

取上述白色固體產(chǎn)品16.5g，氫化鈉1.2g，4-丁烯-1-醇3.6g于100ml無水四氫呋喃中回流反應(yīng)2-3h，旋干，粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析(淋洗劑：石油醚/乙酸乙酯，體積比5/1)得白色固體12.8g，即為具有結(jié)構(gòu)III的目標(biāo)產(chǎn)物。

HNMR(CDCl3)：δ8.42-8.51(m,3H),7.60(t,1H),6.93(d,1H),5.91(m,1H),5.16(m,2H),4.24(t,2H),4.08(t,2H),2.66(q,2H),1.63(m,2H),1.37(m,2H),0.90(t,3H).MS calculated 323.15,Found 323.21

實(shí)施例2，具有結(jié)構(gòu)III的化合物對(duì)臭氧的響應(yīng)測試及其用于對(duì)臭氧的定量檢測

于10ml比色管中加入定容后終濃度10.0μM具有結(jié)構(gòu)III的化合物，再加入定容后終濃度20mM PBS、定容后pH 7.4，再加超純水到5ml，搖勻，然后通入不同濃度臭氧(終濃度分別為0，1，2，5，8，10，15，20，25，30，40，50μM)，最后用超純水定容到10ml。搖勻溶液，將工作液倒進(jìn)熒光皿測定熒光光譜。取臭氧濃度及相對(duì)應(yīng)的各熒光光譜最大值，輸入軟件OriginPro 8.0,得到線性工作曲線。

圖2(a)表示隨臭氧濃度的變化體系熒光強(qiáng)度及位移的變化，表明隨臭氧濃度的增加，體系在450nm左右熒光逐漸降低，同時(shí)在560nm左右熒光增強(qiáng)。圖2(b)表示560nm熒光強(qiáng)度隨臭氧濃度變化的線性擬合曲線，線性擬合曲線的線性回歸常數(shù)為0.9921，表明探針能定量的測定臭氧的濃度。

實(shí)施例3具有結(jié)構(gòu)III的化合物對(duì)臭氧的選擇性測試

于10ml比色管中加入10.0μM具有結(jié)構(gòu)III的化合物，再加入20mM PBS pH 7.4，再加超純水到5ml，搖勻，然后加入各種待測物(空白實(shí)驗(yàn)不加待測物)，最后用超純水定容到10ml。搖勻溶液，將工作液倒進(jìn)熒光皿測定熒光光譜。具有結(jié)構(gòu)III的化合物對(duì)臭氧的選擇性如圖3所示。圖3表明具有結(jié)構(gòu)III的化合物對(duì)臭氧具有很好的選擇性，560nm左右熒光變化明顯。測定條件下其他活性氧不能使560nm左右熒光增強(qiáng)。

實(shí)施例4，具有結(jié)構(gòu)III的化合物對(duì)臭氧響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測試

于10ml比色管中加入10.0μM具有結(jié)構(gòu)III的化合物，再加入20mM PBS pH 7.4，再加超純水到5ml，搖勻，然后通入臭氧，最后用超純水定容到10ml。搖勻溶液，將工作液倒進(jìn)熒光皿測定熒光光譜。每隔30s自動(dòng)讀取560nm處熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖4所示。圖4表明具有結(jié)構(gòu)III的化合物與臭氧作用后，熒光變化非常迅速，熒光強(qiáng)度可在1min內(nèi)達(dá)到最高點(diǎn)，表明具有結(jié)構(gòu)III的化合物用于臭氧的檢測具有響應(yīng)快速的特點(diǎn)。